降解水稻秸稈細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

梅新蘭，鄭海平，李水仙，楊天杰，江高飛，韋中，徐陽(yáng)春，沈其榮

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院；江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省有機(jī)固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心；資源節(jié)約型肥料教育部工程研究中心；國(guó)家有機(jī)類肥料工程技術(shù)研究中心，南京 210095）

提高秸稈生物腐解的效率是水稻等大宗農(nóng)作物秸稈直接還田利用研究的熱點(diǎn)[1]。細(xì)菌和真菌是秸稈中木質(zhì)纖維素降解的主要參與者，如芽孢桿菌、纖維桿菌等細(xì)菌通過(guò)大量富集、膨脹和分泌纖維素酶來(lái)破壞和分解秸稈；木霉和青霉等真菌通過(guò)菌絲的物理作用和分泌大量纖維素酶實(shí)現(xiàn)秸稈降解[1?2]。近年來(lái)，微生物降解秸稈研究發(fā)展迅速，但自然條件下秸稈的生物腐解速率依然較慢，其生物降解效率仍需提高[2]。一方面，秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等高分子物質(zhì)，它們之間通過(guò)氫鍵和共價(jià)鍵連接成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使纖維素降解相關(guān)酶難以直接接觸到木質(zhì)纖維素，從而影響降解效果[3]；另一方面，秸稈降解需要細(xì)菌、真菌等多種微生物及其分泌的纖維素酶相互協(xié)同發(fā)揮作用，而單一菌株通常難以完成如此復(fù)雜的生化過(guò)程，如真菌菌絲對(duì)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的破壞可幫助細(xì)菌定殖，細(xì)菌對(duì)木質(zhì)纖維素的改性更有利于真菌纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維素的有效降解[4?5]。大量研究表明，不同微生物菌株組合的降解效果比單一菌株好[6]。因此，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注不同降解微生物之間的復(fù)配，探究復(fù)合菌系在秸稈降解過(guò)程中發(fā)揮的協(xié)同作用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在秸稈降解復(fù)合菌系方面的研究取得了系列進(jìn)展。王春芳等[7]發(fā)現(xiàn)從豬糞?水稻秸稈堆肥中篩選出的復(fù)合菌系中細(xì)菌菌株種類更為豐富，分解纖維素的能力更強(qiáng)。KAUSAR 等[8]將8 株高效降解真菌進(jìn)行兩兩組合，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系降解水稻秸稈的效果優(yōu)于單菌，其中黑曲霉和綠色木霉的組合降解率最高。當(dāng)前，復(fù)合菌系主要通過(guò)直接篩選和降解菌人工組合的方式獲得。直接篩選的優(yōu)勢(shì)在于維持了復(fù)合菌系成員間的協(xié)同關(guān)系，降解效果穩(wěn)定，菌株 組 成 也 相 對(duì) 復(fù) 雜 ，如 復(fù) 合 菌 系 GF ? 系 列[9?10]、RWS1[11]和LDC[12]等。降解菌人工組合的優(yōu)勢(shì)在于將功能菌株進(jìn)行重新組合，可針對(duì)性地提高秸稈的降解效果，如復(fù)合菌系F1[13]、T8[14]和G[9]等。盡管人工構(gòu)建的復(fù)合菌系種類較為豐富，但主要是細(xì)菌或真菌的組合，僅有少量細(xì)菌?真菌的組合。如夏強(qiáng)[15]發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌、黑曲霉和綠色木霉組成的細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶的能力優(yōu)于單一菌株，復(fù)合菌系顯著提高了降解水稻、玉米和小麥秸稈的能力。細(xì)菌?真菌組成的復(fù)合菌系其菌株的種類、豐度較高，菌株產(chǎn)酶具有協(xié)同作用，因此提高了秸稈中纖維素的降解率[16]。目前，在構(gòu)建細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系降解秸稈的研究中，對(duì)于菌株組合方式和種類對(duì)復(fù)合菌系降解效果和產(chǎn)酶活性影響的認(rèn)識(shí)還不夠深入，需開(kāi)展進(jìn)一步研究。為此，本研究從腐解的水稻秸稈中篩選出降解能力較強(qiáng)的細(xì)菌和真菌，構(gòu)建降解菌的全組合，探究各組合降解水稻秸稈的效果和產(chǎn)酶活性，最后解析產(chǎn)酶活性與秸稈降解效果之間的關(guān)系及其貢獻(xiàn)程度，篩選獲得高效降解水稻秸稈的降解菌組合，為水稻秸稈資源化利用中復(fù)合菌系的構(gòu)建研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 水稻秸稈

