氧化鋅和二氧化鈦納米顆粒對(duì)淡水綠藻的單一及聯(lián)合毒性研究

王壯，金世光，張帆，王德高

（1.南京信息工程大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210044；2.大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116026）

伴隨著納米科技的快速發(fā)展，各種工程納米結(jié)構(gòu)材料正被廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)[1?2]。值得關(guān)注的是，納米技術(shù)已逐漸滲透到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)鏈條的各環(huán)節(jié)，其中納米科技與農(nóng)業(yè)結(jié)合最密切的領(lǐng)域是納米農(nóng)業(yè)化學(xué)品，如納米型殺蟲劑[3]、納米肥料[4]。隨著現(xiàn)有納米材料市場(chǎng)滲透的日益增加和不間斷的新納米材料的開發(fā)，大量的工程納米顆粒（ENPs）將不可避免地釋放到大氣[5]、水[6]、土壤[7]中，成為潛在的環(huán)境污染物[8]?；瘜W(xué)污染物通常以各種混合形式存在于環(huán)境中[9?10]，因此在靠近或遠(yuǎn)離點(diǎn)源處，ENPs 可能會(huì)以混合物的形式暴露于自然生態(tài)系統(tǒng)中。據(jù)報(bào)道，多元ENPs 混合物和各單一ENPs 均表現(xiàn)出截然不同的生態(tài)毒性[11?14]。因此，闡明多元混合ENPs 對(duì)生態(tài)物種的聯(lián)合毒性作用及機(jī)制，將有利于為ENPs 在自然環(huán)境中的生態(tài)效應(yīng)提供更為全面的評(píng)估。

多元ENPs對(duì)生態(tài)物種的聯(lián)合毒性作用方式主要表現(xiàn)為拮抗作用[15?16]、協(xié)同作用[17?18]及加和作用[11，19]。不同化學(xué)成分的ENPs所組成的混合物對(duì)同一物種表現(xiàn)出的毒性效應(yīng)也明顯不同。如CuO NPs 與CuNPs對(duì)發(fā)光細(xì)菌——費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用，而CuO NPs 與Zn NPs 對(duì)費(fèi)氏弧菌的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用[11]；類似地，CeO2NPs 與TiO2NPs 組成的二元混合物對(duì)氨氧化模式菌株——?dú)W洲亞硝化毛桿菌（Nitrosomonas europaea）的毒性作用為拮抗作用，而CeO2NPs 與ZnO NPs 組成的二元混合物對(duì)該細(xì)菌的毒性作用為協(xié)同作用[20]。此外，具有相同成分的ENPs混合物對(duì)不同物種也會(huì)呈現(xiàn)出不同的毒性效應(yīng)。例如Cu NPs 與ZnO NPs 對(duì)虹鱒魚（Rainbow trout）的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用[21]，而該二元混合體系對(duì)費(fèi)氏弧菌[10]和生菜（Lactuca sativaL.）[22]的聯(lián)合毒性作用方式為拮抗。因此，混合組分類型和受試生物類型均是影響多元ENPs聯(lián)合毒性的重要因素。

ENPs對(duì)生態(tài)物種的毒性效應(yīng)會(huì)隨著作用時(shí)間的變化而發(fā)生變化[23?24]。這意味著不同暴露時(shí)間可能會(huì)影響多元ENPs對(duì)生態(tài)物種的聯(lián)合毒性及其作用方式。然而，有關(guān)不同暴露時(shí)間對(duì)多元ENPs 聯(lián)合毒性及其作用方式的影響研究仍是空白。同時(shí)，目前的研究通常只評(píng)估單一劑量/濃度下多元ENPs 的聯(lián)合毒性作用方式，卻很少有研究從全劑量/濃度的角度評(píng)價(jià)多元ENPs的聯(lián)合毒性作用方式。本研究選取兩種廣泛應(yīng)用且具有代表性的金屬氧化物ENPs（即ZnO NPs[25]和TiO2NPs[26]）為研究對(duì)象，通過毒性測(cè)試，考察在不同暴露時(shí)間和全濃度下ZnO NPs 和TiO2NPs 分別對(duì)兩種淡水綠藻[斜生柵藻（Scenedes?mus obliquus）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）]的單一和聯(lián)合毒性；利用毒性單位法（毒理學(xué)中用來定量研究混合物中毒物相互作用的常用方法），評(píng)估在不同暴露時(shí)間和全濃度下ZnO NPs 和TiO2NPs 分別對(duì)斜生柵藻和蛋白核小球藻的聯(lián)合毒性作用方式；應(yīng)用經(jīng)典混合毒理方法，預(yù)測(cè)在不同暴露時(shí)間和全濃度下ZnO NPs 和TiO2NPs 分別對(duì)斜生柵藻和蛋白核小球藻的聯(lián)合毒性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及測(cè)試介質(zhì)

