表沒食子兒茶素沒食子酸酯全乙?；苌飳θ丝谇击[癌耐藥細(xì)胞增殖及多藥耐藥性的影響

韋艷，張海英，歐冰凝，梁鋼

（1.武警廣西總隊(duì)醫(yī)院，廣西南寧530000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530022）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gal?late，EGCG）是茶多酚的主要組成成分，其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)鄰位羥基而具有較強(qiáng)的抗氧化性，已有大量的實(shí)驗(yàn)研究證明EGCG不僅具有抗腫瘤活性，并且對腫瘤的多藥耐藥性有逆轉(zhuǎn)作用。但由于EGCG結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化，生物利用度低，制約了其應(yīng)用價(jià)值。本課題組通過乙?；磻?yīng)后進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯全乙?；苌铮ˋc-EGCG），增加了其化學(xué)穩(wěn)定性。前期研究發(fā)現(xiàn)Ac-EGCG體外有較好的抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的作用［1-2］，本研究觀察Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞增殖的影響，并檢測Ac-EGCG作用于人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞后對多藥耐藥1型基因（MDR1）、肺耐藥蛋白（LRP）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST-π）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）各多藥耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株人口腔鱗癌細(xì)胞KB及其耐藥株KBV200保存于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。人口腔鱗癌細(xì)胞KB及其耐藥株KBV200置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，KBV200細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入200 ng/ml長春新堿（VCR）維持其多藥耐藥性。

1.2 藥品與試劑Ac-EGCG由本研究團(tuán)隊(duì)合成（純度98.77%）；胰蛋白酶與牛血清購自美國Hyclone公司；Model-450酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Rad公司）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI PRISM7900 system，美國Ap?plied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 甲基四唑藍(lán)（MTT）法檢測Ac-EGCG對耐藥細(xì)胞的抑制作用分別取對數(shù)生長期的人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞，稀釋，調(diào)整單細(xì)胞懸液為1×105cell/ml，接種于同一96孔板中，每孔100μl，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將Ac-EGCG配制成不同濃度（60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L、960 mg/L）的系列溶液，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔；對照組加入等量無血清RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO振蕩10 min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶，以酶標(biāo)儀于492 nm處測定吸光值，實(shí)驗(yàn)不同日重復(fù)測定3次取均數(shù)。計(jì)算各組細(xì)胞抑制率（IR）=（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值×100%。根據(jù)對應(yīng)的抑制率用LOGIT軟件計(jì)算IC50（50%的細(xì)胞株生長受抑制時(shí)所需的藥物濃度）和IC10（10%的細(xì)胞株生長受抑制時(shí)所需的藥物濃度）。

2.2 MTT法檢測Ac-EGCG對細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組、陰性對照組、藥物組。取人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞單細(xì)胞懸液1×105cell/ml種板，空白對照組僅加培養(yǎng)液，陰性對照組加入濃度梯度（0.5 mg/L，1 mg/L，1.5 mg/L，2 mg/L）的VCR（無Ac-EGCG作用耐藥細(xì)胞），藥物組選取3個(gè)對耐藥細(xì)胞株抑制率<10%的Ac-EGCG濃度（20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L）為試驗(yàn)濃度，分別聯(lián)合濃度梯度的VCR（0.5 mg/L，1 mg/L，1.5 mg/L，2 mg/L）。按前述MTT實(shí)驗(yàn)方法，LOGIT軟件計(jì)算各組VCR的IC50。逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)（reverse fold，RF）=VCR的IC50/聯(lián)合Ac-EGCG后VCR的IC50。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組兩組。陰性對照組（KBV200組）：該組僅有KBV200細(xì)胞，不加藥物干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組（KBV200+Ac-EGCG組）：于KBV200細(xì)胞中加入98.2 mg/L Ac-EGCG培養(yǎng)48 h。引物以及PCR微陣列由上?？党缮锕こ逃邢薰咎峁?。各樣品在5 ml EP管中配制混合液：2×Super Ar?ray PCR mastermix 550 μl，已 稀 釋 的cDNA102 μl，ddH2O 448 μl，總體積1 100 μl。加10 μl混合液到PCR微陣列對應(yīng)的每個(gè)孔中，在設(shè)置PCR程序前將準(zhǔn)備好的PCR微陣列放在冰上，所設(shè)置的程序如下：10 min 95℃，15 s 95℃，1 min 60℃（收集熒光）40個(gè)循環(huán)。所有樣本做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物用融解曲線進(jìn)行分析以排除是否有引物二聚體的干擾。反應(yīng)設(shè)陰性對照（超純水代替引物及模板），以達(dá)到閾值的最低循環(huán)數(shù)（Ct值）計(jì)算樣本中基因的mRNA拷貝數(shù)相對量。采用ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)處理組中的每個(gè)通路反應(yīng)孔相關(guān)基因ΔCt。ΔCt（對照組）=對照組平均Ct值-對照組看家基因平均Ct值；ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）=實(shí)驗(yàn)組平均Ct值-實(shí)驗(yàn)組看家基因平均Ct值。兩組差異基因ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對照組），通過2-ΔΔCt計(jì)算實(shí)驗(yàn)組與對照組對應(yīng)基因的表達(dá)差異倍數(shù)，差異倍數(shù)大于2為差異基因。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞增殖的影響不同濃度Ac-EGCG（60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L、960 mg/L）對KBV200作用48 h的抑制率（%）分別為：（5.56±0.11）%、（13.34±0.38）%、（18.70±0.59）%、（35.19±0.51）%、（67.10±0.24）%，隨著Ac-EGCG濃度增加，對KBV200的抑制率增加（P<0.05），呈濃度依賴性。Ac-EGCG對KBV200作用48 h的IC50為609.5 mg/L，IC10為98.2 mg/L。