水稻秸稈采自南京市后村。用清水將水稻秸稈表面塵土洗凈，晾干，切成2~3 cm的秸稈段，保存?zhèn)溆?。將晾干的水稻秸稈段?%NaOH溶液中浸泡24 h，然后80 ℃恒溫水浴20 min，用清水反復(fù)沖洗至pH為中性，65 ℃烘干，粉碎過(guò)30目篩，制備成水稻秸稈粉備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

使用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加抗生素或水稻秸稈粉用于水稻秸稈降解菌的篩選和培養(yǎng)等[17]。細(xì)菌富集培養(yǎng)基、真菌富集培養(yǎng)基分別用于水稻秸稈降解細(xì)菌、真菌的富集篩選[18]；LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基分別用于秸稈降解細(xì)菌、真菌的純化[17]；產(chǎn)酶培養(yǎng)基[19]和羧甲基纖維素（CMC）?剛果紅培養(yǎng)基[20]用于水稻秸稈降解菌產(chǎn)酶活性的檢測(cè)。培養(yǎng)基制備完成后，置于115 ℃下高壓蒸汽滅菌30 min備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 秸稈降解細(xì)菌和真菌的分離篩選

將1.0 g 自然腐解的水稻秸稈置于三角瓶中，加入 90 mL 無(wú)菌水，室溫 170 r·min?1振蕩 1 h 后靜置 30 min，制備懸浮液。將懸浮液分別涂布在細(xì)菌富集培養(yǎng)基和真菌富集培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)2~3 d，真菌培養(yǎng)3~4 d，待長(zhǎng)出明顯菌落后隨機(jī)篩選菌株。細(xì)菌在LB 培養(yǎng)基中連續(xù)劃線培養(yǎng)，純化3 次，獲得秸稈降解細(xì)菌分離株的培養(yǎng)液，加入30%甘油保存于?80 ℃超低溫冰箱中備用。真菌在PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)挑選菌絲，分離純化3 次，獲得秸稈降解真菌孢子的懸浮液，置于30%甘油管中，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 秸稈降解細(xì)菌和真菌的菌株鑒定

以分離得到的水稻秸稈降解細(xì)菌和真菌為對(duì)象，參考細(xì)菌、真菌基因組提取試劑盒的使用說(shuō)明（OME?GA公司），分別提取細(xì)菌和真菌基因組DNA，置于?80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩７謩e采用通用引物27F/1492R[21]和 ITS1/ITS4[22]擴(kuò)增細(xì)菌的 16S rRNA 基因序列和真菌的基因間隔區(qū)序列（ITS），對(duì)水稻秸稈降解菌進(jìn)行分子鑒定。細(xì)菌和真菌的通用引物序列分別為 27F：5′ ? AGAGTTTGATCATGGCTCAG ? 3′ 和1492R：5′?TACGGTTACCTTGTTACGACTT ?3′；ITS1：5′ ? GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG ? 3′ 和ITS4：5′?TCCTCCGCTTATTGATATGC?3′。采用Takara PCR 擴(kuò)增試劑盒 50 μL 反應(yīng)體系：DNA 模板 1μL，2.5 mmol·L?1dNTP 4 μL，1 mmol·L?1引物各1 μL，10× Loading Buffer 5 μL，25 mmol·L?1MgCl23 μL，5 U·μL?1Taq 酶 0.5 μL，ddH2O 34.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃變性 30 s，退火溫度 52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將細(xì)菌 16S rRNA 序列和真菌ITS 序列的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生物工程有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，選取相似性>99.5% 的序列在MEGA7 軟件（https：//www.megasoftware.net）中 構(gòu) 建 Neighbor ?Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 秸稈降解率的檢測(cè)

