母源性甲亢對仔鼠肝臟Caspase-3和Bcl-2表達(dá)的影響研究

劉志紅，魯 明，劉 靜，王 芳，王瑞英

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；2. 邢臺市人民醫(yī)院，河北 邢臺 054031)

隨著人們對優(yōu)生優(yōu)育認(rèn)識的加深，產(chǎn)前檢查越來越得到重視，隨之妊娠期甲狀腺疾病的檢出率增高。未治療的甲狀腺疾病會導(dǎo)致妊娠高血壓、妊娠相關(guān)心力衰竭、自發(fā)性流產(chǎn)、死產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長受限等[1-2]，且胎兒可能受到母體甲狀腺刺激抗體或抑制抗體的影響而發(fā)生甲狀腺功能異常[3]，因此對孕婦甲狀腺疾病的及時(shí)識別和充分管理至關(guān)重要。目前研究發(fā)現(xiàn)，新診斷的甲狀腺功能亢進(jìn)(簡稱甲亢)患者肝功能損傷的患病率在15%～76%[4]，引起甲亢患者肝臟異常的機(jī)制可能是代謝率增高導(dǎo)致的耗氧量增加，導(dǎo)致肝臟靜脈周圍區(qū)域相對缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[5]。目前對于母體甲亢時(shí)對子代肝臟損傷的影響研究報(bào)道較少，因此本研究觀察了母源性甲亢對不同生長發(fā)育期仔鼠甲狀腺功能及肝組織中Caspase-3、Bcl-2表達(dá)的影響，以明確母源性甲亢是否對仔鼠肝臟有影響，并探討其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年8周齡SD雌性大鼠36只，雄性大鼠18只，體重(200±10)g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號：1103121。大鼠飼養(yǎng)于室溫22～24 ℃、相對濕度 50%～70%環(huán)境下，每日12 h日光燈循環(huán)照明，自由飲食飲水。

1.2主要試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備 Caspase-3兔抗多克隆抗體、Bcl-2兔抗多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruze公司)，血清促甲狀腺激素(TSH)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)試劑盒(Siemens Healthcare公司)，左甲狀腺素鈉片(德國默克雪蘭諾公司)，蛋白濃度測定(BCA)試劑盒(上海申能博彩生物科技公司)，4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)，EBA12R型低溫離心機(jī)(德國Hettich公司)，DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(中國北京六一儀器廠)，GDS8000凝膠成像儀(美國UVP公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境飲食情況1周后，將雌鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量左甲狀腺素鈉組、高劑量左甲狀腺素鈉組各12只。低劑量左甲狀腺素鈉組給予左甲狀腺素鈉生理鹽水混懸液50 μg/100 g灌胃，高劑量左甲狀腺素鈉組給予左甲狀腺素鈉生理鹽水混懸液150 μg/100 g灌胃，對照組給予等劑量的生理鹽水灌胃，均1次/d，每3 d稱量體重1次，根據(jù)體重調(diào)節(jié)藥物量。低、高劑量左甲狀腺素鈉組發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)多食易激惹等甲亢癥狀時(shí)，采集尾靜脈血檢測大鼠甲狀腺功能，確定甲亢后，雌雄大鼠合籠(對照組合籠時(shí)間與給藥組相同)，次日發(fā)現(xiàn)陰栓為受孕，然后繼續(xù)灌胃至分娩。

1.4樣本獲取 分別取每組中出生當(dāng)天及出生21 d、60 d雌鼠所產(chǎn)雄性仔鼠各10只，禁食不禁水12 h后，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘取一側(cè)眼球取血(出生當(dāng)天小鼠血清太少，不取血)，3 000 r/min 快速離心10 min，取上清液，分裝冷凍保存待檢測；分離肝臟組織，分裝后存放于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5觀測指標(biāo)與方法

1.5.1血清甲狀腺功能指標(biāo) 取冷凍的血清4 ℃過夜，置于室溫融化后，參照試劑盒說明書，使用全自動(dòng)生化儀檢測血清FT3、FT4、TSH水平。

1.5.2肝組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測：取肝臟組織0.33 g，加入 520 μL蛋白裂解液中放入進(jìn)行勻漿(RIPA∶PMSF=100∶1)，時(shí)間為6 min，2 000 r/min離心，吸取上清液保存于EP管內(nèi)，-80 ℃儲存。采用改良Lowry法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，測樣品的蛋白濃度。行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加Caspase-3兔抗多克隆抗體(1∶700)、Bcl-2兔抗多克隆抗體(1∶500)，在室溫下放置30 min，然后4 ℃冰箱過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和抗小鼠IgG用PBS液分別稀釋到1∶15 000和1∶10 000，室溫孵育2 h，ECL顯影。用分析軟件分析每個(gè)條帶的吸光度值，以目的蛋白豐度/β-actin蛋白吸光度比值表示相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組仔鼠甲狀腺功能比較 低、高劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生21 d的血清FT3、 FT4水平均明顯高于對照組(P均<0.05)， TSH水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，且高劑量左甲狀腺素鈉組血清FT3、 FT4水平均明顯高于低劑量左甲狀腺素鈉組(P均<0.05)，TSH水平明顯低于低劑量左甲狀腺素鈉組(P<0.05)；高劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生60 d的血清FT3、 FT4水平均明顯高于對照組和低劑量左甲狀腺素鈉組(P均<0.05)， TSH水平均明顯低于對照組和低劑量左甲狀腺素鈉組(P均<0.05)，低劑量左甲狀腺素鈉組各指標(biāo)和對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組仔鼠出生后各時(shí)間點(diǎn)甲狀腺功能比較

