流式淋巴細(xì)胞亞群檢測在癌癥中的臨床應(yīng)用價值及意義

摘要：目的：研究腫瘤患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群的各項指標(biāo)和腫瘤患者臨床信息及預(yù)后的相關(guān)性。方法：選取肺癌、宮頸癌和乳腺癌患者共134例，收集腫瘤患者外周血并用流式細(xì)胞術(shù)檢測和分析外周血中淋巴細(xì)胞亞群7項指標(biāo)，同時收集腫瘤患者的臨床信息，分析兩者是否具有相關(guān)性。結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)肺癌及宮頸癌患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群7項指標(biāo)，其中CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)及CD4/CD8比值同患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)肺癌和宮頸癌早中期患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的數(shù)量較晚期患者明顯增多，提示腫瘤患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的數(shù)量同患者的預(yù)后相關(guān)。

關(guān)鍵詞：淋巴細(xì)胞亞群，流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞毒性T細(xì)胞

【中圖分類號】R4 ? ? ? ? ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）09--04

由于全球人口的增長和老齡化，以及吸煙、不良飲食和久坐等生活方式導(dǎo)致癌癥患者數(shù)量越來越多，全球癌癥負(fù)擔(dān)持續(xù)增加[1]。腫瘤免疫學(xué)研究表明，癌癥的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[2， 3]。其中T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要應(yīng)答形式，在機(jī)體抗腫瘤免疫中起主導(dǎo)作用，能夠識別和清除腫瘤細(xì)胞[4， 5]。流式淋巴細(xì)胞亞群作為一種常規(guī)檢查，是反映細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，在腫瘤免疫監(jiān)測具有重要意義，進(jìn)一步為患者的臨床治療方案提供參考依據(jù)[6， 7]。本研究通過分析患者外周血中CD3陽性T淋巴細(xì)胞，CD4陽性T淋巴細(xì)胞，CD8陽性T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例及絕對數(shù)，并將這些指標(biāo)相結(jié)合，從而評估機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。

1.材料與方法

1.1材料

采集天津市腫瘤醫(yī)院空港醫(yī)院放療科住院患者EDTA抗凝外周血2ml。所有患者采血前均未接受過腫瘤治療，并且具有完整的臨床相關(guān)資料。

1.2實驗方法

取100ul外周血樣本加入流式管中，標(biāo)記CD3/CD19/CD16+CD56/CD45和CD3/CD4/CD8/CD45抗體（Beckman Coulter公司），室溫孵育15分鐘，加入500ul溶血素（Beckman Coulter公司），室溫靜置10分鐘，PBS洗滌細(xì)胞后上機(jī)。流式數(shù)據(jù)用Kaluza軟件（Beckman Coulter公司）進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS statistics 21軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。當(dāng)樣本數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，獨立樣本之間采用t檢驗或者單因素分析檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法;當(dāng)樣本數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時，樣本之間采用非參數(shù)t檢驗和Kruskal-Wallis檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1外周血中淋巴細(xì)胞亞群同預(yù)后相關(guān)