細(xì)菌細(xì)胞懸浮液或真菌孢子懸浮液的制備：將保存的細(xì)菌、真菌分離株分別在LB 培養(yǎng)基平板或PDA培養(yǎng)基中30 ℃活化復(fù)蘇2~3 d。細(xì)菌挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng)，制備成1.0×107cfu·mL?1的細(xì)胞懸浮液[17]；真菌挑取活化后的孢子接種到水稻秸稈粉培養(yǎng)基中產(chǎn)孢，用無(wú)菌生理鹽水收集真菌孢子，制備成1.0×107cfu·mL?1的孢子懸浮液[13]。

按照1%（V∶V）比例[13，17]，接種1 mL細(xì)菌細(xì)胞懸浮液或者真菌孢子懸浮液到含有100 mL 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，以秸稈段（5 g）為唯一碳源，置于恒溫?fù)u床中發(fā)酵，條件為30 ℃、170 r·min?1。連續(xù)培養(yǎng)4 d 后，取少量培養(yǎng)液用于提取粗酶液、測(cè)定酶活性；連續(xù)培養(yǎng)8 d 后，取發(fā)酵秸稈段殘?jiān)脽o(wú)菌水反復(fù)沖洗干凈，65 ℃烘干8 h稱質(zhì)量，計(jì)算秸稈降解率（D）：

式中：W0為對(duì)照秸稈殘?jiān)少|(zhì)量，g；W為處理秸稈殘?jiān)少|(zhì)量，g。各處理重復(fù)3次。

1.2.4 纖維素酶活的測(cè)定

取 1.2.3 中連續(xù)培養(yǎng) 4 d 的發(fā)酵液 2 mL，10 000 r·min?1離心5 min 收集上清液，即得粗酶液，用于濾紙酶活性的測(cè)定。采用DNS比色法[23]，分別測(cè)定發(fā)酵液中濾紙酶（FPase）、纖維素內(nèi)切酶（CMCase）和木聚糖酶（Xylanase）的活性。將1 min 內(nèi)水解生成1 μmol 還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活性單位（U）。將3種酶活性Z?score標(biāo)準(zhǔn)化后的總和定義為總酶活性。

1.2.5 細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系的構(gòu)建

通過(guò)秸稈降解率和濾紙酶活性評(píng)價(jià)，分別篩選獲得2 株降解秸稈能力較好的細(xì)菌和真菌。通過(guò)平板對(duì)峙和牛津杯試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4 株菌株之間不存在拮抗作用，具有良好的兼容性，適合進(jìn)行菌株組合。利用1.2.3 中的方法，分別制備細(xì)菌細(xì)胞懸浮液和真菌孢子懸浮液，并將4 株秸稈降解菌進(jìn)行全組合復(fù)配：按照各株菌等頻率出現(xiàn)和等比例混合的原則，構(gòu)建菌株豐富度（多樣性水平）為1、2、3、4 的復(fù)合菌系。復(fù)合菌系豐富度由低到高的組合數(shù)分別為4、6、4、1，共得到15 種組合，每個(gè)組合重復(fù)3 次并依次編號(hào)（表1）。復(fù)合菌系對(duì)水稻秸稈的相對(duì)降解率和3 種纖維素酶活性的檢測(cè)分別參考1.2.3 和1.2.4 中描述的方法。

表1 秸稈降解細(xì)菌?真菌的全組合復(fù)配Table 1 Compositions of straw degradation communities using bacterial and fungal strains

