白鮮皮多糖純化、結(jié)構(gòu)表征以及抗過敏研究

劉 冬，韓吉欣，張 云1,，劉 娟，向育銘，曹玉華

1綠葉日用品有限公司，蘇州 215151；2江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，無錫214122

白鮮皮為蕓香科植物白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)的干燥根皮，含多糖、黃酮、生物堿、甾體類化合物等成分，具有清熱燥濕、濕熱瘡毒、祛風(fēng)解毒等功效，可用于治療足癬、蕁麻疹、皮膚疹癢、濕疹等皮膚病，具有較強(qiáng)的抗過敏及止癢作用[1]。中草藥中提取的多糖種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且很大一部分具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[2-4]。

化妝品引起的皮膚過敏是近年來消費(fèi)者主要關(guān)心的安全性問題[5]。引起皮膚過敏的主要原因是IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，經(jīng)過過敏源致敏、肥大細(xì)胞激活脫粒、免疫細(xì)胞應(yīng)答等一系列復(fù)雜過程，最終導(dǎo)致過敏反應(yīng)的發(fā)生[6]。肥大細(xì)胞是過敏反應(yīng)中的效應(yīng)細(xì)胞，在過敏性皮膚病以及炎癥過程中發(fā)揮著重要作用[7]。皮膚過敏還與皮膚的屏障功能、神經(jīng)因素以及炎癥反應(yīng)有著密不可分的聯(lián)系[8]。

大鼠嗜堿性白血病粒細(xì)胞RBL-2H3(rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3)是大鼠嗜堿性粒細(xì)胞腫瘤株的一個亞系，細(xì)胞表面富含大量IgE高親和力受體，具有肥大細(xì)胞的多種生物學(xué)特性，是公認(rèn)的能夠傳代培養(yǎng)的肥大細(xì)胞體外替代模型。β-氨基己糖甘氨酶(β-HEX)是肥大細(xì)胞的標(biāo)志性顆粒，也是肥大細(xì)胞脫顆粒研究中的主要的介質(zhì)[9,10]，肥大細(xì)胞在被人工合成的多胺類化合物刺激劑C48/80(Compound 48/80)[11]刺激后會脫顆粒，在此期間β-HEX的釋放水平與肥大細(xì)胞脫顆粒的程度一致，與組胺釋放呈正相關(guān)，因此其常檢測作為肥大細(xì)胞脫顆粒的指標(biāo)[12-15]。細(xì)胞膜是皮膚屏障作用的重要部分，改進(jìn)后的紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)溶血實(shí)驗(yàn)可以通過紅細(xì)胞中漏出的血紅蛋白的量來判斷抗敏活性物質(zhì)對細(xì)胞膜的保護(hù)功能[8,16,17]。另外人體內(nèi)的自由基會攻擊細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老死亡，抑制自由基的活性可有效緩解由自由基引起的細(xì)胞老化，維護(hù)皮膚屏障作用[18]。

Zhao等[19]發(fā)現(xiàn)白鮮皮粗提物抑制C48/80誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，減少組胺及β-HEX釋放，具有抗敏功效；Zhang等[20]分離出一種純凈的白鮮皮多糖，并在硫酸酯化修飾后驗(yàn)證其具有抗銀屑病的功效；Shi等[21]通過小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)和小鼠毛細(xì)血管滲透性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其抗炎活性；Cong等[22]驗(yàn)證了白鮮皮水提物可抑制DNCB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)，且具有抑制小鼠特異性細(xì)胞免疫的功能。截止到目前，對于白鮮皮粗提物的抗敏作用雖然有過一些研究進(jìn)展，但還未有研究驗(yàn)證白鮮皮水提物中的主要成分——白鮮皮多糖的抗敏功效。所以本實(shí)驗(yàn)對白鮮皮多糖進(jìn)行提取分離，并對其成分進(jìn)行了理化分析；以抗敏功效為研究目的進(jìn)行了抑制RBL-2H3肥大細(xì)胞脫顆粒實(shí)驗(yàn)等檢測分析，為研究白鮮皮多糖作為抗敏物質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白鮮皮(北京同仁堂，批號202009)；填料DEAE Fast Flow(博格隆生物技術(shù)有限公司，編號A10032)；木瓜蛋白酶(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號131025)；RBL-2H3細(xì)胞(北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號100222)；MEN-EBSS培養(yǎng)基(Hyclone，批號AF29496678)；胎牛血清(gibco，批號FBS-PA011019)；PBS緩沖溶液(Cytiva，批號AF29561133)；Compound 48/80(Sigma，批號0000101308)；對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(Sigma，批號SLBR7548V)；新鮮兔血(江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)；十二烷基磺酸鈉SDS(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20171116)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525EF高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；ICS5000離子色譜儀(美國戴安公司)；Nicolet 6700全反射傅里葉紅外光譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；全波長酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白鮮皮多糖的提取、分離、純化

