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    蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠血腦屏障通透性及緊密連接蛋白的影響

    2021-11-11 11:53:26王蔚杜淵鐘霞王洪連孫長偵沈宏萍王麗楊思進
    廣西中醫(yī)藥 2021年5期
    關鍵詞:舒地爾通透性腦組織

    王蔚,杜淵,鐘霞,王洪連,孫長偵,沈宏萍,王麗,楊思進

    (西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院,四川瀘州646000)

    腦出血的發(fā)病率高,約占我國急性腦血管病的30%,急性期的病死率達到30%~40%,患病后致殘率高,對人類健康造成了嚴重危害[1]。腦出血發(fā)生后諸多因素會導致腦組織繼發(fā)性損傷,腦水腫的形成是該疾病發(fā)展過程中的關鍵環(huán)節(jié),其中血腦屏障結構破壞,通透性增加又是腦水腫形成的主要因素之一。緊密連接蛋白中閉鎖小帶蛋白(ZO-1)、咬合蛋白(Oc?cludin)、閉合蛋白-5(Claudin-5)、連接黏附分子-1(JAM-1)與血腦屏障的結構及通透性密切相關。蛭龍活血通瘀膠囊是西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院研制的院內制劑,前期應用于腦出血患者的治療取得了良好療效[2]。動物實驗亦證實,該藥能有效改善腦出血大鼠腦組織水腫[3]。本研究在前期實驗的基礎上,以自體血注入法復制腦出血動物模型,觀察蛭龍活血通瘀膠囊對腦出血大鼠血腦屏障通透性以及腦組織緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5、JAM-1表達的影響,進一步研究蛭龍活血通瘀膠囊防治腦出血的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 動物SPF級SD大鼠108只,雄性,體質量(280±20)g,購于成都達碩實驗動物有限公司,動物使用許可證:SYXK(川)2018-065。由西南醫(yī)科大學實驗動物研究中心飼養(yǎng),環(huán)境溫度(22±2)℃,濕度30%~40%,投以普通大鼠飼料,自由攝食及飲水。

    1.2 藥物及儀器蛭龍活血通瘀膠囊由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供,批準文號:川藥字Z20070528;規(guī)格:每粒0.4 g;批號:20180216。鹽酸法舒地爾注射液為成都菀東藥業(yè)有限公司產品,規(guī)格:每支2 ml∶30 mg;批號:180101。兔抗ZO-1多克隆抗體(Thermo Fisher);兔抗Occludin多克隆抗體(Gene Tex);兔抗Claudin-5多克隆抗體(Absin);兔抗JAM-1多克隆抗體(Novus);逆轉錄試劑盒(Thermo scientific);大鼠腦立體定位儀(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);BY-400C低速離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司);SLFAD自動酶標儀(美國伯騰儀器有限公司);Thermo 991型-80℃超低溫冰箱(美國賽默飛世爾);IMS-40全自動雪花制冰機(常熟雪珂電器有限責任公司);KJ201-BS型震蕩器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司);DYY-10C電泳儀(北京六一儀器廠);Chemi?Doc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad);BMZ-3自動組織包埋機(湖北安立信醫(yī)療實業(yè)有限公司);Leica石蠟切片機(北京科譽興業(yè)科技發(fā)展有限公司);cx21FS1光學顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司);Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀(瑞士Roche)。

    1.3 造模及模型評估大鼠稱重后以400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉,距尾尖0.5 cm處剪斷鼠尾,取血50 μl備用。用腦立體定位儀以大鼠俯臥位固定鼠頭,常規(guī)備皮及消毒后,沿頭皮正中縱向切開約10 mm,用30%雙氧水腐蝕骨膜使前囟及冠狀縫充分暴露,調節(jié)定位儀X、Y軸坐標以定位尾殼核區(qū)域,使針尖垂直于矢狀縫右側3.0 mm、前囟前0.2 mm處,用三棱針在針尖下鉆開顱骨,以顱骨外板為零點調節(jié)定位儀Z軸,進針深度為6.0 mm,以5μl/min勻速將血緩慢注入,留針約15 min后緩慢退針,用骨蠟將鉆孔封閉,術后頭皮常規(guī)縫合消毒[4-5]。假手術組大鼠只進針不注血。術后按照“5分制法”對大鼠進行神經功能評分[6],評分為1~3分則認為造模成功,可納入實驗。

