理沖生髓飲有效組分調(diào)控炎性因子對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移影響的研究

郭 瀅,劉逸超,左冬冬,韓鳳娟

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動站，黑龍江 哈爾濱 150040； 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，致死率高。由于卵巢癌早期缺乏典型癥狀，且轉(zhuǎn)移快，易產(chǎn)生耐藥性，這些特點使其成為卵巢癌致死率高的重要原因[1-2]。19世紀(jì)德國病理學(xué)家提出腫瘤起源于慢性炎癥這一假說，炎性因子的上調(diào)能夠激活轉(zhuǎn)移通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[3]。此外，腫瘤細(xì)胞的特異性、免疫細(xì)胞之間的動態(tài)聯(lián)系均影響腫瘤的發(fā)展，也是當(dāng)前研究的靶點。前期研究顯示中藥復(fù)方理沖生髓飲一方面能夠減輕卵巢癌患者臨床放化療后的毒副作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；另一方面能通過影響基因靶點信號通路等對SKOV3細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用[4-6]。本實驗主要通過觀察卵巢癌微環(huán)境中炎性因子的改變，進(jìn)一步探討理沖生髓飲有效組分對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)炎性調(diào)控機(jī)制，為理沖生髓飲治療卵巢癌提供新的靶點、研究思路以及理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1細(xì)胞 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，購于齊氏生物科技有限公司。

1.2藥物 理沖生髓飲組方：人參、黃芪、鹿角霜、仙靈脾、水蛭、浙貝母、莪術(shù)、三棱，各藥材購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診藥劑科。貝伐單抗(瑞士羅氏制藥公司)。

1.3試劑及儀器 PRMI-1640(HyClone)，胎牛血清(HyClone)，二甲基亞砜(DMSO，上?；鄯f生物技術(shù)有限公司)，超凈工作臺(Hettich)，CO2培養(yǎng)箱(Heal Force)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)，酶標(biāo)分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)檢測試劑盒[愛必信(上海)生物科技有限公司]。

1.4含藥血清制備 取32只健康SPF級雄性大鼠，4～5周齡，體重(200±20)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，動物合格證號：230731211100000984。置籠中自由飲食喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、生髓飲低劑量組、生髓飲中劑量組和生髓飲高劑量組，每組8只。生髓飲低、中、高劑量組分別給予3.76 g/(kg·d)、7.52 g/(kg·d)、11.28 g/(kg·d)理沖生髓飲灌胃，空白組給予同體積蒸餾水灌胃，均2次/d，連續(xù)7 d。末次灌胃結(jié)束2 h后眼眶取血，于室溫下靜置30 min，離心獲取血清，無菌條件下過濾2次，56 ℃恒溫水浴鍋滅活30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過除菌，分裝于1 mL/支的凍存管內(nèi)，保存至-20 ℃冰箱，以備后續(xù)實驗使用。

1.5檢測指標(biāo)和方法

1.5.1雞胚絨毛尿囊膜血管生成情況 選擇重量(65±10)g、蛋殼無破損的新鮮種蛋60枚，將其隨機(jī)分為空白組、生髓飲低劑量含藥血清組、生髓飲中劑量含藥血清組、生髓飲高劑量含藥血清組和貝伐單抗組，每組12枚。放置在(38±0.5)℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制備雞胚絨毛尿囊膜模型，在相對濕度65%～70%環(huán)境中孵育，每日早晚各翻轉(zhuǎn)1次，第3天起于檢卵燈下觀察種蛋發(fā)育情況，取第7天發(fā)育的雞胚，置于檢卵燈下畫出氣室和胚頭位置，在胚頭右下方的0.5～1.0 cm處，劃定直徑約1.5 cm的開窗位置；用砂輪在蛋殼表面小心磨劃出直徑1.5 cm的凹痕，用眼科鑷輕輕揭除開窗處卵殼及白色卵殼膜，暴露出雞胚絨毛尿囊膜。通過顯微鏡觀察以微孔濾膜載體為中心發(fā)出的血管(包括毛細(xì)血管、小動脈、小靜脈在內(nèi)的凡屬趨向性生長的血管)，將血管主干評價為一級血管，從主干分支出來的血管評價為二級血管，分別計數(shù)，取平均值。

1.5.2MTT法檢測SKOV3細(xì)胞增殖情況 選取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人卵巢癌SKOV3細(xì)胞，分為空白組、生髓飲低劑量含藥血清組、生髓飲中劑量含藥血清組、生髓飲高劑量含藥血清組和貝伐單抗組，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106個/L，接種至24孔板，空白組外加入生理鹽水培養(yǎng)，生髓飲各組分別加入相應(yīng)濃度的理沖生髓飲含藥血清及5 mg/L貝伐單抗培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24 h、48 h后固定，染色，在熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個清晰視野統(tǒng)計凋亡細(xì)胞數(shù)目及總細(xì)胞數(shù)目，計算凋亡率(抑制率)= 視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞內(nèi)視野總數(shù)×100% 。

