不同叢枝菌根真菌菌劑對(duì)滇重樓及土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的影響

趙順鑫，魏祖晨，李卓蔚，許凌峰，郭冬琴，周 濃，杜慧慧

重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120

作為植物生長(zhǎng)直接基質(zhì)的根際土壤為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供保障，土壤中的微生物組成及酶活力影響著土壤微生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)土壤理化性質(zhì)、養(yǎng)分循環(huán)和植物生長(zhǎng)等具有重要的影響[1]。土壤微生物群落在調(diào)控土壤物質(zhì)循環(huán)和改善土壤質(zhì)量起到關(guān)鍵性作用[2]。叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌可以改善土壤的營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收利用，提高藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[3,4]，同時(shí)對(duì)污染土壤、鹽堿土壤的生態(tài)恢復(fù)發(fā)揮積極作用[5]。

野生滇重樓資源的枯竭，使得人工栽培和引種栽培成為滇重樓研究的主流[6]。但因其地理位置，種植年限的差異，導(dǎo)致滇重樓的品質(zhì)不一[7]。據(jù)報(bào)道，接種不同AM真菌能夠提高滇重樓薯蕷皂苷元的含量、改善土壤的理化性質(zhì)、提高土壤養(yǎng)分和優(yōu)化微生物結(jié)構(gòu)[7,8]，促進(jìn)滇重樓幼苗期葉片葉綠素合成，提高幼苗光合能力[9]。Zhang等[10]報(bào)道滇重樓種子共生萌發(fā)時(shí)接種薄壁兩性囊霉(Ambisporaleptoticha)和崔氏原囊霉(Archaeosporatrappei)可提高滇重樓幼苗的成活率和產(chǎn)量。另外，接種不同AM真菌可以促進(jìn)滇重樓根際對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用、提高滇重樓品質(zhì)[11]。Yang等[12]發(fā)現(xiàn)接種優(yōu)選的混合AM真菌菌劑增加滇重樓根中內(nèi)源激素含量比接種單株真菌的效果更好。前期研究[13]發(fā)現(xiàn)不同AM真菌混劑能夠提高根際土壤中球囊霉素含量和酶活性，改變微生物群落結(jié)構(gòu)，從而改善土壤環(huán)境，也能促進(jìn)滇重樓對(duì)外界不利環(huán)境的抗逆性，提高滇重樓總皂苷含量，誘導(dǎo)滇重樓次生代謝的變化，增加有效成分，從而提升滇重樓的藥用品質(zhì)。

通過(guò)接種AM真菌改善土壤環(huán)境和提升藥材品質(zhì)已成為一種趨勢(shì)。土壤中營(yíng)養(yǎng)元素含量水平受栽培土壤營(yíng)養(yǎng)水平和植株自身習(xí)性的影響[14]。Shen等[15]發(fā)現(xiàn)，接種不同AM真菌后滇重樓根莖和根際土壤中的鈣、鎂、鈉等含量均高于未處理組，且促進(jìn)根莖對(duì)元素的吸收來(lái)提高品質(zhì)。Gu等[16]研究表明，不同AM真菌混合接種可增加木香對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)代謝產(chǎn)物的積累，提高木香內(nèi)脂的產(chǎn)量和入藥品質(zhì)。而接種不同AM真菌混劑后對(duì)滇重樓和土壤微生態(tài)中營(yíng)養(yǎng)元素影響的研究較少?；诖?，本研究通過(guò)接種不同組合的AM真菌菌劑后，測(cè)定滇重樓不同部位以及土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素的含量，旨在解析不同AM真菌菌劑對(duì)滇重樓和土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的影響，以期能夠最大化利用土壤的營(yíng)養(yǎng)元素，減少資源浪費(fèi)，同時(shí)為滇重樓生物菌肥的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)

樣品于2013年10月采自云南省大理白族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)推廣研究院種植基地(25°35′27.69′′N，100°18′23.17′′E，海拔1 980 m，年均氣溫14.9 ℃，年降雨量1 051.1 mm)，經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為百合科重樓屬滇重樓P.polyphyllavar.yunnanensis。選擇大小一致且無(wú)蟲害的滇重樓新鮮根莖為研究對(duì)象。12種AM真菌菌劑均購(gòu)自美國(guó)國(guó)際叢枝菌根真菌種質(zhì)資源保藏中心(INVAM)，由重慶三峽學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)增繁殖、儲(chǔ)存保管。菌劑擴(kuò)繁的基質(zhì)使用山基土和河沙按3∶1體積比混合制成[11]。