本研究中共收集肺癌32例，乳腺癌59例，宮頸癌43例。其中乳腺癌均為確定將接受手術(shù)患者，而肺癌和宮頸癌都未接受手術(shù)治療。因此從癌種和治療方式進(jìn)行評估，乳腺癌較肺癌和宮頸癌具有更好的預(yù)后。本研究共收集患者外周血中CD3陽性T細(xì)胞、CD4陽性T細(xì)胞和CD8陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比和絕對值6項指標(biāo)，加上CD4/CD8比值共7項指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖1所示。三個癌種間，CD3陽性T細(xì)胞和CD4陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)都相近，無統(tǒng)計學(xué)差異（圖1A和圖1B）;但是肺癌和宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)明顯較乳腺癌患者降低（圖1C，P值分別為0.0080**和0.0003***）。而當(dāng)分析三種淋巴細(xì)胞亞群在外周血中占淋巴細(xì)胞百分比時，我們發(fā)現(xiàn)CD4陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比在三個癌種之間無差異（圖1E），而乳腺癌患者外周血中CD3陽性T細(xì)胞和CD8陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比高于肺癌和宮頸癌患者（圖1D和1F）。由于肺癌和宮頸癌較乳腺癌是更為開放性腫瘤，因此其他淋巴細(xì)胞比如NK細(xì)胞數(shù)量較乳腺癌會增加，這就導(dǎo)致CD3陽性T細(xì)胞比例在乳腺癌中會升高，但是CD3陽性T細(xì)胞絕對數(shù)并沒有差異，這也從側(cè)面反應(yīng)了淋巴細(xì)胞亞群的絕對數(shù)較其占淋巴細(xì)胞百分比是更好的參考指標(biāo)。此外乳腺癌患者CD8陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比較肺癌和宮頸癌患者高，也再次證實了乳腺癌患者具有更多數(shù)量的CD8陽性T細(xì)胞。更為直觀的CD4/CD8比值指標(biāo)顯示，乳腺癌患者的CD4/CD8比值低于肺癌和宮頸癌患者（圖1G）。因此我們認(rèn)為在預(yù)后較好的乳腺癌患者人群中，其CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)明顯高于預(yù)后較差的肺癌和宮頸癌患者，同時乳腺癌患者的CD4/CD8比值低于肺癌和宮頸癌患者。

A. 三種癌癥患者外周血中CD3陽性T細(xì)胞絕對數(shù)的相互比較;B. CD4陽性T細(xì)胞絕對數(shù)的相互比較;C. CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)的相互比較;D. CD3陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比的相互比較;E. CD4陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比的相互比較;F. CD8陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比的相互比較;G. CD4/CD8比值的相互比較

上述結(jié)果提示通過檢測癌癥患者外周血樣本的淋巴細(xì)胞亞群，CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)較高的患者具有更好的預(yù)后。此外CD4/CD8比值較低的患者也具有較好的預(yù)后，也再次證實這類患者的CD8陽性T細(xì)胞數(shù)量較多。為了再次驗證我們的結(jié)論，本研究分別將肺癌和宮頸癌患者的外周血淋巴細(xì)胞亞群的7項指標(biāo)同患者的臨床信息相結(jié)合分析，進(jìn)行深入的研究探索。

2.2肺癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群同其臨床信息的相關(guān)性分析

共收集肺癌患者32例，其中男性24例，女性8例，年齡分布37-78歲。其中肺鱗癌8例，肺腺癌9例，其它病理類型的肺癌15例，多為中晚期患者。由于早期患者較少，因此本研究將臨床分期進(jìn)行N分期和M分期單獨分析。

我們將這7項指標(biāo)分別與患者的性別，年齡，病理類型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)行分析。結(jié)果顯示其中CD3陽性T細(xì)胞和CD4陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比和絕對數(shù)與患者的所有臨床信息都無統(tǒng)計學(xué)差異，沒有相關(guān)性。而CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)與患者臨床信息相關(guān)性如圖2表1所示。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移定義為N3的患者其外周血樣本中CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)同樣明顯低于N2患者（如圖2C所示）;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者其CD8陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)也明顯低于無轉(zhuǎn)移的患者（圖2A所示）。這部分結(jié)果與2.1的結(jié)果相一致，我們證實了肺癌早中期患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)要明顯高于肺癌晚期患者，提示外周血中CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)是預(yù)后相關(guān)的指標(biāo)之一，具有較高CD8陽性T細(xì)胞的患者可能具有更好的預(yù)后。

A. CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)同遠(yuǎn)傳轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;B. CD4/CD8比值同遠(yuǎn)傳轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;C. CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;D. CD4/CD8比值同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