取白鮮皮50 g，研磨，過20目篩后石油醚超聲30 min去脂。待石油醚自然揮發(fā)后將粉末浸泡于60%乙醇溶液中過夜，采取料液比1∶15于95 ℃冷凝回流2 h，過濾，重復(fù)以上步驟2次，合并濾液，減壓濃縮。在濃縮液中分三次加入蒸餾水100 mL，離心抽濾，加入5倍體積乙醇醇沉。沉淀復(fù)溶于去離子水中，按1.5 g/L的比例加入木瓜蛋白酶，60 ℃水浴2 h后，于95 ℃下滅酶活30 min，然后用Savage法去蛋白，其中V(氯仿)∶V(正丁醇)= 4∶1，V(Savage試劑)∶V(樣液)= 5∶1，充分振蕩后離心，小心取上清液，重復(fù)操作直至中間無蛋白層出現(xiàn)。再次加入5倍體積乙醇醇沉，沉淀依次用丙酮和無水乙醇洗滌2次，復(fù)溶于去離子水中，透析一周，凍干得白鮮皮多糖(Cortex Dictamni polysaccharides，CDPS)

稱取50 mg CDPS，溶于10 mL去離子水中，過0.45 μm濾膜后經(jīng)DEAE Fast Flow(50 cm×1 cm)離子交換柱純化，超純水洗脫，每管收集5 mL洗脫液，并利用苯酚硫酸法測定每管的吸光度A490，繪制洗脫曲線。收集主要洗脫組分，凍干得白鮮皮多糖CDPS-1和CDPS-2。

1.3.2 白鮮皮多糖的總糖和蛋白含量測定

分別利用苯酚硫酸法[23]和考馬斯亮藍(lán)G-250法[24]測定總糖和蛋白含量。得率按公式(1)計算，總糖和蛋白含量按公式(2)計算：

白鮮皮多糖=m1/m2×100%

(1)

式中：m1：提取液中總糖質(zhì)量或CDPS-1、CDPS-2的質(zhì)量(g)；m2：白鮮皮的質(zhì)量(g)。

總糖或總蛋白含量=m1/m2×100%

(2)

式中：m1：測定的CDPS、CDPS-1、CDPS-2中的總糖或蛋白的質(zhì)量(g)；m2：CDPS、CDPS-1、CDPS-2的質(zhì)量(g)。

1.3.3 白鮮皮多糖的相對分子量和單糖組成分析

利用高效凝膠過濾色譜(high performance size exclusion chromatography，HPGFC)法測定白鮮皮多糖樣品的分子量，由葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Mw：0.18、2.7、9.75、13.5、30和200 kDa)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件如下：Waters 1525EF高效液相色譜儀；2 410示差折光檢測器；Empower工作站；UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm色譜柱；流動相0.1 mol/L NaNO3水溶液；流速0.8 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量50 μL。

稱取5 mg白鮮皮多糖樣品，分別加入2 mol/L三氟乙酸300 μL，100 ℃下降解12 h，氮?dú)獯蹈?，加?00 μL甲醇，吹干，重復(fù)操作3次以除去三氟乙酸，然后定容至25 mL。使用離子色譜儀(脈沖安培檢測器)進(jìn)行色譜分析，色譜條件如下：賽默飛戴安ICS-5000+高壓離子色譜儀(采用Dionex CarboTMPA20 3×150 mm色譜柱，柱溫30 ℃，流速：0.5 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL)洗脫程序如表1所示。分別配制單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mg/mL(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)，按照上述離子色譜方法進(jìn)行色譜分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間和峰面積，可以確定多糖樣品中的單糖組成和摩爾百分比。

表1 離子色譜洗脫程序Table 1 The elution program of ion chromatography

1.3.4 白鮮皮多糖的FT-IR分析

取干燥的白鮮皮多糖樣品1～2 mg，在600～4 000 cm-1內(nèi)進(jìn)行全反射傅里葉紅外檢測。

1.3.5 RBL-2H3細(xì)胞培養(yǎng)

取RBL-2H3細(xì)胞(購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，37 ℃解凍，將其完全置于培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清的MEN-EBSS)，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天進(jìn)行一次傳代。

