在線SFE?SFC?MS/MS在玉米粉農(nóng)藥多殘留分析中的應用

張丹陽，賈昊，史小萌，王策，鄧凱，耿岳*，劉瀟威*，韋紅

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.吉林農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，長春 130000；3.華標（天津）科技有限責任公司，天津300392）

玉米是我國重要的糧食作物。根據(jù)世界糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)，2019 年我國玉米總產(chǎn)量和總種植面積分別占世界總量的43%和36%[1]。但在玉米種植過程中會受到病蟲害的危害，為了控制病蟲害以提高產(chǎn)量[2?3]，越來越多的殺蟲劑、除草劑和殺菌劑被使用[4]，從而造成了玉米中的農(nóng)藥殘留問題。為了確保玉米的質(zhì)量安全，為我們的飲食健康保駕護航，我國食品安全國家標準（GB 2763—2019）中明確規(guī)定了玉米中農(nóng)藥最大殘留限量標準。

食品中農(nóng)藥殘留的分析方法主要分為樣品前處理和儀器分析[5]。樣品前處理主要有索式提取法、固相萃取法、基質(zhì)固相分散萃取法、加速溶劑萃取法、液液萃取法、QuEChERS（Quick easy cheap effective rug?ged safe）法等，其中QuEChERS 法在玉米等糧谷類基質(zhì)農(nóng)藥殘留分析中得到越來越廣泛的應用。李同賓等[6]基于QuEChERS?液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS/MS）建立了同時檢測玉米粉中41 種常見農(nóng)藥殘留的分析方法；李菊穎等[7]建立了玉米粉中吡蟲啉、三唑酮、乙草胺與異丙甲草胺的QuEChERS 結(jié)合LC?MS/MS 法；葉倩等[8]開發(fā)了玉米粉中乙草胺、異丙甲草胺和三唑酮殘留檢測的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC?MS/MS）法；HE等[9]建立了糧谷中200 余種農(nóng)藥殘留的GC?MS/MS 檢測方法。但上述這些前處理方法的溶劑消耗量大、操作繁瑣[10]，例如QuEChERS 法提取時需要15~20 mL乙腈，且需經(jīng)過稱量、振搖提取、離心、凈化、再離心等多個步驟。相對而言，在線超臨界流體萃取具有節(jié)省有機溶劑、操作簡便等優(yōu)點，將樣品稱量至萃取池并添加分散劑混勻后即可上機進行自動化在線萃取，且萃取時通常有機溶劑的消耗量低于5 mL。然而該方法尚未應用于玉米粉中農(nóng)藥多殘留分析。

玉米粉中農(nóng)藥殘留的儀器分析方法多為LC?MS/MS[6?7]、GC ? MS/MS[8?9]等 。 目 前 ，超 臨 界 流 體 色 譜（SFC）與液相色譜（LC）相比，超臨界二氧化碳流體作為流動相具有低黏度和高分子擴散性，可以提高分析效率，降低有機溶劑的消耗[11]。此外，搭配串聯(lián)質(zhì)譜后，超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SFC?MS/MS）顯示出良好的選擇性和靈敏度[12]。

目前，尚無研究應用在線超臨界流體萃取?超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SFE?SFC?MS/MS）開展食品中農(nóng)藥多殘留分析。本研究針對現(xiàn)有玉米粉中農(nóng)藥多殘留分析方法存在的不足，結(jié)合超臨界流體萃取、超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)點，建立了用于分析玉米粉中農(nóng)藥多殘留的在線SFE?SFC?MS/MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Nexera 超臨界流體萃取儀（日本島津公司）、Nex?era UC 超臨界流體色譜儀（日本島津公司）；Shim?pack UC?X?RP 色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm，日本島津公司）。渦旋振蕩器（Thermo，美國）；高速冷凍離心機（Heal Force，中國香港）；Milli?Q 凈水系統(tǒng)（德國MILLIPURE）；食品粉碎機（中國奧克斯集團有限公司）；萬分之一天平（SQP，賽多利斯科學儀器北京有限公司）。