同時我們也分析肺癌患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比與患者臨床信息的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)無任何統(tǒng)計學(xué)差異。提示對于腫瘤患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)，淋巴細(xì)胞及其亞群的絕對數(shù)較亞群占淋巴細(xì)胞百分比是更為優(yōu)秀及能夠正確反應(yīng)患者免疫功能狀態(tài)的指標(biāo)。

與CD8陽性T細(xì)胞指標(biāo)一樣，CD4/CD8也同肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，具有對側(cè)淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者具有更高的CD4/CD8比值，如圖2B和圖2D及表1所示。

通過上述結(jié)果，我們證實了肺癌患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)與患者的腫瘤進(jìn)展具有相關(guān)性，晚期患者其CD8陽性T細(xì)胞較少，自身的免疫功能較弱，更有利于腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移，同時也具有更差的預(yù)后。那與CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)該指標(biāo)相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)CD4/CD8比值也能夠從另一個側(cè)面反應(yīng)肺癌患者的免疫功能狀態(tài)，提示預(yù)后。兩者相結(jié)合從而給臨床一個重要的信息，方便患者的后續(xù)治療。

2.3宮頸癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群同其臨床信息的相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步驗證我們上述的結(jié)論，我們再次收集宮頸癌患者43例，年齡分布25-69歲，病理類型都為鱗癌。根據(jù)TNM分期，本研究分別將患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群的指標(biāo)與患者臨床信息進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示其中CD3陽性T細(xì)胞和CD4陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比和絕對數(shù)與患者的所有臨床信息都無統(tǒng)計學(xué)差異，沒有相關(guān)性，CD8陽性T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比與患者的臨床信息同樣無統(tǒng)計學(xué)差異。宮頸癌患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)及CD4/CD8比值則同宮頸癌患者的臨床T分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，如圖3表2所示。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者其外周血中CD8陽性T細(xì)胞的數(shù)量較沒有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者要少（圖3A和3C），同時CD4/CD8比值明顯升高（圖3B和3D）。根據(jù)單因素分析我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者外周血中CD4/CD8比值同T分期具有相關(guān)性，但是CD8陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)則和T分期無統(tǒng)計學(xué)差異（表2）。進(jìn)一步分析T1-T4期宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)和CD4/CD8比值同T分期的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)T4期宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞數(shù)量要少于T3期（如圖3E所示，有統(tǒng)計學(xué)差異）和T1-T2期（如圖3E所示，無統(tǒng)計學(xué)意義。猜測由于樣本數(shù)量不夠，導(dǎo)致其沒有統(tǒng)計學(xué)差異）。而T4期患者的CD4/CD8比值要明顯高于T1-3期患者（如圖3F所示，均有統(tǒng)計學(xué)差異）。因此早中期宮頸癌患者較晚期宮頸癌患者外周血中具有更多的CD8陽性T細(xì)胞數(shù)量和較低的CD4/CD8比值;而有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞數(shù)量低于無轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，CD4/CD8比值則較高。

A. CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;B. CD4/CD8比值同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;C. CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)同遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;D. CD4/CD8比值同遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的相關(guān)性;E. CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)同臨床T分期的相關(guān)性;F. CD4/CD8比值同臨床T分期的相關(guān)性

這部分結(jié)論提示宮頸癌患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)同宮頸癌的腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，與肺癌患者的完全一致，也再次驗證了我們在2.1部分提出的結(jié)論或者假設(shè)：腫瘤患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)及其相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)CD4/CD8比值同腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時這兩個指標(biāo)也是腫瘤患者預(yù)后的獨立因素。外周血中具有較多數(shù)量的CD8陽性T細(xì)胞（CD4/CD8比值相對較低）的腫瘤患者具有更好的預(yù)后。