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果采用R 4.0（https：//www.r?project.org）分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)tidyverse、reshape2和tidyr 包進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化處理，采用stats 和ggpubr 包進(jìn)行Z?score 標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)計(jì)分析，利用ggplot2 進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異法配對(duì)比較（LSD 檢驗(yàn)），顯著性水平為0.05。相關(guān)性分析采用線性回歸（y=ax+b）評(píng)價(jià)檢測(cè)指標(biāo)隨菌株多樣性或秸稈相對(duì)降解率改變的變化趨勢(shì)（a為斜率，b為截距），采用多元回歸（y=ax1+bx2+cx3+d）評(píng)價(jià)不同酶活性對(duì)秸稈降解率的影響，進(jìn)而明確發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻秸稈降解細(xì)菌和真菌的篩選與鑒定

以水稻秸稈粉為唯一碳源，通過(guò)室內(nèi)富集、分離、純化，從腐解的水稻秸稈中篩選獲得8 株水稻秸稈降解菌（圖1），包括4 株細(xì)菌（BB4、BB18、JB7 和JF7）和4 株真菌（JH、ZA、ZB 和ZL）。16S rRNA 基因與ITS 序列測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1A）表明，細(xì)菌分離株 BB4、BB18、JB7 和 JF7 分別與類香味菌屬（Myroi?des）、普羅威登斯菌屬（Providencia）、短小芽孢桿菌（Lysinibacillus）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）基因的相似度超過(guò)99.5%，命名為玄武類香味菌（Myroides odoratimimusBB4）、雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeriBB18）、球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericusJB7）和睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas tes?tosteroniJF7）。真菌分離株JH 和ZL 與曲霉屬真菌ITS 序列高度同源，相似度超過(guò)99.6%，分別命名為黑曲霉（Aspergillus nigerJH）和煙曲霉（Aspergillus fumig?atusZL）；真菌分離株ZA 和ZB 與青霉屬（Penicillium）和漆斑霉屬（Striaticonidium）真菌ITS 序列相似度超過(guò)99.8%，分別命名為草酸青霉（Penicillium oxalicumZA）和包圍漆斑菌（Striaticonidium cinctumZB）。

2.2 細(xì)菌和真菌分離菌株的秸稈降解效果和濾紙酶活性評(píng)價(jià)

水稻秸稈降解試驗(yàn)表明，細(xì)菌、真菌不同分離株之間的降解能力存在顯著差異，且真菌降解水稻秸稈的能力遠(yuǎn)高于細(xì)菌（圖1B）。不同真菌分離株對(duì)水稻秸稈的降解率之間的差異顯著（F3，8=177.0，P<0.000 1），ZA 最高（24.18%±1.71%），ZL 較高（17.39%±1.00%），JH次之（9.51%±1.01%），ZB最低（4.60%±0.32%）。細(xì)菌分離株的水稻秸稈降解率之間同樣存在顯著差異（F3，8=4.3，P<0.044 2），以 JB7（1.33%±0.40%）和BB18（1.28%±0.33%）最高，且二者之間差異不顯著（P>0.05），BB4 略低（0.96%±0.09%），且與BB18 差異不顯著（P>0.05），JF7最低（0.57%±0.26%）。