色譜純甲醇、異丙醇、乙腈購于美國Fisher Scien?tific 公司；無水乙醇購于中國天津市康科德科技有限公司；95%甲酸、LC?MS 級甲酸銨（純度≥99%）、無水硫酸鎂（純度≥99.5%）購于美國Sigma?Aldrich 公司；超純水由實驗室Milli?Q 制備。71種農(nóng)藥標準品購于美國Chemservice 和德國Dr.Ehrenstorfer 公司，純度均大于98%?？瞻子衩追圪徸蕴旖蚴心吵?。此外，另從河南省玉米主產(chǎn)地采集10 份玉米粉樣品用于殘留測定。

1.2 標準溶液配制

精確稱取71 種農(nóng)藥的標準品，用色譜純乙腈分別配制1 000 mg·L?1標準儲備溶液，?20 ℃儲存。色譜純乙腈稀釋配制10 mg·L?1混合標準工作溶液。

1.3 超臨界流體萃?。⊿FE）

以玉米粉為基質(zhì)，農(nóng)藥混標添加濃度為50 μg·kg?1對超臨界流體萃取條件進行優(yōu)化。在SFE提取階段，優(yōu)化5 個變量，具體包括：提取劑的組成、比例、萃取時間、動態(tài)萃取流速、分散劑無水硫酸鎂和樣品的比例。通過單因素變量法，控制其他條件不變，只改變單個因素以摸索最優(yōu)的萃取條件，基礎(chǔ)條件如下：萃取劑組成及比例為95%超臨界二氧化碳流體和5%含0.1%甲酸的甲醇溶液，動態(tài)萃取流速為5 mL·min?1，靜態(tài)和動態(tài)萃取時間為3 min，分散劑無水硫酸鎂和樣品比例為1∶1（m/m）。

（1）提取劑的組成：95%超臨界二氧化碳流體和5%的甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、含1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液、含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液。

（2）乙醇和超臨界流體二氧化碳的比例：1∶99、3∶97、5∶95、7∶93、9∶91（V/V），即乙醇含量為1%、3%、5%、7%、9%的超臨界流體二氧化碳。

（3）動態(tài)萃取流速：1、2、3、4、5 mL·min?1。

（4）靜態(tài)和動態(tài)萃取時間：1、2、3、4、5 min。

（5）分散劑無水硫酸鎂和樣品的比例（m/m）：1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1。

每個處理3 個平行。通過在線SFE?SFC?MS/MS進行檢測，計算回收率。

1.4 超臨界流體色譜（SFC）

色譜柱為 Shim?pack UC?X RP（3 μm，2.1 mm×150 mm），進樣量為2 μL，背壓調(diào)節(jié)器 B（Back pres?sure regulator B，BPRB）壓力為40 MPa，流動相A 為超臨界二氧化碳流體，流動相B 為改性劑。對改性劑、流速、背壓調(diào)節(jié)器A（BPRA）壓力、柱溫、柱后補償溶劑及流速等條件進行優(yōu)化，基礎(chǔ)色譜條件為：改性劑為含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液，流速為 1.5 mL·min?1，BPRA 壓力為 14.8 MPa，柱溫為40 ℃，柱后補償溶劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液，柱后補償溶劑流速為0.1 mL·min?1。采用單因素變量法，保持其他條件不變，分別對以下條件進行優(yōu)化：

（1）改性劑：甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、含0.01%甲酸和1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸和 2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含 1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液、含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液。

（2）流速：1.3、1.5、1.8、2.0、2.2、2.6、3.0 mL·min?1。

（3）BPRA 壓力：10.0、12.0、14.0、14.8、16.0、18.0 MPa。

（4）柱溫：30、35、40、45、50 ℃。

（5）柱后補償溶劑：甲醇、含0.1%甲酸和5 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含 0.1% 甲酸和 1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液。