    1.4 分組及給藥實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、腦出血模型組、鹽酸法舒地爾組、蛭龍活血通瘀組,每組27只。各組又劃分為12 h、48 h、3 d、7 d 4個亞組,其中3 d組動物數(shù)為9只,其余3個亞組的動物數(shù)為6只。蛭龍活血通瘀組每日按1.2 g/kg灌胃給藥,灌胃體積為3 ml;鹽酸法舒地爾組腹腔注射,每日劑量為12 mg/kg[7];假手術組和腦出血模型組均給予同蛭龍活血通瘀組等體積的生理鹽水灌胃。

    1.5 觀察指標

    1.5.1 伊文思藍法檢測血腦屏障通透性采用伊文思藍(evens blue,EB)法進行檢測[8]。在實驗規(guī)定各時點前2 h,大鼠稱重麻醉后,經右側股靜脈按20 mg/kg注射2%伊文思藍。各時點將大鼠深度麻醉后用0.9 %生理鹽水迅速經心臟灌注,脫頸處死,剪斷鼠頭,取出腦組織,冠狀位切取損傷周圍腦組織,浸泡于裝有甲酰胺的試管中,經電子恒溫水箱45℃加熱水浴24 h,用移液器吸取上清液,置于離心管中,以1 000 r/min離心5 min,吸取1 ml加入酶標板,用酶標儀檢測光密度值(OD值)。以OD/g濕腦組織表示腦組織的EB含量。

    1.5.2 Western blot檢測ZO-1、Occludin蛋白表達大鼠稱重后予以腹腔注射10%水合氯醛至深度麻醉,快速取出腦組織,去除軟腦膜及表面血液,切取出血側大腦半球血腫周圍腦組織,置于試管中,立即保存至-80℃冰箱。取0.1 g腦組織,用1 ml RAPI裂解液研磨粉碎提取蛋白,考馬斯亮藍法測定蛋白濃度,取50 μg總蛋白量進行SDS-PAGE電泳,濕法電轉至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,相應一抗4℃孵育過夜,TBST洗滌后,HRP酶聯(lián)二抗常溫孵育1 h,TBST洗滌,化學發(fā)光法進行信號檢測。

    1.5.3 免疫組化法觀察Claudin-5、JAM-1蛋白表達大鼠術后3 d,給予深度麻醉后分別經0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌注,脫頸處死后,剪斷鼠頭剝離取出大腦組織,在4%多聚甲醛中固定24 h,經由低到高梯度的乙醇脫水,二甲苯透明,用石蠟包埋制成蠟塊,用切片機連續(xù)切片,經二甲苯、乙醇常規(guī)脫蠟,EDTA修復液、檸檬酸緩沖液高壓修復,冷卻至室溫,甲醇浸泡后PBS緩沖液沖洗,依次經一抗、二抗孵育,PBS沖洗,DAB顯色,流水沖洗,蘇木素復染,稀鹽酸分化,飽和碳酸鋰反藍,經梯度乙醇脫水,二甲苯透明,用中性樹膠脂封片。在光學顯微鏡下觀察相應蛋白表達情況。

    1.5.4 qRT-PCR法檢測Claudin-5 mRNA、JAM-1mRNA水平大鼠在實驗規(guī)定的時點深度麻醉后,快速取出腦組織,去除軟腦膜及表面血液,切取出血側大腦半球血腫周圍腦組織,置于試管中,立即保存至-80℃冰箱。用Trizol法提取總RNA,根據(jù)Claudin-5、JAM-1的cDNA序列,由上海生物工程有限公司合成引物。

    Claudin-5:上 游5’-GTTAAGGCACGGGTG?GCACTC-3’;下 游5’-CGGACTACGATGTTGGC?GAACC-3’

    JAM-1:上 游5’-GCTGTACGCATGGAGGCT?GTG-3’;下 游5’-CCACGGCTATAGGCAAACCA?GATG-3’