1.3.6 RBL-2H3細(xì)胞活性的檢測

采用CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測。取出處于對數(shù)生長周期的RBL-2H3細(xì)胞，消化制備成細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至2.0×105

個/mL，每孔100 μL加入到96孔板中，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁12 h。棄上清，分別加入用MEM-EBSS培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的CDPS樣品100 μL(10、5、1、0.5、0.1 mg/mL)，每組設(shè)置3復(fù)孔。設(shè)置對照組(不加入CDPS的細(xì)胞孔)和空白組(不接種細(xì)胞的空白組)。37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后各孔中加入含10%的CCK-8培養(yǎng)基溶液100 μL(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，恒溫箱避光孵育2 h，經(jīng)輕微震蕩，于酶標(biāo)儀檢測波長450 nm測定各孔OD值。細(xì)胞活性通過公式(3)計算得到。

細(xì)胞活性=

(ODCDPS-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%

(3)

1.3.7 RBL-2H3細(xì)胞活化脫顆粒β-HEX的檢測

取出處于對數(shù)生長周期的RBL-2H3細(xì)胞，消化制備成細(xì)胞懸液，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至2.0×105個/mL，接種至24孔板中，每孔1 000 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，棄上清，PBS緩沖液清洗兩次。分別加入用MEM-EBSS培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的CDPS樣品1 000 μL(10、5、1、0.5、0.1 mg/mL)，同時設(shè)置3個復(fù)孔，并命名為給藥組；設(shè)置對照組和空白組(不加入CDPS樣品的細(xì)胞孔)。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。棄上清，PBS緩沖液清洗兩次，給藥組及模型組每孔加入1 000 μL濃度為100 μL/mL的Compound 48/80培養(yǎng)基溶液，空白組用等量培養(yǎng)基替代，置于培養(yǎng)箱中孵育40 min后，冰水浴10 min。收集各組上清液，每孔取50 μL加入96孔板，加入50 μL顯色液(含1 mmol/L對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液)，37 ℃孵育1 h后，加入200 μL終止液(Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液)終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀檢測波長405 nm下測定各孔OD值。通過公式(4)計算得到β-HEX釋放抑制率。

β-HEX釋放抑制率=

[1-(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%

(4)

1.3.8 RBC溶血實(shí)驗(yàn)

采集新鮮兔血，用PBS多次混洗離心去上清后，將沉淀部分稀釋至50%，用含0.1% SDS的PBS溶液將其稀釋至不同濃度(0.5%～5%)，室溫下180 rpm搖床孵育10 min，11 180 g離心1 min，取出200 μL上清液于530 nm處檢測OD值。選擇OD值在2～2.5范圍內(nèi)的RBC濃度，分別加入不同濃度SDS的PBS溶液(0.01%～0.1%)，設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，重復(fù)上述步驟，檢測SDS濃度對細(xì)胞溶血的影響。溶血率計通過公式(5)計算得到。

溶血率=(OD實(shí)驗(yàn)-OD陰性對照)/

(OD陽性對照-OD陰性對照)×100%

(5)

選取溶血率50%～70%范圍內(nèi)SDS刺激濃度，OD值在2～2.5范圍內(nèi)的RBC濃度，加入不同濃度CDPS樣品溶液(10～0.1 mg/mL)，設(shè)置陽性對照組和陰性對照組，重復(fù)上述步驟，測定樣品于SDS共同作用后的紅細(xì)胞溶血率。紅細(xì)胞的抑制率通過公式(6)計算得到。

抑制率=(1-CDPS保護(hù)溶血率/

實(shí)驗(yàn)濃度SDS刺激溶血率)×100%

(6)

1.3.9 DPPH清除實(shí)驗(yàn)

配置不同濃度的CDPS樣品水溶液和維生素C溶液(0.1～10 mg/mL)，將100 μL樣品溶液加入96孔板中，加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液100 μL，同時設(shè)置3個復(fù)孔，命名為給藥組；設(shè)置對照組和空白組，對照組加入100 μL水+100 μL DPPH乙醇溶液，空白加入100 μL的樣品溶液+100 μL的無水乙醇，同時設(shè)置3個復(fù)孔；室溫避光顯色30 min，517 nm處檢測OD值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 白鮮皮多糖純化和結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 白鮮皮多糖的分離

白鮮皮多糖CDPS經(jīng)過離子交換層析(DEAE Fast Flow)用水和0.1 mol/L的氯化鈉洗脫，洗脫曲線見圖1，洗脫后得兩個吸光度值較高的洗脫峰，分別命名為CDPS-1和CDPS-2，凍干備用。