濾紙酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，不同細(xì)菌和真菌分離株濾紙酶活性差異顯著，其中真菌分離株的濾紙酶活性較高（圖1C）。真菌分離株之間的濾紙酶活性差異較大（F3，8=189.0，P<0.000 1），而細(xì)菌分類株之間的濾紙酶活性差異相對(duì)較?。‵3，8=15.0，P<0.001）。其中，真菌分離株ZA 的濾紙酶活性最高，為（12.73±1.26）U·mL?1，ZL 次之，為（9.99±0.42）U·mL?1，二者間差異顯著（P<0.05）；ZB 和 JH 最低，且二者間差異不顯著（P>0.05），分別為（1.66±0.42）U·mL?1和（1.44±0.41）U·mL?1。細(xì)菌分離株 JB7 和 BB18 的濾紙酶活性最高，分別為（1.63±0.02）U·mL?1和（1.53±0.01）U·mL?1，二者間差異不顯著（P>0.05）；BB4 略低，為（1.15±0.31）U·mL?1，JF7最差，為（0.85±0.05）U·mL?1。綜上，細(xì)菌分離株雷氏普羅威登斯菌BB18、球形賴氨酸芽孢桿菌JB7 和真菌分離株草酸青霉ZA、煙曲霉ZL 具有較強(qiáng)的水稻秸稈降解能力（圖1B），以及較高的濾紙酶活性（圖1C），因此選擇上述4株秸稈降解菌進(jìn)行細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系的構(gòu)建。

2.3 復(fù)合菌系的菌株多樣性與秸稈降解效果和產(chǎn)酶活性之間的關(guān)系

4 株降解菌全組合復(fù)配的秸稈降解試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，復(fù)合菌系對(duì)水稻秸稈的降解率與降解菌多樣性成正相關(guān)關(guān)系（y=0.35x?0.75，R2=0.562 4，P<0.000 1）。隨降解菌種類的增加，復(fù)合菌系的相對(duì)降解率逐漸增大（F3，41=8.2，P=0.000 2）。復(fù)合菌系降解水稻秸稈的能力均優(yōu)于單菌（12.06%±10.29%，P<0.05），其中以4株菌的組合對(duì)水稻秸稈的降解率最高（31.40%±1.01%，P<0.01），較單菌的平均降解率提高了1.6 倍（圖2A）。2 株與3 株菌的組合降解水稻秸稈的能力相當(dāng)（20.20%~21.03%，P>0.05），較單菌的降解率提高了67.50%~74.38%（圖2A）。因此，復(fù)合菌系的水稻秸稈降解能力可能存在菌株多樣性效應(yīng)。

為探究復(fù)合菌系秸稈降解能力多樣性效應(yīng)形成的原因，考察了與3 種秸稈中木質(zhì)纖維素降解過(guò)程相關(guān)的酶的活性。結(jié)果表明，復(fù)合菌系產(chǎn)濾紙酶、纖維素內(nèi)切酶和木聚糖酶的活性也具有多樣性效應(yīng)，即3種酶的活性隨復(fù)合菌系菌株多樣性的增加而增加，但變化程度有所差異（圖2）。隨菌株多樣性的增加，復(fù)合菌系木聚糖酶的活性增幅最大（y=8.99x?2.36，R2=0.504 6，P=0.000 4），濾紙酶的增幅次之（y=0.35x?0.76，R2=0.316 7，P=0.034 0），纖維素內(nèi)切酶增幅最?。▂=0.04x+0.03，R2=0.554 1，P<0.000 1）。不同多樣性復(fù)合菌系之間的纖維素內(nèi)切酶（F3，41=6.2，P=0.001 3）和木聚糖酶（F3，41=5.8，P=0.002 1）的活性存在顯著差異，而濾紙酶活性的差異不顯著（F3，41=1.8，P=0.166 0）。LSD 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3、4 種菌株組合的纖維素內(nèi)切酶（164.59~189.03 U·mL?1）和木聚糖酶（2.55×103~2.90×103U·mL?1）的活性均較高，且均不存在顯著差異（P>0.05），較單菌的平均酶活性分別提高了1.15~1.47 倍和2.67~3.17 倍；兩兩組合與單菌產(chǎn)纖維素內(nèi)切酶（110.13 U·mL?1）和木聚糖酶（1.38×103U·mL?1）的活性均較低，且均不存在顯著差異（P>0.05）。因此，秸稈降解能力多樣性效應(yīng)，可能是由復(fù)合菌系產(chǎn)酶活性多樣性效應(yīng)引起的。綜上，4 株細(xì)菌?真菌組成的復(fù)合菌系對(duì)水稻秸稈的降解能力和總酶活力較強(qiáng)，命名為BF1。