2.2各組仔鼠肝臟組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 低劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生21 d的Caspase-3蛋白相對表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯低于對照組(P<0.05)；高劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生當(dāng)天、21 d、60 d的Caspase-3蛋白相對表達(dá)量均明顯高于同期對照組和低劑量左甲狀腺素鈉組(P均<0.05)，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均明顯低于同期對照組和低劑量左甲狀腺素鈉組(P均<0.05)。見表2及圖1。

表2 各組仔鼠出生后各時(shí)間點(diǎn)肝臟組織中Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

正常人機(jī)體內(nèi)甲狀腺激素維持著人體正常生長發(fā)育、代謝、體溫調(diào)節(jié)等[6-7]，而甲亢患者甲狀腺激素分泌異常，可以引發(fā)骨質(zhì)疏松、心力衰竭、肝損傷等并發(fā)癥[8-10]。甲亢患者肝損傷的發(fā)生一方面可能由肝臟需降解過多的甲狀腺素導(dǎo)致負(fù)荷增加，對肝臟產(chǎn)生毒性作用引起，另一方面可能為甲亢時(shí)肝臟各種代謝活躍，自由基生成增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[11]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，甲亢時(shí)肝臟細(xì)胞凋亡增加，這與脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的細(xì)胞膜損傷有關(guān)[12-13]。

A為對照組出生當(dāng)天；B為對照組出生60 d；C為對照組出生21 d；D為低劑量左甲狀腺素鈉組出生當(dāng)天；E為低劑量左甲狀腺素鈉組出生60 d；F為低劑量左甲狀腺素鈉組出生21 d；G為高劑量左甲狀腺素鈉組出生當(dāng)天；H為高劑量左甲狀腺素鈉組出生60 d；I為高劑量左甲狀腺素鈉組出生21 d

在多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育、存活以及死亡等過程中，都伴隨著細(xì)胞凋亡的過程[14]。Caspase是天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，是哺乳動(dòng)物凋亡機(jī)制中的關(guān)鍵因素，能夠激活凋亡信號通路，使細(xì)胞皺縮，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。Caspase-3處于蛋白酶級聯(lián)切割過程中的核心位置，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者[16]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的另一重要組成部分，在Bcl-2家族內(nèi)，最明星的兩個(gè)分子是Bcl-2分子和Bax分子[17]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax高表達(dá)時(shí)，細(xì)胞對死亡信號敏感，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡；當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時(shí)，Bcl-2可以和Bax形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2表達(dá)量增加可引起從線粒體釋放的凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素C減少，進(jìn)一步抑制Caspase-3的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[18]。

在妊娠早期，母體甲狀腺激素可通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)至胎兒，因此胎兒甲狀腺功能受母體甲狀腺功能的影響[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低、高劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生21 d的血清FT3、FT4水平均明顯升高，TSH水平均明顯降低；低劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生60 d時(shí)甲狀腺功能各指標(biāo)接近正常，但高劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠各指標(biāo)仍明顯異常。低劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生21 d的Caspase-3蛋白相對表達(dá)量均明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量明顯降低，出生當(dāng)天和出生60 d與對照組接近；高劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠出生當(dāng)天、21 d、60 d的Caspase-3蛋白相對表達(dá)量均明顯高于同期對照組和低劑量左甲狀腺素鈉組，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均明顯低于同期對照組和低劑量左甲狀腺素鈉組。出現(xiàn)這種變化，筆者認(rèn)為可能是出生當(dāng)天低劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠自身甲狀腺功能可能受母體影響較高劑量左甲狀腺素鈉組輕，所以肝臟細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)異常不明顯；出生21 d時(shí)，隨著過量甲狀腺激素在體內(nèi)作用，低、高劑量左甲狀腺素鈉組仔鼠自身甲狀腺功能明顯異常，均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)異常；出生60 d時(shí)，隨著下丘腦-垂體-甲狀腺軸的自身調(diào)節(jié)作用，低劑量左甲狀腺素鈉組甲狀腺激素水平和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)逐漸恢復(fù)正常,而高劑量左甲狀腺素鈉組因甲狀腺異常嚴(yán)重已無法自我恢復(fù)，故細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)仍異常，會促進(jìn)肝臟細(xì)胞凋亡。

綜上所述，母源性甲亢對仔鼠甲狀腺功能和肝臟中細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)有明顯影響，其中低劑量左甲狀腺素鈉造成的母體甲亢對后代甲狀腺功能的影響較輕微，隨著仔鼠的生長發(fā)育，自身免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)逐漸完善，甲狀腺功能和肝細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)可恢復(fù)正常；但重度甲亢母鼠對仔鼠甲狀腺功能、肝臟的影響較為嚴(yán)重，且這種影響隨著后代的生長發(fā)育改善不明顯。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。