栽培基質(zhì)為菜園土與河沙按體積3∶1混合，于高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌2 h，置于口徑15 cm，高18 cm的無(wú)菌塑料容器中。采用室溫盆栽的方法，于重慶市萬(wàn)州區(qū)鐵峰山國(guó)家森林公園內(nèi)試驗(yàn)種植基地(30°56′12.05′′N，108°22′32.89′′E，海拔1 230 m)進(jìn)行種植。分別設(shè)置叢枝菌根真菌處理組S1～S9和對(duì)照組CK，每盆3株苗，每組10個(gè)重復(fù)。不同處理組每盆接種含4或6種叢枝菌根真菌共120枚孢子的混合菌劑(均分)，并定期澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，具體信息詳見(jiàn)表1。

表1 不同處理組及其接種叢枝菌根真菌Table 1 Different treatment groups and inoculation of AM fungi

1.2 樣品采集與處理

分別在4個(gè)時(shí)期(T1：2015年6月；T2：2015年7月；T3：2015年8月；T4：2015年9月)將滇重樓植株小心取出，不傷害其根系，獲得葉、莖、根莖和須根。采用He等[17]方法將靠近頂芽第一莖痕處并帶有頂芽的切段為新根莖，余下的部分為老根莖，置于45 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩，用于滇重樓元素含量測(cè)定分析。同時(shí)采集土壤樣品，實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干至恒重，粉碎過(guò)80目篩，用于土壤相關(guān)元素含量測(cè)定分析。

1.3 儀器與試劑

TAS-990AFG型原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；C-MAG HP10型數(shù)顯加熱板(德國(guó)IKA集團(tuán))；DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)空心陰極燈(北京曙光明電子光源儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。所用水為去離子水，試劑均為優(yōu)級(jí)純。

1.4 測(cè)定方法

采用凱氏定氮法[18]測(cè)定滇重樓與土壤中的氮元素含量，采用釩鉬黃比色法[19]測(cè)定滇重樓中的磷元素含量，采用硫酸-高氯酸消煮法[18]測(cè)定土壤中磷元素含量，采用原子吸收光譜法[20]測(cè)定滇重樓與土壤中鉀、鈣、鎂元素含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS 25分析軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收時(shí)期滇重樓中氮、磷、鉀、鈣、鎂元素吸收和分布規(guī)律

滇重樓不同采收期其根、莖、葉中氮、磷、鉀、鈣、鎂含量分布規(guī)律如表2所示。就對(duì)照組而言，4個(gè)時(shí)期滇重樓不同部位氮含量整體表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢(shì)，在T3時(shí)期新、老根莖氮的含量達(dá)到最大；T1時(shí)期，S3、S4、S5、S6和S7處理組滇重樓葉中氮的含量均增加，S7新根莖氮的含量增加，S6處理組滇重樓新根莖、老根莖和葉中氮的含量增加；S8處理組T1時(shí)期新、老根莖和葉，T2時(shí)期新根莖和葉以及T4時(shí)期新、老根莖中氮的含量增加。綜上，S8處理組氮含量的增加效果比較好。磷在滇重樓新根莖和葉中含量較高，其中T4時(shí)期S6處理組滇重樓的新、老根莖中磷含量最高。S8處理組T1時(shí)期新根莖中磷的含量增加，達(dá)6.289 g/kg。鉀元素可以影響植物品質(zhì)及根莖次生代謝產(chǎn)物合成積累。對(duì)鉀的含量分析發(fā)現(xiàn)，鉀含量表現(xiàn)為莖>葉>根莖。T4時(shí)期S8處理組的老根莖中鉀含量較高，為12.715 g/kg。

表2 接種叢枝菌根真菌對(duì)滇重樓5種元素吸收的影響Table 2 Contents of five elements in P.polyphylla var.yunnanensis inoculated with AM fungi at different times(g/kg)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