    逆轉錄后按95℃10 min預變性,40個循環(huán)(變性95℃15 s,55℃15 s,72℃30 s)進行Real-time PCR擴增,用熒光定量PCR儀進行常規(guī)溶解曲線分析測定CT值,以2-ΔΔCT的計算值作為相對表達水平[9]。

    1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件,計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)、多重比較LSD及Dunnett法進行數(shù)據(jù)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 各組EB含量比較假手術組腦組織EB含量各時點均無明顯變化(P>0.05);與假手術組比較,腦出血模型組大鼠EB含量各時點均明顯增加(P<0.01),在術后3 d時EB含量增加最為明顯,7 d時有所下降;與腦出血模型組比較,蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組大鼠腦組織EB含量在各時點均有明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

    表1 各組EB含量比較 (OD/g,±s)

    表1 各組EB含量比較 (OD/g,±s)

    注:與假手術組比較,①P<0.01;與腦出血模型組比較,②P<0.01

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    2.2 各組ZO-1蛋白表達比較假手術組大鼠腦組織ZO-1蛋白在各時點均無明顯改變(P>0.05);與假手術組比較,腦出血模型組大鼠腦組織ZO-1蛋白在各時點表達均明顯下降(P<0.01),在術后3 d時ZO-1蛋白下降最為明顯,7 d時有所回升;與腦出血模型組比較,蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組腦組織ZO-1蛋白表達在各時點均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

    表2 各組ZO-1蛋白相對表達量比較 (±s)

    表2 各組ZO-1蛋白相對表達量比較 (±s)

    注:與假手術組比較,①P<0.01;與腦出血模型組比較,②P<0.01

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    2.3 各組Occludin蛋白表達比較假手術組大鼠腦組織Occludin蛋白在各時點均無明顯改變(P>0.05);與假手術組比較,腦出血模型組Occludin蛋白在各時點表達均明顯下降(P<0.01),在術后3 d時Occludin蛋白表達下降最為明顯,7 d時有所回升;與腦出血模型組比較,蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組Occludin蛋白表達在各時點均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

    表3 各組Occludin蛋白相對表達量比較 (±s)

    表3 各組Occludin蛋白相對表達量比較 (±s)

    注:與假手術組比較,①P<0.01;與腦出血模型組比較,②P<0.01

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    2.4 各組血腫周圍組織Claudin-5、JAM-1蛋白表達比較免疫組化結果顯示,假手術組大鼠術區(qū)腦組織可見大量均勻分布的Claudin-5、JAM-1蛋白表達,其中Claudin-5蛋白主要表達于神經元細胞、神經膠質細胞、血管內皮細胞,形態(tài)可呈線條狀或短棒狀,JAM-1蛋白主要表達于神經元細胞、神經膠質細胞,血管內皮細胞也可見少量表達,形態(tài)呈短棒狀;與假手術組比較,腦出血模型組大鼠血腫周圍組織僅存在少量Claudin-5、JAM-1蛋白表達;與腦出血模型組比較,蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組Claudin-5、JAM-1蛋白表達均明顯增加。見圖1。

    圖1 各組大鼠血腫周圍組織Claudin-5、JAM-1蛋白表達比較(×400)

    2.5 各組大鼠腦組織Claudin-5 mRNA水平比較假手術組大鼠腦組織Claudin-5 mRNA水平在各時點均無明顯改變(P>0.05);與假手術組比較,腦出血模型組大鼠腦組織Claudin-5 mRNA水平在各時點均顯著降低(P<0.05),3 d時降低最為明顯,7 d時有所回升;與腦出血模型組比較,蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組各時點腦組織Claudin-5 mRNA水平均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

    表4 各組大鼠腦組織Claudin-5 mRNA水平比較 (±s)

    表4 各組大鼠腦組織Claudin-5 mRNA水平比較 (±s)

    注:與假手術組比較,①P<0.05;與腦出血模型組比較,②P<0.05

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    2.6 各組大鼠腦組織JAM-1 mRNA水平比較假手術組大鼠腦組織JAM-1 mRNA水平在各時點均無明顯改變(P>0.05);與假手術組比較,腦出血模型組大鼠腦組織JAM-1 mRNA水平在各時點均顯著降低(P<0.05),3 d時降低最為明顯,7 d時有所回升;與腦出血模型組比較,蛭龍活血通瘀組、鹽酸法舒地爾組各時點腦組織JAM-1 mRNA水平均有明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