（6）柱后補償溶劑流速：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL·min?1。

通過對以上條件的優(yōu)化，考察不同條件對色譜分離效果、目標化合物峰面積的影響。

1.5 質(zhì)譜條件

采用MRM 模式，71 種目標農(nóng)藥的離子對、碰撞能等信息見表1。霧化氣流量3 L·min?1，加熱氣流量10 L·min?1，干燥氣流量10 L·min?1，接口溫度 300 ℃，DL溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃。

1.6 方法學考察

1.6.1 線性、檢出限和定量限

SFE 在線萃取后，作為特殊進樣設備，在線將目標物導入SFC系統(tǒng)分離分析。因此，在考察目標物線性范圍時，使用玉米粉空白基質(zhì)配制9 個農(nóng)藥混標濃度水平的玉米基質(zhì)標準添加樣品（濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg·kg?1），SFE?SFC?MS/MS 上機分析。以峰面積為縱坐標，以與峰面積對應的濃度為橫坐標，得到玉米粉基質(zhì)校準曲線。分別以信噪比S/N 為3 和10 時所對應的71 種農(nóng)藥的濃度作為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。

1.6.2 準確度和精密度

在玉米粉中設置1、10、100 μg·kg?13個農(nóng)藥混標添加水平，每個添加水平5 個平行。按照優(yōu)化后的在線SFE?SFC?MS/MS條件進行分析，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 SFC條件優(yōu)化

2.1.1 改性劑優(yōu)化

超臨界二氧化碳流體屬于非極性流動相，因此對一些中等極性的化合物不能很好地分離。添加改性劑可以提高SFC的分離能力，拓寬其分析范圍。本研究比較了甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇等不同改性劑對目標化合物分離效果的影響。根據(jù)lgKow 大小評估化合物的極性，lgKow 越小，化合物在水相中的溶解度越大，極性越高。在71 種化合物中有67 種可查詢到lgKow 值（表1），其范圍為?1.65~6.37，中位值為2.84，表明本研究中目標化合物的極性范圍較寬。乙醇、異丙醇、正丁醇較甲醇的保留時間都有延后，且異丙醇和正丁醇條件下部分化合物未出峰。甲醇在考察的改性劑中極性最大，流動相極性的調(diào)節(jié)范圍也最寬[12]，因此選擇甲醇作為改性劑。在此基礎(chǔ)上，對不同緩沖體系進行優(yōu)化，考察了不同甲酸、甲酸銨組合及不同濃度對目標化合物響應的影響，如圖1 所示，通過比較不同改性劑緩沖體系與初始緩沖體系作為流動相時目標化合物峰面積，可知只有在含0.1%甲酸的甲醇溶液條件下，所有化合物的峰面積才會大于等于初始緩沖體系條件下目標化合物的峰面積，由此確定含0.1%甲酸的甲醇溶液條件為最優(yōu)條件，以此進行后續(xù)優(yōu)化。

表1 71 種農(nóng)藥及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 71 pesticides and metabolites

續(xù)表1 71種農(nóng)藥及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Continued table 1 Mass spectrometric parameters for 71 pesticides and metabolites

2.1.2 流速優(yōu)化

隨著SFC流速增大，目標化合物的保留時間逐漸前移。由于Shim?pack UC?X RP 色譜柱（5μm）最高耐壓為30 MPa，為延長色譜柱壽命，工作壓力需在20 MPa 以下。本研究中上述色譜柱在1.3~3.0 mL·min?1流速下柱壓可達17.26~23.47 MPa，因此從延緩色譜柱損耗的角度，選擇流速為1.5 mL·min?1，此條件下柱壓可控制在 17.72 MPa 之內(nèi)。并且在1.5 mL·min?1流速下，每針樣品所消耗的改性劑為3.60 mL，對環(huán)境更加友好，因此最終選擇1.5 mL·min?1的流速進行后續(xù)優(yōu)化。