不同時(shí)期處理組滇重樓鈣含量大部分高于對(duì)照組，表明接種叢枝菌根真菌能有效提高滇重樓抗逆性，保證滇重樓正常生長(zhǎng)。采收期對(duì)照組的滇重樓的鈣含量表現(xiàn)為莖>葉，老根莖>新根莖。而處理組的鈣含量新根莖>老根莖，表明不同處理組可促進(jìn)新根莖對(duì)鈣元素的蓄積。其中S4、S6和S8處理組T1時(shí)期葉的鈣含量增加，S6處理組T1時(shí)期新根莖的鈣含量、T3時(shí)期莖和葉的鈣含量增加，S8處理組T1和T3時(shí)期莖和葉以及T4時(shí)期新、老根莖的鈣含量增加，推測(cè)S8處理組可以促進(jìn)滇重樓對(duì)鈣的吸收，增加植物的抗逆性。對(duì)鎂含量進(jìn)行測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)，相較于對(duì)照組，不同處理組滇重樓鎂的含量不同程度發(fā)生改變。其中，T1、T4時(shí)期S6組的老根莖中鎂含量較高，T3時(shí)期新根莖含量較高。S8處理組在T1、T2和T4時(shí)期新根莖的鎂的含量較高，最高可達(dá)28.142 g/kg。因此，不同AM真菌混合后可不同程度上促進(jìn)氮、磷、鉀、鈣、鎂的吸收及在根莖中的蓄積。

2.2 不同采收時(shí)期土壤中營(yíng)養(yǎng)元素含量分析

通過(guò)凱氏定氮法、硫酸-高氯酸消煮法和原子吸收光譜法測(cè)定接種不同AM真菌菌劑后土壤中的氮、磷、鉀、鈣、鎂5種元素的含量。由表3可知，不同處理組土壤中的氮、磷、鉀、鈣、鎂5種元素的含量與對(duì)照組存在顯著差異。在T1、T3和T4時(shí)期，S8處理組的土壤中鈣的含量明顯比對(duì)照組高，且T1時(shí)期滇重樓不同部位的鈣含量，T3時(shí)期滇重樓莖和葉中，T4時(shí)期滇重樓新根莖中鈣的含量都明顯升高。表明土壤中的鈣含量的升高有利于植物各個(gè)部位鈣的蓄積及轉(zhuǎn)移。S6處理組在T2和T4時(shí)期鈣的含量最高，均大于141.000 g/kg。不同處理組土壤中的氮、磷、鉀和鎂元素的變化量不大，而S6、S8處理組滇重樓的新根莖、老根莖和葉中氮的含量顯著升高，S7處理組的新根莖和葉的氮含量也明顯增多，最高可達(dá)4.799 g/kg，T1時(shí)期S8和S1處理組滇重樓的新根莖的磷含量比其他處理組高，最高可達(dá)到6.289 g/kg，推測(cè)不同AM真菌可以促進(jìn)滇重樓對(duì)氮元素的吸收和蓄積。

表3 接種叢枝菌根真菌不同時(shí)間土壤中五種元素含量Table 3 Contents of five elements in soils inoculated with AM fungi at different times(g/kg)

2.3 滇重樓與土壤元素相關(guān)性分析

為了分析滇重樓不同部位與栽培土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的關(guān)系，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，滇重樓老根莖與土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素有不同程度的相關(guān)性。老根莖中的氮與老根莖中鈣和鎂存在極顯著正相關(guān)(r=0.516、0.680，P<0.01)，老根莖中的鈣與鎂的含量呈顯著正相關(guān)(r=0.337，P<0.05)，老根莖中的鈣與土壤中的鈣呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.315，P<0.05)，與土壤中的鎂存在極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.469，P<0.01)，土壤中的鈣與土壤中的鉀存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.312，P<0.05)，土壤中的鎂和鈣存在極顯著正相關(guān)(r=0.455，P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表4。滇重樓新根莖與土壤中5種元素的相關(guān)性為：新根莖中的氮和磷呈極顯著正相關(guān)(r=0.407，P<0.01)，新根莖中的鎂和新根莖中的磷與鉀呈極顯著正相關(guān)(r=0.500、0.421，P<0.01)，土壤中的鈣和鉀呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.312，P<0.05)，土壤中的鈣和鎂呈極顯著正相關(guān)(r=0.455，P<0.01)(見(jiàn)表5)。表6展示了滇重樓葉與土壤中5種元素存在一定的相關(guān)性：葉中的氮和鈣呈顯著正相關(guān)(r=0.407，P<0.05)，葉中的鉀與鎂呈極顯著正相關(guān)(r=0.587，P<0.01)，土壤中的鈣與葉中的磷呈顯著正相關(guān)(r=0.365，P<0.05)，與葉中的鉀呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.362，P<0.05)，土壤中的鈣與土壤中的鉀呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.438，P<0.05)，與土壤中的鎂呈顯著正相關(guān)(r=0.46，P<0.05)。

表4 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓老根莖元素與土壤元素相關(guān)性分析Table 4 The correlation analysis of the old tuber elements and soil elements treated of P.polyphylla var.yunnanensis