    表5 各組大鼠腦組織JAM-1 mRNA水平比較 (±s)

    表5 各組大鼠腦組織JAM-1 mRNA水平比較 (±s)

    注:與假手術組比較,①P<0.05;與腦出血模型組比較,②P<0.05

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    3 討論

    腦出血后腦組織水腫的機制較為復雜,與諸多因素相關,其中血腦屏障(blood brain barrier,BBB)結構和功能損傷起到了相當重要的作用[10]。BBB是一個復雜的細胞系統(tǒng),是維持腦組織與血液、腦脊液之間進行物質交換的重要結構。完整的血腦屏障不僅能選擇性地使機體所需營養(yǎng)物質、代謝產物通過,以維持腦組織內環(huán)境的穩(wěn)定,而且還能夠防止血液中的有害物質進入腦內,以保護腦組織免遭損害。在BBB的構成中,緊密連接(tight junction,TJ)使血管內皮細胞(BMECs)之間封閉,從而防止有害物質通過,維持神經系統(tǒng)的內環(huán)境穩(wěn)定,避免腦組織損傷[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12],緊密連接蛋白主要由跨膜蛋白、胞質附著蛋白、細胞骨架蛋白三類組成,它們共同維持BBB的完整性,當其結構和功能發(fā)生異常時,即會對BBB通透性造成嚴重影響[13]。其中,跨膜蛋白又包括咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)和連接黏附分子(junctional adhesive molecule,JAM)三種完整的膜蛋白。Occludin是首個被研究證實的跨膜蛋白,相對分子質量64 000,結構上含有504個氨基酸,4個跨膜結構域,其羧基端與胞質附著蛋白ZO-1相互作用,成為TJ的主要結構蛋白和功能調控蛋白[14-15]。Claudin家族蛋白成員的分子量大小約為20~27 KDa,它們在不同的組織中表達,具有組織特異性,其中Claudin-5主要表達于哺乳動物的腦內皮細胞。有研究表明,Clau?din的高表達可以形成緊密連接樣結構[16]。JAMS家族蛋白屬于免疫球蛋白超家族成員之一,分子量約為45 kDa,是單次跨膜蛋白,其細胞外有二個環(huán)狀結構,其外側的環(huán)狀結構可以與對側的內皮細胞JAMS構成同源二聚體結構,也可以與不同的免疫球蛋白超家族成員共同形成異元的二聚體結構。JAM-1主要在腦組織中表達[17]。閉鎖小帶蛋白(zonula occludens,ZO)是首個被證實的胞質附著蛋白,其分布于細胞質內膜的表面,與諸多緊密連接蛋白、細胞骨架相連,屬于膜相關鳥氨酸激酶(membrane-associated guanylate ki?nase-like proteins,MAGUK)家族成員,包含1個SH3、1個GUK和3個PDZ結構域,ZO-1分布于血腦屏障內皮細胞緊密連接的閉鎖小帶中,與血腦屏障的通透性密切相關,因此是檢測血腦屏障結構和功能的良好指標[18]。

    本研究以自體尾部血注入法制備大鼠腦出血模型,通過檢測血腦屏障通透性及血腦屏障緊密連接蛋白的表達,研究蛭龍活血通瘀膠囊防治腦出血的作用機制。實驗結果表明,腦出血模型組大鼠在術后血腦屏障通透性發(fā)生改變,腦組織EB含量明顯升高,至3 d時升高最為明顯,7 d時有所降低;腦組織ZO-1、Oc?cludin、Claudin-5、JAM-1表達明顯減少。與腦出血模型組比較,蛭龍活血通瘀膠囊能明顯降低腦組織EB含量,改善血腦屏障通透性(P<0.01),明顯增加血腫周圍組織ZO-1、Occludin、Claudin-5、JAM-1蛋白表達(P<0.01),使Claudin-5 mRNA、JAM-1 mRNA表達水平增加(P<0.05)。由此可見,蛭龍活血通瘀膠囊可能通過上調血腦屏障緊密連接蛋白在腦內的表達,調節(jié)血腦屏障通透性,從而起到腦保護作用。

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