圖1 DEAE Fast Flow色譜柱洗脫曲線Fig.1 Elution curve of DEAE Fast Flow column

2.1.2 白鮮皮多糖的總糖和總蛋白含量測定

根據(jù)苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)G-250法分別測得CDPS、CDPS-1、CDPS-2的總糖和總蛋白含量。結(jié)果如表2所示，CDPS和CDPS-1的總糖含量超過99%，蛋白含量均低于0.05%；CDPS-2得率低于0.05%。

表2 白鮮皮多糖的得率、總糖和蛋白含量Table 2 Yield,total sugar and protein content of CDPS

2.1.3 白鮮皮多糖CDPS-1的分子質(zhì)量和單糖組成分析

對含量較高的CDPS-1進(jìn)行了表征。HPGFC測定結(jié)果如圖2和表3所示，色譜圖出現(xiàn)一個單峰，確認(rèn)CDPS-1為單一組分，分子量為2 577 Da。單糖組成的結(jié)果如表4所示，CDPS-1主要由巖藻糖，葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖組成，摩爾比為0.41∶1.38∶3.15∶15.4∶79.61。

表3 CDPS-1的HPGFC測定結(jié)果Table 3 HPGFC determination of CDPS-1

表4 CDPS-1單糖組成離子色譜分析結(jié)果Table 4 Analysis of monosaccharide composition of CDPS-1 with ion chromatography

圖2 CDPS-1的HPGFC色譜圖Fig.2 HPGFC chromatogram of CDPS-1

2.1.4 白鮮皮多糖的FT-IR分析

由圖3可知，CDPS-1在3 313 cm-1處的吸收峰屬于-OH的伸縮振動，在2 925 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動，1 639 cm-1的吸收峰歸因于羧基的C=O鍵的振動，1 410和1 341 cm-1的吸收峰屬于δ-CH2的彎曲振動，1 147和1 076 cm-1的吸收峰歸>因于C-O-C和C-O的伸縮振動，1 011 cm-1的吸收峰表明存在吡喃糖環(huán)，922和846 cm-1的吸收峰屬于α型糖苷鍵，上述特征表明CDPS-1是以α型糖苷鍵為主的多糖化合物。

圖3 CDPS-1的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of CDPS-1

2.2 白鮮皮多糖抗過敏性能研究

2.2.1 CDPS對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制作用

2.2.1.1 細(xì)胞活性檢測

CDPS對RBL-2H3細(xì)胞活性的影響如圖4所示，RBL-2H3細(xì)胞與濃度范圍在0.1～10 mg/mL的CDPS共培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞活性均高于95%，證明在此濃度范圍內(nèi)CDPS樣品對細(xì)胞無毒性影響，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

圖4 CDPS對RBL-2H3細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effect of CDPS on cell viability of RBL-2H3

2.2.1.2 CDPS對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制作用

肥大細(xì)胞是I型變態(tài)反應(yīng)炎癥反應(yīng)的核心效應(yīng)細(xì)胞。RBL-2H3具有與肥大細(xì)胞相似的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面具有和肥大細(xì)胞相同的高親和力FcεR I受體，并且其能模擬肥大細(xì)胞的多種功能(如脫顆粒)，且具有可傳代培養(yǎng)和性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是研究與肥大細(xì)胞相關(guān)的生理、病理和藥物作用機(jī)制的理想替代模型。β-HEX是RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒的主

要研究介質(zhì)。當(dāng)RBL-2H3細(xì)胞受到刺激后脫顆粒釋放的β-HEX會分解對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷，在405 nm處出現(xiàn)吸光度峰值，以此來監(jiān)測β-HEX的釋放率。在CDPS與RBL-2H3細(xì)胞共培養(yǎng)后刺激脫粒，計算可得CDPS對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制作用，如圖5所示，CDPS樣品在0.1～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對β-HEX的釋放均有抑制作用；在0.1～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，抑制率呈上升趨勢；在1～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，抑制率呈下降趨勢；在1 mg/mL的濃度下抑制率達(dá)到峰值，為15.54%。CDPS-1在0.1～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對β-HEX的釋放均有抑制作用，且抑制率呈上升趨勢；在1 mg/mL的濃度下抑制率達(dá)到28.54%，約為CDPS的兩倍。實(shí)驗(yàn)證明CDPS和CDPS-1均有良好的抗敏效果，且在1 mg/mL的給藥濃度下抑制率達(dá)到峰值。