ZnO NPs 和TiO2NPs 粉體購(gòu)自德國(guó)PlasmaChem公司。ZnO NPs 的純度>99%，原始粒徑約為14 nm，比表面積為（30±5）m2·g?1；TiO2NPs 為金紅石相/銳鈦礦相混合物，純度>99.5%，原始粒徑為（21±5）nm，比表面積為（50±10）m2·g?1。將測(cè)試材料的粉體分散于高純水中以制備儲(chǔ)備液，隨即將儲(chǔ)備液在可控溫度下超聲處理30 min 備用。本研究選取ZnCl2中的Zn2+作為ZnO NPs 溶解釋放的Zn2+的毒性參考物質(zhì)，ZnCl2（純度>99.99%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。兩種淡水綠藻（斜生柵藻和蛋白核小球藻）的原種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所。熒光探針2′，7′?二氯熒光素酶（DCFH?DA）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用的測(cè)試介質(zhì)參考國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）制定的藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則配制（附表1，掃描文章首頁(yè)OSID 碼瀏覽）[27]。在磁力攪拌器的攪拌下，將ENPs 儲(chǔ)備液加入測(cè)試介質(zhì)中以制備其測(cè)試組懸浮液。

1.2 物理化學(xué)性質(zhì)表征

使用透射電子顯微鏡對(duì)ZnO NPs 和TiO2NPs 及其二元混合物在測(cè)試介質(zhì)中的形貌進(jìn)行表征（TEM，JOEL 2100f，JOEL 有限公司，日本東京）。使用馬爾文激光粒度儀（ZetaSizer Nano ZS90，Malvern Instru?ments Ltd.，Worcester?shire，英國(guó)）對(duì) ZnO NPs 和 TiO2NPs 及其二元混合物在測(cè)試介質(zhì)中的零點(diǎn)電勢(shì)和水動(dòng)力學(xué)直徑進(jìn)行表征，考慮到該儀器的檢出限，本測(cè)試選取懸浮顆粒濃度為10 mg·L?1?；诮?jīng)典DL?VO理論[28]，通過計(jì)算顆粒間相互作用的總勢(shì)能確定測(cè)試介質(zhì)中ZnO NPs和TiO2NPs及其二元混合物的懸浮穩(wěn)定性。使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP?MS，Thermo Fisher iCAP?Q，德國(guó)）確定ZnO NPs 溶解部分的濃度。

1.3 藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期間，取一定量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的斜生柵藻和蛋白核小球藻重新懸浮于新鮮的OECD 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至藻細(xì)胞密度分別為3×105個(gè)·mL?1和4×105個(gè)·mL?1。淡水綠藻的培養(yǎng)和毒性測(cè)試條件為溫度（24±1）℃，光暗周期比12 h∶12 h，將培養(yǎng)基靜置于人工氣候箱中，每日搖動(dòng)3 次以保證綠藻處于懸浮狀態(tài)且使得ENPs 與藻細(xì)胞均衡接觸。選取 24、48、72、96 h 的生長(zhǎng)抑制率作為斜生柵藻的毒性終點(diǎn)，選取24、48、72 h的生長(zhǎng)抑制率作為蛋白核小球藻的毒性終點(diǎn)。

1.4 藻細(xì)胞氧化損傷檢測(cè)

藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）含量通過熒光探針法測(cè)定。ROS測(cè)定過程如下：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液分別暴露于ZnO NPs 和TiO2NPs 及其二元混合物中30 min，并設(shè)立對(duì)照組（未染毒納米顆粒的藻液）。為突出這兩種ENPs 對(duì)ROS 生成的顯著性誘導(dǎo)，選取中高效應(yīng)濃度10 mg·L?1為主要研究濃度。將暴露于各測(cè)試組后的藻液在15 000 r·min?1下離心10 min，棄去上清液，加入DCFH?DA 熒光探針，使其濃度為10μmol·L?1。25 ℃下黑暗避光孵育 30 min，然后用OECD 培養(yǎng)基清洗藻細(xì)胞以去除松散結(jié)合的顆粒物，使用熒光分光光度計(jì)（F96PRO，上海棱光技術(shù)有限公司）檢測(cè)各測(cè)試組的熒光信號(hào)。

1.5 評(píng)估和預(yù)測(cè)聯(lián)合毒性

應(yīng)用對(duì)數(shù)模型（公式1）構(gòu)建ZnO NPs 和TiO2NPs及其二元混合物的濃度?反應(yīng)曲線（CRCs）。通過CRCs 得到每個(gè)處理組的效應(yīng)值（E）。本研究選取單一ENPs 的毒性終點(diǎn)時(shí)的均值效應(yīng)濃度（EC50）值作為混合比率對(duì)ZnO NPs和TiO2NPs進(jìn)行二元混合。

式中：C為顆粒物濃度，mg·L?1；θ代表斜率。

利用毒性單位（TU）法評(píng)估ZnO NPs 和TiO2NPs的聯(lián)合毒性作用方式，參考KIM 等[29]的方法。利用測(cè)試材料的EC50值計(jì)算其毒性單位值（U）：

式中：Ci為某一測(cè)試材料的濃度，mg·L?1；UTotal為 ZnO NPs(UZnONPs)與 TiO2NPs（UTiO2NPs）的 TU 值之和。混合毒性作用方式通過比對(duì)由毒性數(shù)據(jù)計(jì)算而來的實(shí)驗(yàn)觀察 TU 值（Uobs）和預(yù)測(cè)的 TU 值（Uexp）得到：當(dāng)Uobs≈Uexp，表現(xiàn)為加和作用；當(dāng)Uobs>Uexp，表現(xiàn)為協(xié)同作用；當(dāng)Uobs

應(yīng)用兩種經(jīng)典混合毒理方法即濃度加和（CA）模型和獨(dú)立作用（IA）模型預(yù)測(cè)ZnO NPs 和TiO2NPs 的聯(lián)合毒性。CA和IA模型如公式（4）和公式（5）所示：

式中：Cxmix為混合體系在產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，mg·L?1；Pi為組分i的濃度比值；Cxi為混合組分i在產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度，mg·L?1。

式中：E（Cmix）為混合體系的效應(yīng)值；E（Ci）為混合組分i的效應(yīng)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SigmaPlot（14.0版）統(tǒng)計(jì)分析模塊對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 物理化學(xué)性質(zhì)表征

使用 TEM 技術(shù)表征了 ZnO NPs、TiO2NPs 及其二元混合物在測(cè)試介質(zhì)中的形貌。如圖1 所示，ZnO NPs（圖1A）和TiO2NPs（圖1B）在測(cè)試介質(zhì)中均呈現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，當(dāng)兩種ENPs 共存時(shí)（圖1C）顆粒間團(tuán)聚行為亦存在。這是由于ENPs比表面積大、比表面能高，屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，在水中極易發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，并形成大小不等的團(tuán)聚體。