1.5.3劃痕實驗(遷移實驗)檢測SKOV3細(xì)胞遷移情況 實驗分組同“1.5.2”，每組3個復(fù)孔，每孔給予相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，將處理后的SKOV3細(xì)胞接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個板底后，用200 μL槍頭的移液槍在板面上橫線劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察劃痕修復(fù)情況，拍照對比,結(jié)果計算公式：傷口愈合率(%)=(A-B)/A×100%，A為起始時間的劃痕寬度，B為觀察時的劃痕寬度。

1.5.4Transwell小室實驗檢測SKOV3細(xì)胞侵襲情況 實驗分組同“1.5.2”，各組給予相應(yīng)培養(yǎng)24 h ，應(yīng)用0.25%胰酶常規(guī)消化細(xì)胞，終止消化后將其離心，棄去上清液，加入無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，密切觀察卵巢癌SKOV3細(xì)胞生長程度，當(dāng)計數(shù)為5×104個細(xì)胞時，接種在 Transwell小室的上室，將上室加入200 μL的無血清培養(yǎng)基，下室加入500 μL含 10%FBS 的培養(yǎng)基，隨后Transwell小室輕輕置于24孔板中，收集培養(yǎng)處理后的SKOV3細(xì)胞，配制成1×105個/mL的單細(xì)胞懸液，鋪板于Transwell小室內(nèi)，培養(yǎng)24 h，PBS淋洗后，用棉簽輕柔擦去上層未穿膜的細(xì)胞和角質(zhì)膠，固定，染色，在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個高倍鏡，記錄每個視野的平均穿膜細(xì)胞數(shù),采用平均計數(shù)法對比每個高倍鏡下細(xì)胞數(shù)量作為對比。

1.5.5SKOV3細(xì)胞上清液中炎性因子水平檢測 實驗分組同“1.5.2”，各組給予相應(yīng)培養(yǎng)24 h后，棄去孔內(nèi)上清液， 采用ELISA試劑盒，按照說明書操作檢測VEGF、MMP-9、IL-6 、IL-1 、TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1雞胚絨毛尿囊膜血管生成情況 解剖顯微鏡下觀察，空白組血管形成正常，呈葉脈樣、放射狀生長，脈絡(luò)清晰，主血管管徑粗壯，長勢旺盛，且建立側(cè)支循環(huán)；生髓飲各含藥血清組及貝伐單抗組血管受損變細(xì)，新生血管受抑制，甚至血管分支多處斷裂或完全消失，一級和二級血管數(shù)目均明顯少于空白組(P均<0. 05)，且生髓飲中劑量含藥血清組和貝伐單抗組均明顯少于生髓飲低、高劑量含藥血清組(P均<0. 05)。見圖1及表1。

表1 各組雞胚絨毛尿囊膜新生血管數(shù)比較條)

圖1 解剖顯微鏡下各組雞胚絨毛尿囊膜血管生成情況

2.2SKOV3細(xì)胞增殖抑制率 培養(yǎng)24 h、48 h后，生髓飲中、高劑量含藥血清組SKOV3細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于生髓飲低劑量含藥血清組(P均<0.05),生髓飲低、中劑量含藥血清組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組培養(yǎng)24 h、48 h后SKOV3細(xì)胞增殖抑制率比較

2.3SKOV3細(xì)胞遷移及侵襲轉(zhuǎn)移情況 作用24 h后，空白組的劃痕幾乎完全愈合，生髓飲高劑量含藥血清組和貝伐單抗組的細(xì)胞劃痕愈合速度減慢，見圖2；Transwell小室結(jié)果顯示空白組SKOV3細(xì)胞被染色面積大，遷移細(xì)胞數(shù)目顯著增多，生髓飲各含藥血清組和貝伐單抗組SKOV3細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)目明顯減少，見圖3。與空白組比較，生髓飲各含藥血清組及貝伐單抗組 SKOV3細(xì)胞遷移率和侵襲率均顯著降低，且生髓飲中、高劑量含藥血清組和貝伐單抗組均顯著低于生髓飲低劑量含藥血清組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 各組SKOV3細(xì)胞遷移及侵襲情況比較