2.4 復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶活性與秸稈降解效果之間的關(guān)系

相關(guān)分析結(jié)果（圖3）表明，復(fù)合菌系對(duì)水稻秸稈的降解能力與其產(chǎn)3 種纖維素酶的活性呈正相關(guān)關(guān)系，即酶活性越強(qiáng)，復(fù)合菌系對(duì)水稻秸稈的降解效果越好。其中，復(fù)合菌系的秸稈降解率隨纖維素內(nèi)切酶活性的增加，增長(zhǎng)幅度最大（y=0.87x+8.54，R2=0.708 2，P<0.000 1）；隨濾紙酶活性的增加，增長(zhǎng)幅度次之（y=0.53x+13.29，R2=0.536 6，P=0.000 2）；隨木聚糖酶活性的增加，增長(zhǎng)幅度最?。▂=0.22x+15.28，R2=0.504 6，P=0.000 4）。通過(guò)Z?score 標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算秸稈降解率與總酶活性（標(biāo)準(zhǔn)化后3 種酶活的總和）并進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系的降解能力與總酶活性也呈正相關(guān)關(guān)系，即復(fù)合菌系秸稈降解效果隨總酶活性的增加而顯著增強(qiáng)（R2=0.587 3，P<0.000 1）。通過(guò)進(jìn)一步多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系的秸稈降解能力與3 種酶的活性密切相關(guān)（F3，41=18.1，R2=0.569 6，P<0.000 1），其中纖維素內(nèi)切酶（F3，41=48.4，P<0.000 1）和木聚糖酶（F3，41=6.1，P<0.017 4）的活性對(duì)復(fù)合菌系降解水稻秸稈能力的貢獻(xiàn)較大，而濾紙酶活性的貢獻(xiàn)較小（F3，41=0.7，P=0.515 9）。上述結(jié)果說(shuō)明，纖維素內(nèi)切酶和木聚糖酶是復(fù)合菌系降解水稻秸稈的重要驅(qū)動(dòng)力。

3 討論

通過(guò)4 株秸稈降解菌的全組合復(fù)配，構(gòu)建菌株多樣性由低到高的15種細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系，評(píng)價(jià)了菌株多樣性對(duì)復(fù)合菌系降解水稻秸稈的效果，分析了3種與秸稈木質(zhì)纖維降解相關(guān)的酶活性受到的影響，探究了復(fù)合菌系秸稈降解效果與產(chǎn)酶活性之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系對(duì)水稻秸稈的降解效果優(yōu)于單一降解菌株，且復(fù)合菌系的秸稈降解能力隨菌株多樣性的增加而顯著增強(qiáng)。這與其他復(fù)合菌系降解秸稈效果的研究結(jié)果相似[24-26]，例如，江高飛等[13]通過(guò)對(duì)5 株真菌復(fù)配研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系對(duì)玉米秸稈的降解效果優(yōu)于單一菌株，且降解效果隨降解真菌多樣性的增加而提高，真菌復(fù)合菌系對(duì)秸稈的降解率也具有多樣性效應(yīng)。但也有研究與本研究結(jié)果不同，如李靜等[25]利用15 株秸稈降解細(xì)菌進(jìn)行復(fù)配研究，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系降解玉米秸稈的能力并非隨細(xì)菌種類的增加而增加，其中多樣性為3 和5 的3 個(gè)組合的秸稈降解效果甚至低于鏈霉菌、不動(dòng)桿菌、類芽孢桿菌和芽孢桿菌等降解菌單獨(dú)降解玉米秸稈的能力；魏蔚等[26]將6 株降解真菌與蜂房芽孢桿菌復(fù)配成多樣性為4 和7 的兩種復(fù)合菌系，比較發(fā)現(xiàn)4 種降解菌組合降解小麥秸稈的能力顯著高于7 種降解菌組合，但這兩種組合產(chǎn)酶的能力尚不清楚。

