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    癌痛消方對(duì)缺氧肝癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響

    2021-11-11 11:53:32黃覃鳳張永琴梁麗英楊繼峰韋艾凌
    廣西中醫(yī)藥 2021年5期
    關(guān)鍵詞:擬態(tài)癌痛批號(hào)

    黃覃鳳,張永琴,梁麗英,楊繼峰,韋艾凌

    (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西南寧530023;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西南寧530200)

    肝癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2020年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)公布的癌癥數(shù)據(jù)顯示,肝癌患者病例數(shù)的增長(zhǎng)最為迅速,在2006年至2017年期間每年以2%~3%的速度增加[1]。與此同時(shí),肝癌也是導(dǎo)致癌癥死亡的第三大原因[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中存在血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM),具有VM形成的肝癌較容易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移,惡性程度高且預(yù)后較差。肝癌對(duì)人類的生命產(chǎn)生極大威脅,如何有效阻斷腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移是提高肝癌診治水平的關(guān)鍵。本課題組長(zhǎng)期致力于肝癌的中西醫(yī)結(jié)合防治研究,在國(guó)內(nèi)首次提出肝癌“瘀”“毒”“虛”新病機(jī)理論假說(shuō),并據(jù)此研制出癌痛消方應(yīng)用于臨床防治原發(fā)性肝癌,療效顯著[3]。

    癌痛消方由白花蛇舌草、解毒草、煅牡蠣、延胡索、香附、三棱、黨參、半枝蓮、黃芪、莪術(shù)等組成,具有清熱解毒、化瘀散結(jié)、健脾益氣、行氣止痛之功效。本實(shí)驗(yàn)采用二氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2缺氧模型,觀察癌痛消方含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞VM成管能力的影響,采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)VM形成相關(guān)因子的表達(dá)水平,探討癌痛消方拮抗肝癌的作用機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株HepG2(由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供)。

    1.2 動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠,雄性,體質(zhì)量250~300 g,由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物生產(chǎn)/使用許可證號(hào):SCXK(湘)2014-0011。動(dòng)物均飼養(yǎng)于室內(nèi)溫度(20~25℃)、相對(duì)濕度為55%~70%的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

    1.3 藥物癌痛消方由白花蛇舌草20 g、解毒草20 g、三棱10 g、半枝蓮15 g、煅牡蠣30 g、香附10 g、黨參10 g、黃芪20 g、絞股藍(lán)12 g、莪術(shù)10 g、延胡索20 g、炙甘草10 g組成,制劑由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)中心配制,為癌痛消方的飽和溶液,濃度為1 g/ml(用藥劑量按人與動(dòng)物體質(zhì)量換算)。

    1.4 試劑胎牛血清(美國(guó)Gibco公司,批號(hào):25200-056);RPMI 1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司,批號(hào):SV30010);CoCl2(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):G7021);兔抗HIF-1α多克隆抗體(美國(guó)Proteintech公司,批號(hào):20960-1-AP);兔抗VEGF多克隆抗體(美國(guó)Protein?tech公司,批號(hào):19003-1-AP);兔抗EphA2單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司,批號(hào):6997S);兔VE-cadherin單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Tech?nology公司,批號(hào):2500S);鼠抗β-actin單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號(hào):TA-09)。

    1.5 儀器DMI6000B型倒置熒光顯微鏡(德國(guó),Lei?ca公司);Forma 370二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);Mini-PROTEAN蛋白垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司);Amersham Imager 600多功能成像儀(美國(guó)GE公司)。

    2 方法

    2.1 含藥血清的制備將SD大鼠隨機(jī)分成4組,每組6只。癌痛消方高、中、低劑量組分別按臨床劑量等效量的2倍、1倍、0.5倍(即10.8 g/kg、5.4 g/kg、2.7 g/kg)灌胃給藥,正常組予蒸餾水灌胃,每日2次,連續(xù)灌胃7 d,末次給藥后2 h,以相同的劑量重復(fù)給藥1次,1 h后以戊巴比妥麻醉,75%酒精消毒,腹主動(dòng)脈取血,常溫中靜置2 h后3 000 r/min離心20 min,合并所得同組動(dòng)物血清,使用0.22 μm濾器過(guò)濾后即為癌痛消方含藥血清,經(jīng)56℃、30 min水浴的滅活操作后,置于-80℃冰箱,保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HepG2接種于含10%胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至單層后更換為含150μmol/L CoCl2的完全培養(yǎng)液,再培養(yǎng)24 h。

    2.3 血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)觀察將基質(zhì)膠(Matrigel)按每孔200 μl加入24孔板備用。培養(yǎng)HepG2至70%~80%融合,胰酶消化。加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,調(diào)整HepG2細(xì)胞濃度為1×105cell/ml,每孔取0.8 ml。加入不同濃度的癌痛消方含藥血清,置于37℃和5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倒置熒光顯微鏡下觀察VM成管情況,拍照并獲取圖像。計(jì)算細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率,即一個(gè)視野里具有血管生成擬態(tài)功能細(xì)胞與所有細(xì)胞的百分比。