ENPs的表面電勢(shì)和水動(dòng)力學(xué)直徑是表征納米顆粒在水相中分散穩(wěn)定性和團(tuán)聚行為的重要物理化學(xué)性質(zhì)[30?31]。圖 2 為 ZnO NPs、TiO2NPs 及其二元混合物在測(cè)試介質(zhì)中的表面電勢(shì)和團(tuán)聚粒徑大小隨時(shí)間的變化。如圖2A所示，ZnO NPs和TiO2NPs在96 h時(shí)的表面電勢(shì)與0 h時(shí)相比均未發(fā)生顯著性的變化。在初始時(shí)刻，ZnO NPs 和TiO2NPs 二元混合物的表面電勢(shì)與各單一組分的表面電勢(shì)均不存在顯著差異。然而，在96 h 后，與其他處理組相比，二元混合物的表面電勢(shì)發(fā)生了顯著性降低（P<0.05）。這可能是由于納米顆粒不斷發(fā)生沉降，當(dāng)體系達(dá)到平衡，ZnO NPs 和TiO2NPs 表面所攜帶的負(fù)電荷整體表現(xiàn)出疊加作用，故呈現(xiàn)出表面電勢(shì)降低的現(xiàn)象。如圖2B 所示，在96 h 后，ZnO NPs 和TiO2NPs 的水動(dòng)力學(xué)直徑均高于其原始粒徑，進(jìn)一步說明這兩種ENPs 在測(cè)試介質(zhì)中發(fā)生了團(tuán)聚行為。ZnO NPs 在96 h 時(shí)的水動(dòng)力學(xué)直徑與0 h 時(shí)相比未發(fā)生顯著性的變化，且TiO2NPs 的水動(dòng)力學(xué)直徑顯著小于ZnO NPs 的水動(dòng)力學(xué)直徑。在0 h，二元混合物的水動(dòng)力學(xué)直徑介于單獨(dú)存在的TiO2NPs 和ZnO NPs 的水動(dòng)力學(xué)直徑之間。在96 h，二元混合物的水動(dòng)力學(xué)直徑與ZnO NPs 的水動(dòng)力學(xué)直徑無(wú)顯著性的差異，說明TiO2NPs可能被“包裹”在ZnO NPs之間。

應(yīng)用經(jīng)典DLVO 理論可有效地評(píng)估ENPs 在水相中的分散穩(wěn)定性[32?33]?；贒LVO 理論，計(jì)算得到10 mg·L?1ZnO NPs、10 mg·L?1TiO2NPs 及其二元混合物的總勢(shì)能曲線，如圖3 所示。由于線性疊加而導(dǎo)致的勢(shì)能曲線上出現(xiàn)的最大值，被稱為勢(shì)能峰值。通常勢(shì)能峰值越大，體系保持穩(wěn)定的時(shí)間越長(zhǎng)。如圖3A 所示，在0 h 時(shí)，二元混合物的穩(wěn)定性介于TiO2NPs 和ZnO NPs 的穩(wěn)定性之間。如圖3B 所示，在 96 h 時(shí)，二元混合物的穩(wěn)定性高于TiO2NPs 和ZnO NPs 的穩(wěn)定性。這與前述的理化性質(zhì)表征結(jié)果一致，即在96 h后二元混合物的顆粒表面電勢(shì)降低，表明顆粒間以斥力為主，難以團(tuán)聚而處于穩(wěn)定懸浮狀態(tài)。

由于ZnO NPs 表面性質(zhì)活潑，進(jìn)入水相后可溶解釋放 Zn2+[34?35]，而共存的惰性 TiO2NPs 可利用表面效應(yīng)吸附水中游離態(tài)的Zn2+，進(jìn)而能夠降低Zn2+的生物活性[36]。本文定量分析了 10 mg·L?1TiO2NPs 對(duì) 10 mg·L?1ZnO NPs 溶解釋放 Zn2+的影響。如圖 4 所示，單獨(dú)存在的ZnO NPs 溶解釋放Zn2+的比例為16%±1.7%，而當(dāng)與TiO2NPs共存時(shí)，ZnO NPs溶解釋放Zn2+的比例為2.2%±0.2%。由此可見，TiO2NPs 的存在降低了ZnO NPs溶解釋放Zn2+的濃度。如圖2B所示，與ZnO NPs相比，TiO2NPs具有更小的水動(dòng)力學(xué)直徑，這使得TiO2NPs的團(tuán)聚體擁有更大的比表面積，易于通過表面吸附降低ZnO NPs 溶解釋放Zn2+的量。另外，具有更小水動(dòng)力學(xué)直徑的TiO2NPs 可能更易于占據(jù)ZnO NPs 表面的活性位點(diǎn)，從而抑制Zn2+的釋放。同時(shí)，如圖2A 所示，TiO2NPs 在測(cè)試介質(zhì)中表面電勢(shì)為負(fù)，即攜帶負(fù)電荷，故靜電作用是上述吸附過程的主要驅(qū)動(dòng)力。