2.1.3 柱溫優(yōu)化

隨著柱溫的升高，超臨界二氧化碳的密度降低[13]，進而削弱了其對目標化合物的洗脫能力，原因可能是隨著柱溫的不斷升高，化合物在柱上的保留得到了有效增強，從而使得化合物的出峰時間后移?？紤]到超臨界二氧化碳的臨界溫度（31.06 ℃）及分離效果，選擇40 ℃作為柱溫進行后續(xù)優(yōu)化。

2.1.4 BPRA背壓優(yōu)化

隨著BPRA 壓力的增加，保留時間逐漸減小，這是由于隨著壓力的增加，二氧化碳的密度增加，進而增強了對目標化合物的洗脫能力[14]。在10.0、12.0、18.0 MPa 壓力下部分化合物未檢出，且在10 MPa 條件下化合物峰大多展寬。在14.0、14.8、16.0 MPa條件下目標物均可出峰，14.8 MPa時目標物在時間窗內(nèi)分布較均勻，且14.8 MPa 為儀器推薦的BPRA 壓力，因此，選擇14.8 MPa進行后續(xù)的條件優(yōu)化。

2.1.5 柱后補償溶劑及流速的優(yōu)化

含0.1%甲酸的甲醇溶液在提高被分析物的電噴霧電離效率上效果最好（圖2a），因此選擇其進一步優(yōu)化流速。當柱后補償溶劑流速為0.05 mL·min?1時，目標化合物的響應最優(yōu)（圖2b）。最終選擇上述兩個條件作為最優(yōu)條件。

2.1.6 確定的SFC條件

通過2.1.1~2.1.5 部分的優(yōu)化，確定最優(yōu)SFC 條件如下：改性劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液，流速為1.5 mL·min?1，BPRA 為 14.8 MPa，柱溫為 40 ℃，柱后補償溶劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液，柱后補償溶劑流速為 0.05 mL·min?1。梯度程序為：0 min，流動相 B 為 2%；0~1 min，流動相B 為3%；1~5 min，流動相B 為4%；5~8 min，流動相B 為6%；8~10 min，流動相B 為10%；10~11 min，流動相B 為24%；11~12 min，流動相B 為40%；12~14 min，流動相B 為50%；14~15 min，流動相B 為50%；15~15.1 min，流動相B 為2%，保持0.4 min。

2.2 SFE條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑組合和比例的優(yōu)化

超臨界二氧化碳流體屬于非極性溶劑，用其萃取中等極性或者極性更強的化合物效果不理想，因此須通過添加其他極性萃取劑改變其極性，進而擴展其萃取化合物的范圍。乙醇與超臨界二氧化碳流體組合的回收率符合要求（圖3A），且其相對標準偏差最低（圖3B）。圖3C和圖3D分別為含1%~9%乙醇的超臨界二氧化碳流體萃取下目標化合物的添加回收結(jié)果，根據(jù)回收率及相對標準偏差最終選擇含有9%乙醇的二氧化碳超臨界流體進行后續(xù)條件的優(yōu)化。

2.2.2 動態(tài)萃取流速優(yōu)化

提取溶劑在動態(tài)萃取時的流速大小會影響目標物的萃取效率[15]。因此，本研究在保證其他萃取條件不變的情況下，考察了1、2、3、4、5 mL·min?15 個動態(tài)萃取流速下目標物的回收率。結(jié)果如圖4A 和圖4B所示，在5 mL·min?1動態(tài)萃取時目標化合物的回收率在80%~120%之間，且相對標準偏差均在20%以下。因此，選擇了5 mL·min?1進行后續(xù)條件優(yōu)化。