    2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)收集細(xì)胞,滴加RIPA裂解液,裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞的總蛋白;BCA法檢測(cè)總蛋白的濃度,滴加SDS-PAGE上樣緩沖液,經(jīng)10 min沸水浴后,按照50 μg的上樣量置于PAGE凝膠電泳分離目的蛋白。電泳結(jié)束后使用半干法(25 V恒壓45 min)將所得蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,再使用脫脂乳在室溫中封閉1 h。分別加入稀釋后的HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin抗體,4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌PVDF膜3次,每次5 min,隨后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP)的山羊抗兔IgG抗體,37℃中孵育1 h。TBST洗滌3次后再使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影,拍照保存結(jié)果。使用Image J軟件計(jì)算各目的條帶和內(nèi)參β-actin的灰度值,以所得兩者的灰度值比值作為蛋白表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,取平均值。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間差異采用方差分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 癌痛消方對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響見圖1、圖2、表1。與正常組比較,癌痛消方各劑量組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率均明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),說(shuō)明癌痛消方各劑量組均可抑制肝癌VM的形成。

    表1 各組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率比較(±s)

    表1 各組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率比較(±s)

    注:與正常組比較,①P<0.05,②P<0.01

    圖1 各組肝癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)顯微結(jié)構(gòu)(×40)

    圖2 各組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率比較

    3.2 癌痛消方對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞中VM形成相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響見圖3、圖4、表2。與正常組比較,癌痛消方各劑量組HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)水平明顯下降,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。

    圖3 Western blot檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin蛋白的表達(dá)圖

    圖4 各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白的表達(dá)水平

    表2 各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)水平比較 (±s)

    表2 各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)水平比較 (±s)

    注:與正常組比較,①P<0.05,②P<0.01

    4 討論

    肝癌為典型的富血管惡性腫瘤,高密度的血管形成不但是肝癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的誘因,而且還是肝癌組織營(yíng)養(yǎng)供給的主要途徑。VM作為不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的管道,肝癌的組織可經(jīng)過(guò)這些血管和宿主的管道相連接,從而為肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲提供豐富的血供。腫瘤的快速增長(zhǎng)及血供量不足會(huì)導(dǎo)致微環(huán)境中出現(xiàn)缺氧,然而缺氧并未能阻止腫瘤的惡性增長(zhǎng)。缺氧狀態(tài)的短暫或是持久都可增加惡性腫瘤預(yù)后不佳的風(fēng)險(xiǎn),即通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)腫瘤細(xì)胞通路、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)和維持腫瘤干細(xì)胞形成,從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,同時(shí)還可以增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性,促進(jìn)血管生成和VM[4]。劉文斌等[5]研究結(jié)果顯示,無(wú)論是常氧或缺氧狀態(tài),肝癌細(xì)胞均能形成VM管道,但缺氧組的肝癌細(xì)胞所形成的管道長(zhǎng)度明顯比常氧組的長(zhǎng),這說(shuō)明缺氧微環(huán)境有利于肝癌VM的形成;同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn),在缺氧微環(huán)境下,伴隨VM管道的生成,缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-in-ducible factor,HIF-1α)可在缺氧條件下被明顯上調(diào)。HIF-1α作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可以上調(diào)其下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularen?dothelial growth factor,VEGF)的轉(zhuǎn)錄[6],從而促進(jìn)VM網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的形成[7]。VEGF還可以通過(guò)提高腫瘤血管的通透性,促使外滲的血漿蛋白增多,從而為VM的形成及新生血管生成提供暫時(shí)性基質(zhì)。此外,VEGF還能促進(jìn)促紅素人肝細(xì)胞受體酪氨酸激酶A2(Ephreceptor tyrosine kinase-type A2,EphA2)和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-cadherin)的表達(dá),從而促進(jìn)VM的形成[8]。

    肝癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”的范疇,中醫(yī)藥治療肝癌有著悠久的歷史,且療效顯著。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí),臨床經(jīng)驗(yàn)方在治療肝癌方面可改善患者的生活質(zhì)量,延長(zhǎng)生存時(shí)間,減毒增效,增強(qiáng)患者免疫力,緩解射頻消融術(shù)后常見的不良反應(yīng)等[9-10]。本課題組提出的肝癌“瘀”“虛”“毒”新病機(jī)理論假說(shuō)認(rèn)為:癌毒是致病的始動(dòng)因素,毒濕結(jié)聚、氣血運(yùn)行不通是肝癌的發(fā)病基礎(chǔ),濕、瘀、熱為病理產(chǎn)物,虛既為病之因也為病之進(jìn)。癌痛消方正是基于此病因病機(jī),在《醫(yī)林改錯(cuò)》的“膈下逐瘀湯”中加入臨床經(jīng)驗(yàn)用藥而形成的方劑。前期研究表明,該方治療肝癌及其術(shù)后復(fù)發(fā)者臨床療效確切,無(wú)明顯毒副作用[11],且可抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促使其凋亡[12],抗腫瘤血管新生[13]。

    本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),癌痛消方可明顯抑制肝癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成,能降低肝癌血管生成擬態(tài)相關(guān)因子HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平。本研究結(jié)果可為癌痛消方抗肝癌的臨床應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。

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