圖2 劃痕實驗各組SKOV3細(xì)胞遷移情況

圖3 Transwell小室實驗各組SKOV3細(xì)胞侵襲情況

2.4SKOV3細(xì)胞中相關(guān)因子表達(dá)情況 生髓飲各含藥血清組及貝伐單抗組VEGF、IL-6 、TNF-α水平及生髓飲高劑量含藥血清組、貝伐單抗組IL-1水平均明顯低于空白組(P均<0.05) ；生髓飲高劑量含藥血清組和貝伐單抗組VEGF、IL-6 、TNF-α水平均明顯低于生髓飲中、低劑量含藥血清組(P均<0.05)，生髓飲高劑量含藥血清組VEGF、IL-1、TNF-α水平與貝伐單抗組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，各組MMP-9水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 各組SKOV3細(xì)胞上清液中VEGF、MMP-9、IL-6 、IL-1 、TNF-α水平

3 討 論

目前卵巢癌的發(fā)病病因尚不明確，比較公認(rèn)的有遺傳因素、環(huán)境因素、飲食因素等。卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后不良的主要因素之一，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程?，F(xiàn)代研究顯示，腫瘤可通過多途徑誘導(dǎo)新生血管生成，其中VEGF能夠影響腫瘤細(xì)胞的侵襲，為其轉(zhuǎn)移建立通道，并抑制免疫細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致T細(xì)胞敏感性減弱，誘導(dǎo)T細(xì)胞死亡，免疫機(jī)制失衡，最終導(dǎo)致卵巢癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。

卵巢癌病灶處于盆底最深處，其內(nèi)部形成了一個由多種促炎因子和化學(xué)因子構(gòu)成的微環(huán)境。現(xiàn)代研究顯示，炎性微環(huán)境以及炎性因子的刺激能夠?qū)е侣殉舶┑陌l(fā)生以及發(fā)展[8]；經(jīng)輸卵管逆行的子宮內(nèi)膜能夠在卵巢周圍形成炎性微環(huán)境，這可能與卵巢癌的發(fā)生關(guān)系密切[9-10]。免疫機(jī)制和腫瘤的關(guān)系是近幾年的研究熱點，炎癥介質(zhì)和免疫細(xì)胞產(chǎn)生的相關(guān)因子TNF-α、IL-1β等與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。TNF-α、IL-1β的釋放會導(dǎo)致不同細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，進(jìn)一步增強(qiáng)炎性反應(yīng)，在局部產(chǎn)生更多的免疫細(xì)胞，提高局部組織的侵襲能力和血管生成能力，加速腫瘤的進(jìn)展[12-13]。課題組前期研究過程中發(fā)現(xiàn)，相關(guān)炎性因子能夠?qū)е侣殉舶┑那忠u和轉(zhuǎn)移，故本實驗重點探討了炎性因子對卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

對于腫瘤的治療，不能局限于增殖的腫瘤細(xì)胞，整體治療會取得更好的療效，這與中醫(yī)藥的整體治療觀不謀而合。理沖生髓飲組方是以“溫煦腎陽，搜剔胞絡(luò)瘀滯”為理論依據(jù)，在經(jīng)方“理沖湯”的基礎(chǔ)上進(jìn)行加減而成。溫煦腎陽能夠使人體的全身陽氣充沛，增強(qiáng)機(jī)體搜剔胞絡(luò)瘀滯之力，達(dá)到活血化瘀消癥的目的。卵巢癌的發(fā)病主要由陽氣主導(dǎo)，機(jī)體腎陽虛，命門火衰，陰寒內(nèi)盛，沖任不得腎陽溫煦，胞宮亦不得煦，虛寒內(nèi)生，而致寒凝血滯，日久聚生癥瘕，結(jié)于生殖之所，終致本病。鑒于此，組方理沖生髓飲，以補(bǔ)虛消瘀。

本研究結(jié)果顯示，雞胚絨毛尿囊膜實驗發(fā)現(xiàn)生髓飲各含藥血清組血管受損變細(xì)，新生血管受抑制，甚至血管分支多處斷裂或完全消失，說明理沖生髓飲能夠抑制新生血管；劃痕實驗和小室侵襲實驗顯示生髓飲各含藥血清組卵巢癌細(xì)胞侵襲速度變慢，轉(zhuǎn)移的卵巢癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說明理沖生髓飲能夠抑制巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移；生髓飲各含藥血清組VEGF、IL-6 、TNF-α水平及生髓飲高劑量含藥血清組IL-1水平均明顯降低，說明理沖生髓飲能夠抑制卵巢癌的血管生成，能夠調(diào)控TNF-α、IL-6等炎性因子水平，抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，腫瘤炎性微環(huán)境貫穿于疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，理沖生髓飲有效組分可能通過抑制相關(guān)炎性因子的表達(dá)、影響腫瘤周圍的炎性微環(huán)境而抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，為靶向治療腫瘤奠定了新的理論基礎(chǔ)，為今后研究理沖生髓飲對卵巢癌的抑制作用提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。