2.2.3 靜態(tài)/動態(tài)萃取時間優(yōu)化

在SFE 中萃取劑與樣品基質(zhì)的萃取時間決定了其萃取率，萃取時間越長，萃取率越高。在保持其他條件不變情況下，考察了靜態(tài)/動態(tài)萃取時間（靜態(tài)萃取和動態(tài)萃取時間保持一致，為1、2、3、4、5 min）對目標物提取回收率的影響。圖4C 和圖4D 表明靜態(tài)/動態(tài)萃取時間為5 min 時，目標物的回收率在80%~120%范圍內(nèi)，且方法精密度最優(yōu)。

2.2.4 分散劑無水硫酸鎂和樣品的比例優(yōu)化

本研究考察了分散劑無水硫酸鎂與樣品的不同比例（1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1）對目標農(nóng)藥提取率的影響。不同比例下，目標物的回收率均在60%~120%范圍內(nèi)，最終選擇5∶1的無水硫酸鎂與樣品的比例。

2.2.5 最優(yōu)的SFE條件

通過2.2.1 至2.2.4 的比較分析，確定最優(yōu)SFE 條件如下：準確稱取0.200 0 g玉米粉樣品，將其與1 g無水硫酸鎂混合，再填入萃取池進行萃取，溫度為40 ℃。提取溶劑為超臨界二氧化碳∶乙醇（91∶9，V/V），靜態(tài)萃取和動態(tài)萃取時間均為5 min，動態(tài)萃取流速為5 mL·min?1。此外，圖 5 表明，上述篩選出的最優(yōu) SFE 條件可以兼顧較寬的目標物極性范圍。

2.3 方法有效性驗證

2.3.1 線性、檢測限、定量限

選擇優(yōu)化好的SFE?SFC?MS/MS 條件進行分析，目標化合物的校準曲線呈現(xiàn)良好的線性，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。方法的檢出限和定量限分別為0.003~2.770 μg·kg?1和0.01~8.41 μg·kg?1。

2.3.2 準確度和精密度

玉米粉中 71 種農(nóng)藥在 1、10、100 μg·kg?1時的回收率（相對標準偏差）分別為71.2%~123.4%（2.8%~30.5%）、94.3%~124.6%（4.9%~29.3%）、75.2%~120.4%（1.9%~28.4%），根據(jù)原農(nóng)業(yè)部2386 號公告[16]，當農(nóng)藥添加濃度為1 μg·kg?1時，回收率須介于50%~120%之間，相對標準偏差≤36%；當添加濃度為10 μg·kg?1時，回收率須介于60%~120%之間，相對標準偏差≤32%；當添加濃度為100 μg·kg?1時，回收率須在70%~120%之間，相對標準偏差≤22%。本研究所建立的SFE?SFC?MS/MS方法基本滿足上述要求。

2.3.3 玉米粉實際樣品測定

在玉米樣品中共有吡蟲啉、三環(huán)唑和克百威3 種化合物被檢出，其中，1 號樣品檢出吡蟲啉（1.34 μg·kg?1）和三環(huán)唑（1.15 μg·kg?1），9 號樣品檢出三環(huán)唑（0.89 μg·kg?1），10號樣品檢出克百威（1.41 μg·kg?1）。其殘留濃度均小于2μg·kg?1，符合我國農(nóng)藥殘留限量標準的規(guī)定。

3 結(jié)論

（1）本研究針對玉米粉中71 種農(nóng)藥及代謝物殘留，優(yōu)化超臨界流體色譜及超臨界流體萃取條件，建立了一種高效、靈敏、綠色環(huán)保的在線超臨界流體萃取?超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，在最佳分析條件下，32 min 內(nèi)可以實現(xiàn)對71 種農(nóng)藥殘留的在線提取和精準定性定量分析。

（2）方法驗證結(jié)果表明，建立的在線SFE?SFC?MS/MS 方法具有良好的線性、靈敏度及準確度，并具有萃取效率高、操作簡便、省時、節(jié)省溶劑等優(yōu)點，可以為玉米粉中農(nóng)藥多殘留檢測提供可靠的技術(shù)支撐。