2.2 單一藻毒性

圖 5 為不同暴露時(shí)間下 ZnO NPs、TiO2NPs、Zn2+對(duì)斜生柵藻和蛋白核小球藻的濃度?反應(yīng)曲線（CRCs）。整體而言，ZnO NPs、TiO2NPs、Zn2+對(duì)兩種淡水綠藻均以濃度依賴的方式產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制毒性。對(duì)于斜生柵藻，不同暴露時(shí)間下ZnO NPs（圖5A）、TiO2NPs（圖 5C）和 Zn2+（圖 5E）的 CRCs 有明顯的交叉。對(duì)于蛋白核小球藻，在48 h 和72 h 下ZnO NPs（圖5B）、TiO2NPs（圖5D）和Zn2（+圖5F）的CRCs 向較高的生長(zhǎng)抑制毒性區(qū)域移動(dòng)。結(jié)合EC50值進(jìn)一步比較 ZnO NPs、TiO2NPs、Zn2+的毒性大小，結(jié)果如表 1 和表2所示，結(jié)合置信區(qū)間，在不同暴露時(shí)間下ZnO NPs的EC50值均小于 TiO2NPs 的EC50值，說明 ZnO NPs 對(duì)兩種淡水綠藻的生長(zhǎng)抑制毒性均高于TiO2NPs。ZnO NPs 和TiO2NPs 在不同暴露時(shí)間下對(duì)斜生柵藻的EC50值無(wú)顯著差異（表1）。ZnO NPs 和TiO2NPs 在48 h 和72 h 對(duì)蛋白核小球藻的EC50值明顯小于其在24 h 的EC50值（表2），表明隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，ZnO NPs 和TiO2NPs 對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制毒性逐漸增強(qiáng)。在毒性終點(diǎn)，ZnO NPs 對(duì)斜生柵藻的毒性高于其對(duì)蛋白核小球藻的毒性，而TiO2NPs對(duì)蛋白核小球藻的毒性高于其對(duì)斜生柵藻的毒性。這也說明，不同種類的淡水綠藻對(duì)ENPs 的敏感性存在差別，且蛋白核小球藻對(duì)ENPs的敏感性依賴于暴露時(shí)間。斜生柵藻通常由4 個(gè)細(xì)胞組成，細(xì)胞寬度為12~34μm，長(zhǎng)度為10~21 μm，呈扁平狀，而蛋白核小球藻為單細(xì)胞，呈球形，直徑3~5 μm。蛋白核小球藻直徑更小，比表面積更高，可維持更穩(wěn)定的懸浮狀態(tài)。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白核小球藻可維持對(duì)ENPs 更有效的攝取，進(jìn)而隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)毒性效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。

如表1和表2所示，就EC50值及其置信區(qū)間而言，Zn2+與ZnO NPs對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的抑制毒性在不同暴露時(shí)間下均無(wú)顯著性差異，而Zn2+對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制毒性略低于ZnO NPs。ZnO NPs暴露濃度為10 mg·L?1時(shí)，其溶解釋放 Zn2+的平均濃度為 1.6 mg·L?1。1.6 mg·L?1Zn2+對(duì)斜生柵藻在不同暴露時(shí)間的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)分別為65%（24 h）、86%（48 h）、99%（72 h）、99%（96 h）；Zn2+對(duì)蛋白核小球藻在不同暴露時(shí)間的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)分別為4%（24 h）、30%（48 h）、39%（72 h）。這說明Zn2+是ZnO NPs 對(duì)淡水綠藻生長(zhǎng)抑制毒性的主要來源。前人研究也證實(shí)，ZnO NPs 表現(xiàn)出的毒性主要來源于其顆粒自身及其溶解釋放的Zn2+[19，35]。本研究還發(fā)現(xiàn) Zn2+對(duì)斜生柵藻的EC50值明顯小于Zn2+對(duì)蛋白核小球藻的EC50值（表1 和表2），說明Zn2+對(duì)斜生柵藻的毒性高于對(duì)蛋白核小球藻的毒性。這也表明斜生柵藻對(duì)Zn2+的敏感性高于蛋白核小球藻對(duì)Zn2+的敏感性。綜上，溶解釋放的Zn2+在ZnO NPs對(duì)斜生柵藻毒性中的貢獻(xiàn)高于其在ZnO NPs對(duì)蛋白核小球藻毒性中的貢獻(xiàn)，ZnO NPs 對(duì)斜生柵藻的毒性主要來源于溶解釋放的Zn2+，而其對(duì)蛋白核小球藻的毒性不僅來源于溶解釋放的Zn2+，還來源于顆粒自身。同時(shí)，作為一種惰性ENPs 的TiO2NPs，其對(duì)淡水綠藻的毒性取決于其顆粒自身。