細(xì)菌和真菌等微生物在秸稈降解過(guò)程的作用機(jī)理不同，因此能夠通過(guò)協(xié)同作用完成秸稈的降解[6]。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系的產(chǎn)酶活性具有多樣性效應(yīng)，增加菌株的種類可顯著增強(qiáng)復(fù)合菌纖維素降解酶的活性，協(xié)同提高降解水稻秸稈的效果。同樣，LU 等[27]發(fā)現(xiàn)15 株降解菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的濾紙酶活性較低，通過(guò)不同組合方式復(fù)配后提高了降解濾紙的能力，其中6 株菌的組合降解率達(dá)26.3%。江高飛等[13]同樣發(fā)現(xiàn)真菌復(fù)合菌系的酶活性也具有多樣性效應(yīng)，且濾紙酶和纖維素內(nèi)切酶是復(fù)合菌株降解玉米秸稈的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。然而，本研究發(fā)現(xiàn)纖維素內(nèi)切酶和木聚糖酶對(duì)復(fù)合菌系秸稈降解效果的貢獻(xiàn)顯著，這可能是玉米秸稈與水稻秸稈中纖維素種類和豐度的差異所致。本研究構(gòu)建的復(fù)合菌系BF1對(duì)水稻秸稈的平均降解率為31.40%，較單菌的平均降解率提高了1.6 倍，纖維素酶活力提高了1~3 倍。張必周等[9]從GF 自然復(fù)合菌系（降解率為20.51%~34.05%）中篩選得到11 株降解菌進(jìn)行組合，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系的降解能力優(yōu)于單菌，其中復(fù)合菌系G 的秸稈降解率為48.56%，較不加菌的對(duì)照提高了21.56%，酶活性提高了36.35%。諸葛榮夏[28]將6 株降解菌進(jìn)行有效組合，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系W?2 的降解率達(dá)32.51%，較單菌提高了2 倍，除木素過(guò)氧化物酶無(wú)明顯差異外，其他纖維素酶均提高了2 倍以上。此外，優(yōu)化復(fù)合菌系中菌株的比例能夠提高復(fù)合菌系的降解效果，如枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌的比例為 1∶1∶2∶1 時(shí)，細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系產(chǎn)酶活性最大，降解效果最好[29]。因此，可通過(guò)調(diào)整菌株的比例和培養(yǎng)條件等，探索提高細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系產(chǎn)酶活性和降解效果的最佳方法，為服務(wù)生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。此外，環(huán)境微生物種類復(fù)雜，建議菌株篩選鑒定、保藏管理和生產(chǎn)應(yīng)用上應(yīng)當(dāng)兼顧菌種生物安全的問(wèn)題。

4 結(jié)論

（1）本研究將篩選獲得的秸稈降解能力較好的兩株細(xì)菌和兩株真菌，通過(guò)全組合的方式構(gòu)建出不同組合的復(fù)合菌系，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌系的降解率和3 種纖維素酶活性均隨菌株種類的增加而提高。

（2）明確了復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶活性與秸稈降解效果之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)纖維素內(nèi)切酶和木聚糖酶是復(fù)合菌系降解水稻秸稈的主要驅(qū)動(dòng)因素。

（3）篩選獲得了一組具有潛在應(yīng)用前景的細(xì)菌?真菌復(fù)合菌系BF1（由雷氏普羅威登斯菌BB18、球形賴氨酸芽孢桿菌JB7、草酸青霉ZA和煙曲霉ZL組成），其秸稈降解率較單菌提高了1.6倍，酶活性增加了1~3倍。在復(fù)合菌系BF1的實(shí)際應(yīng)用中，還應(yīng)考慮優(yōu)化菌株的配比和劑量，以提高復(fù)合菌系的秸稈降解率。