3.討論

免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng)，具有監(jiān)視、防御和調(diào)控的作用[8]。免疫系統(tǒng)不僅能夠識別外來入侵的病原體，同時也能夠識別和清除體內(nèi)發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞、衰老細(xì)胞等其他有害成分。正常情況下發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞都會被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別并且清除，但是腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞由于腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，使其逃脫了機(jī)體的免疫監(jiān)視，進(jìn)而發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移。如何使機(jī)體有效識別腫瘤細(xì)胞并對其進(jìn)行清除是腫瘤治療的核心問題之一[9-10]。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)由多種成分構(gòu)成，包括免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子。淋巴細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能的過程中起重要作用[4]。淋巴細(xì)胞簡單的我們可以劃分為CD3陽性T細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，其中CD3陽性T細(xì)胞又可以分為CD4陽性T細(xì)胞和CD8陽性T細(xì)胞。再往下細(xì)分我們又可以將CD4陽性T細(xì)胞分為輔助性T細(xì)胞，記憶型T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等等[11， 12]。此外巨噬細(xì)胞、DC細(xì)胞和MDSC細(xì)胞也是免疫細(xì)胞的重要成員，協(xié)助免疫系統(tǒng)發(fā)揮功能。腫瘤免疫微環(huán)境是一個非常復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，不僅包括腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞，還包括各種細(xì)胞因子和基質(zhì)成分。由于免疫細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，我們無法做到實時地檢測所有免疫細(xì)胞，因此我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤患者外周血中CD3陽性T細(xì)胞，CD4陽性T細(xì)胞，CD8陽性T細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞來評估腫瘤患者的一個免疫功能狀態(tài)，從而為臨床提供有用的信息[13， 14]。

T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體主動的免疫應(yīng)答，T淋巴細(xì)胞具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞、輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等[15-17]。而CD8陽性T細(xì)胞是細(xì)胞毒性T細(xì)胞，能夠直接殺傷靶細(xì)胞[18]。因為本研究檢測和分析T淋巴細(xì)胞及其亞群同臨床的相關(guān)性。結(jié)果顯示腫瘤患者外周血中同細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)的兩個指標(biāo)CD8陽性T細(xì)胞絕對數(shù)和CD4/CD8比值同腫瘤患者的臨床信息相關(guān)，早中期腫瘤患者外周血中細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量要高于晚期患者，提示細(xì)胞毒性T細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。腫瘤患者外周血中具有較多數(shù)量的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其具有更好的預(yù)后。本研究很好的詮釋了細(xì)胞毒性T細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的主要執(zhí)行者，只有這類淋巴細(xì)胞基數(shù)達(dá)到一定數(shù)量時，機(jī)體的免疫系統(tǒng)才有可能去殺傷腫瘤細(xì)胞;而如果這類細(xì)胞的數(shù)量基數(shù)都很低，機(jī)體的免疫系統(tǒng)就無法去殺傷腫瘤細(xì)胞，從而影響后續(xù)的治療包括一些免疫單抗治療，如PD-1，CTLA-4等[19]。外周血淋巴細(xì)胞亞群雖然不能夠準(zhǔn)確反應(yīng)腫瘤原位中淋巴細(xì)胞亞群的狀態(tài)，但是外周血樣本取材方便，檢測準(zhǔn)確的特點，同時同一患者外周血和腫瘤原位淋巴細(xì)胞亞群變化具有一致性，使得外周血淋巴細(xì)胞亞群分析成為目前最為可行的評估腫瘤患者免疫狀態(tài)[20-22]。

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的絕對數(shù)同患者的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示可能是腫瘤患者預(yù)后的獨立因素之一。腫瘤患者外周血中CD8陽性T細(xì)胞的數(shù)量越多，患者具有更好的預(yù)后。我們希望通過檢測腫瘤患者外周血中淋巴細(xì)胞亞群，為臨床提供有價值的信息，進(jìn)而使臨床能夠根據(jù)每個患者的免疫功能狀態(tài)制訂個體化的治療策略，也使每個患者能夠從各項檢測中得到最優(yōu)化的獲益。

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*本課題受國家自然科學(xué)基金項目（81602020）資助

通訊作者：金昊

所有作者均聲明不存在利益沖突