2.3 聯(lián)合藻毒性

ZnO NPs 和TiO2NPs 的二元混合物對(duì)兩種淡水綠藻生長(zhǎng)抑制毒性的CRCs如圖5G和圖5H所示。二元混合物對(duì)斜生柵藻和蛋白核小球藻的EC50值如表1 和表 2 所示。與 ZnO NPs 和 TiO2NPs 的單一毒性類似，二元混合物以混合暴露濃度依賴的方式對(duì)淡水綠藻產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制毒性。同樣地，二元混合物在不同暴露時(shí)間下對(duì)斜生柵藻的EC50值無(wú)顯著差異（表1），二元混合物在48 h 和72 h 對(duì)蛋白核小球藻的EC50值明顯小于其在24 h 時(shí)的EC50值（表2）。另外，二元混合物對(duì)兩種淡水綠藻的EC50值與ZnO NPs 的EC50值并無(wú)顯著差異，說明ZnO NPs 在二元混合物中對(duì)淡水綠藻的毒性起主要的作用。在不同暴露時(shí)間下，二元混合物對(duì)斜生柵藻的EC50值明顯小于其對(duì)蛋白核小球的EC50值，表明二元混合物對(duì)斜生柵藻的毒性大于其對(duì)蛋白核小球的毒性。這也意味著斜生柵藻對(duì)ZnO NPs 和TiO2NPs 二元混合物的敏感性高于蛋白核小球藻對(duì)二元混合物的敏感性。

表1 通過濃度?反應(yīng)曲線得到單一測(cè)試材料和二元混合物對(duì)斜生柵藻的均值效應(yīng)濃度（EC50，mg·L?1）Table 1 Mean effect concentrations（EC50）derived from concentration-response curves of the single test materials and the binary mixtures to Scenedesmus obliquus（mg·L?1）

表2 通過濃度?反應(yīng)曲線得到單一測(cè)試材料和二元混合物對(duì)蛋白核小球藻的均值效應(yīng)濃度（EC50，mg·L?1）Table 2 Mean effect concentrations（EC50）derived from concentration-response curves of the single test materials and the binary mixtures to Chlorella pyrenoidosa（mg·L?1）

2.4 聯(lián)合藻毒性作用方式及機(jī)制

基于TU 法評(píng)估ZnO NPs 和TiO2NPs 對(duì)兩種淡水綠藻全濃度范圍內(nèi)的聯(lián)合毒性作用方式。如圖6A所示，ZnO NPs 與TiO2NPs 對(duì)斜生柵藻的聯(lián)合毒性作用方式在毒性單位值小于10（即混合暴露濃度小于1 mg·L?1）時(shí)表現(xiàn)為加和，而在毒性單位值大于10（即混合暴露濃度大于1 mg·L?1）時(shí)表現(xiàn)為拮抗。在組分濃度較低時(shí)，ZnO NPs 與TiO2NPs 共同競(jìng)爭(zhēng)與藻細(xì)胞間的相互作用，在所有效應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，產(chǎn)生加和效應(yīng)。當(dāng)混合組分濃度增加，一方面ZnO NPs 顆粒間團(tuán)聚性增加而抑制了Zn2+的釋放，另一方面共存的TiO2NPs通過吸附作用和占據(jù)ZnO NPs 表面活性位點(diǎn)的方式降低了Zn2+的釋放量（圖4），從而導(dǎo)致ZnO NPs 毒性降低，混合體系產(chǎn)生了拮抗作用。如圖6B 所示，ZnO NPs 與TiO2NPs 二元混合物對(duì)蛋白核小球藻在24 h的聯(lián)合毒性作用方式表現(xiàn)為協(xié)同，而在48 h和72 h的聯(lián)合毒性作用方式表現(xiàn)為拮抗。如物理化學(xué)性質(zhì)的表征結(jié)果（見2.1）所示，ZnO NPs與TiO2NPs的二元混合物可產(chǎn)生復(fù)合團(tuán)聚體，該復(fù)合體可與藻細(xì)胞直接接觸，破壞藻細(xì)胞壁，并可被攝入細(xì)胞內(nèi)，加上各混合組分對(duì)藻細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)而產(chǎn)生了協(xié)同作用。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合團(tuán)聚體的尺度逐漸增大，較難進(jìn)入藻細(xì)胞，毒性逐漸降低。加上TiO2NPs 通過控制ZnO NPs 溶解釋放Zn2+量降低了ZnO NPs 的毒性，故混合體系在48 h 和72 h 產(chǎn)生拮抗作用。綜上可知，ZnO NPs 和TiO2NPs 對(duì)斜生柵藻的聯(lián)合毒性作用方式與混合暴露濃度有關(guān)，對(duì)蛋白核小球藻的聯(lián)合毒性作用方式與暴露時(shí)間有關(guān)。同時(shí)，控制Zn2+釋放量及顆粒團(tuán)聚體與細(xì)胞間的相互作用是導(dǎo)致混合體系聯(lián)合毒性作用方式變化的內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力。