3.2 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞耐藥性的影響20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L Ac-EGCG對VCR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.38、2.12、3.26倍（P<0.05），隨著Ac-EGCG濃度增加，對KBV200耐藥逆轉(zhuǎn)作用增加（P<0.05），呈濃度依賴性。見表1。

表1 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞耐藥性的影響 （±s）

表1 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞耐藥性的影響 （±s）

注：與陰性對照組比較，①P<0.05；與20 mg/L Ac-EGCG組比較，②P<0.05；與40 mg/L Ac-EGCG組比較，③P<0.05

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3.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測各基因的表達(dá)情況見表2。Ac-EGCG可下調(diào)人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞KBV200中MDR1、GST-π、TopoⅡ基因的表達(dá)，分別下調(diào)5.09、2.12、2.46倍（P<0.05）；而對LRP基因表達(dá)無影響。

表2 Ac-EGCG對耐藥細(xì)胞中MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因表達(dá)的影響 （±s)

表2 Ac-EGCG對耐藥細(xì)胞中MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因表達(dá)的影響 （±s)

注：與KBV200組比較，①P<0.05

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4 討論

本課題組在前期就Ac-EGCG對體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性進(jìn)行了研究，現(xiàn)本研究在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)一步探討Ac-EGCG逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制。在MTT法測定Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞增殖及耐藥性的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果表明Ac-EGCG對KBV200的抑制率呈濃度依賴性，隨著濃度增加而提高，并且3個(gè)低于IC10濃度的Ac-EGCG都能下調(diào)長春新堿對KBV200的IC50，增加了KBV200對長春新堿的敏感性，說明Ac-EGCG可逆轉(zhuǎn)KBV200對長春新堿的耐藥性。

在檢測耐藥相關(guān)基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ac-EGCG可下調(diào)人口腔鱗癌耐藥細(xì)胞KBV200中MDR1、GST-π、TopoⅡ基因的表達(dá)，而對LRP基因表達(dá)無影響。多藥耐藥1型基因（MDR1）可導(dǎo)致載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（P-gp）過度表達(dá)，P-gp具有依賴ATP的“藥泵”功能，能夠增加藥物的外向轉(zhuǎn)運(yùn)而降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，這是腫瘤經(jīng)典的耐藥途徑。目前國內(nèi)外研究的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑多數(shù)是針對此機(jī)制，所發(fā)現(xiàn)的中藥類MDR逆轉(zhuǎn)劑絕大多數(shù)仍然是P-gp競爭性抑制劑［3-4］。Ac-EGCG可降低MDR1基因的表達(dá)，這可能是其逆轉(zhuǎn)耐藥的途徑之一，至于Ac-EGCG是否可從RNA翻譯水平上抑制人口腔磷癌耐藥細(xì)胞中P-gp蛋白表達(dá)還有待下一步的研究。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Ac-EGCG可下調(diào)人口腔磷癌耐藥細(xì)胞谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π（GST-π）基因的表達(dá)，GST是體內(nèi)重要的藥物代謝酶體系，GST-s不同同功酶對不同抗腫瘤藥物有一定特異性，其中GST-π與腫瘤耐藥密切相關(guān)，其作用機(jī)制可能為：GST催化抗腫瘤藥物與GSH結(jié)合，直接降低藥物活性；或核內(nèi)GST抑制藥物對DNA攻擊；或GST催化GSH與DNA競爭與金屬鉑結(jié)合，降低鉑類活性；此外，GSH在細(xì)胞損傷修復(fù)和解毒過程中也具有關(guān)鍵性作用［5-6］。同時(shí)，Ac-EGCG可下調(diào)人口腔磷癌耐藥細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）基因的表達(dá)，拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisom?erase）是一種能催化DNA超螺旋結(jié)構(gòu)局部構(gòu)型改變的基本核酶，許多藥物通過該酶與DNA形成共價(jià)復(fù)合物，引起DNA永久性損傷（DNA斷裂），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。TopoⅡ活性降低、表達(dá)減少或基因突變，可使化療藥物喪失靶點(diǎn)產(chǎn)生耐藥［7-8］。實(shí)驗(yàn)中檢測到Ac-EGCG對肺耐藥蛋白（LRP）RNA的表達(dá)影響不大，但在蛋白表達(dá)水平上Ac-EGCG是否通過LRP逆轉(zhuǎn)耐藥，值得進(jìn)一步繼續(xù)研究。