圖5 CDPS和CDPS-1對刺激劑誘導(dǎo) RBL-2H3細(xì)胞釋放β-HEX的影響Fig.5 Effects of CDPS and CDPS-1 on the release of β-HEX in RBL-2H3 cells induced by stimulants

2.2.2 白鮮皮多糖抑制紅細(xì)胞溶血

2.2.2.1 不同濃度白鮮皮多糖CDPS的紅細(xì)胞溶血率

白鮮皮樣品CDPS對RBC毒性可通過溶血率進(jìn)行判斷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，白鮮皮樣品CDPS在0.1～10 mg/mL范圍內(nèi)幾乎沒有溶血(<2%)，即對細(xì)胞膜沒有損傷。

圖6 CDPS的RBC溶血率比較Fig.6 Comparison of RBC hemolysis rate of CDPS

2.2.2.2 不同濃度刺激物作用下紅細(xì)胞溶血效果

SDS是RBC溶血實(shí)驗(yàn)的陽性對照物，通常實(shí)驗(yàn)濃度為0.2%，即0.2% SDS可以達(dá)到100%的RBC溶血率。通過測定0.2%以下不同濃度梯度的SDS的RBC溶血率，篩選出特定細(xì)胞溶血率的SDS濃度，進(jìn)行RBC溶血抑制實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，在0.01%～0.04%濃度范圍內(nèi)，RBC溶血率逐漸提升，在0.05%～0.2%濃度范圍內(nèi)，RBC溶血率達(dá)到90%以上。擬選取0.02%SDS作為實(shí)驗(yàn)濃度，此時RBC溶血率為55.42%。

圖7 SDS的RBC溶血率Fig.7 The hemolysis rate of red blood cells by different concentration of SDS

2.2.2.3 白鮮皮多糖紅細(xì)胞溶血抑制性能

在RBC中先加入不同濃度的CDPS，再加入濃度為0.02%的SDS，測定溶血率，與未經(jīng)CDPS處理直接加入SDS的RBC溶血率比較，即可評價CDPS是否具有保護(hù)細(xì)胞膜，使之免受刺激物損傷的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，在CDPS給藥濃度在0.1～5 mg/mL范圍內(nèi)，RBC溶血率逐漸降低，溶血抑制率逐漸升高；在5～10 mg/mL范圍內(nèi)，RBC溶血率逐漸升高，溶血抑制率逐漸降低；在5 mg/mL時達(dá)到最優(yōu)值，溶血率為17.54%，溶血抑制率為62%。由此可見，CDPS對細(xì)胞膜有良好的保護(hù)作用，且在濃度為5 mg/mL的濃度下，RBC溶血抑制率超過60%，具有較好的抗SDS刺激效果。

圖8 CDPS與SDS共同作用后紅細(xì)胞的溶血率和抑制率Fig.8 The hemolysis rate and hemolytic inhibition rate of RBC treated with CDPS and SDS

2.2.3 白鮮皮多糖抗氧化性

白鮮皮多糖CDPS的DPPH清除率如圖9所示，在0.1～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，CDPS濃度對DPPH清除率沒有顯著變化；在1～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著CDPS濃度的升高，對DPPH的清除率呈緩慢上升趨勢。在濃度為10 mg/mL的條件下DPPH清除率超過40%，說明白鮮皮多糖CDPS有一定的抗氧化作用。

圖9 CDPS的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH radical scavenging rate of CDPS

3 結(jié)論

本研究對白鮮皮進(jìn)行提取分離，獲得白鮮皮多糖CDPS，并對其進(jìn)行進(jìn)一步純化獲得白鮮皮多糖CDPS-1。利用GFC、IC和FT-IR等方法對CDPS-1進(jìn)行表征，CDPS-1主要以α型糖苷鍵為主，分子量為2 577 Da，主要由巖藻糖，葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖組成，摩爾比為0.41∶1.38∶3.15∶15.4∶79.61。測定了CDPS對RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放β-HEX的抑制率、RBC溶血抑制率和DPPH清除率，結(jié)果顯示在0.5～1.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)CDPS對β-HEX的釋放抑制率和RBC細(xì)胞膜保護(hù)效果較好，峰值分別達(dá)到了28.54%和62.1%，且對DPPH有超過25%的清除率。本實(shí)驗(yàn)提取的白鮮皮多糖有良好的抗敏功效，推測其對細(xì)胞膜的保護(hù)能力和抗氧化能力為抗敏機(jī)制起到一定的作用。