據(jù)報(bào)道，由顆粒誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS 所引起的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激效應(yīng)是ENPs 主要的毒性作用機(jī)制[37?38]。本研究通過熒光探針法檢測(cè)了兩種淡水綠藻暴露于單獨(dú)ZnO NPs 和TiO2NPs 及其二元混合物后藻細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量變化（圖7）。相比于對(duì)照組，單獨(dú)ZnO NPs 和TiO2NPs 均顯著誘導(dǎo)了兩種淡水綠藻細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，且ZnO NPs誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS升高的水平顯著高于TiO2NPs，這可能會(huì)導(dǎo)致藻細(xì)胞產(chǎn)生更嚴(yán)重的氧化損傷，進(jìn)而造成更嚴(yán)重的生長(zhǎng)抑制毒性，該結(jié)果與生長(zhǎng)抑制毒性結(jié)果一致（表1 和表2）。此外，ZnO NPs 和 TiO2NPs 二元混合物誘導(dǎo)的 ROS 水平也顯著高于對(duì)照組，說明氧化損傷效應(yīng)也可能是二元混合物對(duì)淡水綠藻產(chǎn)生毒性的作用機(jī)制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)二元混合物誘導(dǎo)的ROS 水平介于ZnO NPs 和TiO2NPs 誘導(dǎo)的ROS 水平之間，表明這兩種ENPs 間的相互作用可能調(diào)節(jié)了各自誘導(dǎo)藻細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

2.5 聯(lián)合藻毒性的預(yù)測(cè)

為了滿足對(duì)混合污染物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的需要，定量預(yù)測(cè)混合污染物的聯(lián)合毒性已成為生態(tài)毒理研究的一項(xiàng)重要工作[39?40]。本文應(yīng)用混合毒理研究中兩種最常用的模型，即IA 和CA 模型預(yù)測(cè)ZnO NPs 和TiO2NPs 對(duì)兩種淡水綠藻的聯(lián)合毒性。如圖8 所示，對(duì)于斜生柵藻，IA 模型預(yù)測(cè)的CRCs 適度的偏離了實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs，而CA 模型預(yù)測(cè)的CRCs 嚴(yán)重偏離了實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs。同時(shí)，IA 模型預(yù)測(cè)的CRCs 位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs 的置信區(qū)間內(nèi)，而CA 模型預(yù)測(cè)的CRCs位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs 的預(yù)測(cè)區(qū)間之外，這表明IA 模型可有效預(yù)測(cè)ZnO NPs 和TiO2NPs 的聯(lián)合毒性，且預(yù)測(cè)能力遠(yuǎn)高于CA 模型。此外，IA 模型預(yù)測(cè)的CRCs位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs 的左側(cè)，表明IA 模型高估了該二元混合物的聯(lián)合毒性；而CA 模型預(yù)測(cè)的CRCs 位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs 的右側(cè)，表明CA 模型低估了該二元混合物的聯(lián)合毒性。由表1 可知，對(duì)于斜生柵藻，IA 模型預(yù)測(cè)的EC50值在24 h 時(shí)與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值無(wú)顯著差異，而在 48、72、96 h 時(shí) IA 模型預(yù)測(cè)的EC50值顯著低于實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值。同時(shí)CA 模型預(yù)測(cè)的EC50值在不同暴露時(shí)間均高于實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值。這進(jìn)一步說明IA 模型高估了二元混合物對(duì)斜生柵藻的毒性，而CA 模型低估了二元混合物對(duì)斜生柵藻的毒性。對(duì)比不同模型預(yù)測(cè)的EC50值與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值，發(fā)現(xiàn)IA 模型預(yù)測(cè)的EC50值與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值之間的差異明顯小于CA模型預(yù)測(cè)的EC50值與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值之間的差異，說明IA模型的預(yù)測(cè)能力高于CA模型。

如圖9所示，對(duì)于蛋白核小球藻，IA模型和CA 模型預(yù)測(cè)的CRCs均明顯偏離了實(shí)驗(yàn)觀察得到的CRCs。在 24 h 時(shí)，IA 模型和 CA 模型預(yù)測(cè)的 CRCs 均位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs的置信區(qū)間內(nèi)，而在48 h和72 h，IA模型和CA 模型預(yù)測(cè)的CRCs 均位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs的預(yù)測(cè)區(qū)間的邊緣。與斜生柵藻類似，IA 模型預(yù)測(cè)的CRCs 位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs 的左側(cè)，表明IA 模型高估了該二元混合物的聯(lián)合毒性；而CA 模型預(yù)測(cè)的CRCs 位于實(shí)驗(yàn)觀察的CRCs 的右側(cè)，表明CA 模型低估了該二元混合物的聯(lián)合毒性。由表2 可知，對(duì)于蛋白核小球藻，不同的暴露時(shí)間下，IA 模型預(yù)測(cè)的EC50值均顯著低于實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值，同時(shí)CA 模型預(yù)測(cè)的EC50值均高于實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值。這也說明IA 模型高估了二元混合物對(duì)蛋白核小球藻的毒性，而CA 模型低估了二元混合物對(duì)蛋白核小球藻的毒性。對(duì)比不同模型預(yù)測(cè)的EC50值與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值，發(fā)現(xiàn)IA 模型預(yù)測(cè)的EC50值與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值之間的差異明顯小于CA 模型預(yù)測(cè)的EC50值與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值之間的差異，說明IA 模型的預(yù)測(cè)能力高于CA模型。

應(yīng)用CA 模型和IA 模型的前提條件為混合組分具有相似的毒性作用方式[41]和非相似的毒性作用方式[42]，且混合體系的聯(lián)合毒性作用方式為加和。雖然本研究ZnO NPs 和TiO2NPs 的聯(lián)合毒性作用方式隨著混合暴露濃度和暴露時(shí)間的變化而變化，主要表現(xiàn)出加和、協(xié)同及拮抗作用，但目前可有效預(yù)測(cè)ENPs協(xié)同和拮抗作用的混合毒理模型尚屬空白。相比于CA模型，IA 模型對(duì)ZnO NPs 和TiO2NPs聯(lián)合毒性的預(yù)測(cè)能力明顯更高，且IA 模型預(yù)測(cè)的EC50值與實(shí)驗(yàn)觀察得到的EC50值存在較小的差異。因此，IA 模型可作為預(yù)測(cè)ENPs聯(lián)合毒性的預(yù)先防范工具。

3 結(jié)論

（1）在不同的暴露時(shí)間，ZnO NPs 對(duì)斜生柵藻和蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制毒性均明顯高于TiO2NPs。

（2）ZnO NPs 與 TiO2NPs 對(duì)斜生柵藻的聯(lián)合毒性作用方式在混合暴露濃度小于1 mg·L?1時(shí)表現(xiàn)為加和，而在混合暴露濃度大于1 mg·L?1時(shí)表現(xiàn)為拮抗。

（3）二元混合物對(duì)蛋白核小球藻在暴露時(shí)間為24 h時(shí)的聯(lián)合毒性作用方式表現(xiàn)為協(xié)同，而在48 h和72 h時(shí)的聯(lián)合毒性作用方式表現(xiàn)為拮抗。

（4）ZnO NPs 和 TiO2NPs 對(duì)淡水綠藻的聯(lián)合毒性機(jī)制為納米顆粒誘導(dǎo)ROS 生成，從而引起藻細(xì)胞氧化應(yīng)激效應(yīng)。

（5）在不同暴露時(shí)間下，獨(dú)立作用模型對(duì)ZnO NPs 和TiO2NPs 聯(lián)合毒性的預(yù)測(cè)能力強(qiáng)于濃度加和模型。