表5 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓新根莖元素與土壤元素相關(guān)性分析Table 5 The correlation analysis of the new tuber elements and soil elements treated of P.polyphylla var.yunnanensis

表6 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓葉中元素與土壤元素相關(guān)性分析Table 6 The correlation analysis of leaf elements and soil elements of P.polyphylla var.yunnanensis

由表7可知，滇重樓莖與土壤中5種元素存在的相關(guān)性表現(xiàn)為：滇重樓莖中鉀與鈣存在顯著正相關(guān)(r=0.453，P<0.05)，滇重樓莖中的鉀與土壤中的磷呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.384，P<0.05)，土壤中的鉀和鈣呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.438，P<0.05)，土壤中的鎂與滇重樓莖中的鎂呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.403，P<0.05)，與土壤中的鈣呈顯著正相關(guān)(r=0.446，P<0.05)。莖中鉀含量與鈣含量呈正相關(guān)，可能與鉀具有使莖干堅(jiān)韌，增強(qiáng)植株抗機(jī)械損傷、抗蟲害能力有關(guān)。在采收期，S3、S6、S8處理組的土壤中的鈣含量較高，可以為滇重樓生長(zhǎng)提供較多的鈣，從而提高滇重樓的抗逆性，且葉中的鈣含量與氮含量具有正相關(guān)性。

表7 不同叢枝菌根真菌處理滇重樓莖中元素與土壤元素相關(guān)性分析Table 7 The correlation analysis of stem elements and soil elements of P.polyphylla var.yunnanensis

3 討論與結(jié)論

接種不同AM真菌菌劑處理能夠不同程度的影響滇重樓及栽培土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收及蓄積。氮、磷、鉀是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的元素，其體內(nèi)含量分布能反映植物對(duì)元素的分配及相互作用的關(guān)系[21]。接種不同組合AM真菌菌劑后，不同元素的含量在不同生長(zhǎng)期呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，其中S8處理組T1時(shí)期新、老根莖和葉，T2時(shí)期新根莖和葉以及T4時(shí)期新、老根莖中氮的含量增加；S8處理組T1時(shí)期新根莖中磷的含量增加(最高為6.289 g/kg)，推測(cè)S8處理組的AM真菌可以促進(jìn)滇重樓吸收土壤中的氮、磷元素來(lái)提升產(chǎn)量及品質(zhì)。與Li等[22]研究一致，增施氮肥和磷肥可增加滇重樓的產(chǎn)量和皂苷含量。S8處理組T4時(shí)期老根莖中鉀含量較高，為12.715 g/kg；而且Wang等[23]報(bào)道土壤中的鉀有利于滇重樓根莖中總皂苷和多糖的合成與積累，對(duì)其影響可能是通過(guò)滇重樓不同部位含鉀量來(lái)實(shí)現(xiàn)。S8處理組T1和T3時(shí)期莖和葉以及T4時(shí)期新、老根莖的鈣含量增加；T1、T2和T4時(shí)期新根莖的鎂的含量增加(最高為28.142 g/kg)。鈣不僅是植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)的重要組成，還能夠有效緩解各種生物和非生物脅迫對(duì)植物的威脅，提高植物抗逆性，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、成熟及衰老起著重要作用[24]。

藥用植物的品質(zhì)可以間接反映土壤質(zhì)量和肥力，根際土壤微生態(tài)的變化也會(huì)影響藥用植物的質(zhì)量。AM真菌等微生物的含量能夠引起土壤基質(zhì)環(huán)境的變化，對(duì)微生物群落組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，除S6、S8處理組滇重樓的新根莖、老根莖和葉中氮的含量顯著升高，S8和S1處理組滇重樓的新根莖的磷含量比其他處理組高(最高可達(dá)到6.289 g/kg)之外，不同處理組土壤中的氮、磷、鉀和鎂元素的變化量不大。不同處理組土壤中的鈣含量有顯著性增多，尤其S8處理組的土壤中鈣的含量明顯比對(duì)照組高。因此，接種不同叢枝菌根真菌混合菌劑能有效改變滇重樓藥材不同部位氮、磷、鉀、鈣、鎂含量，促進(jìn)滇重樓對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。同時(shí)也可改變土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的釋放，這與AM真菌菌根對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)的優(yōu)勢(shì)作用研究相一致[26]。

相關(guān)性分析表明，滇重樓老根莖中N的吸收與Ca、Mg的吸收，新根莖中N的吸收與P、Mg的吸收，P的吸收與K的吸收，葉中的N的吸收和莖中K的吸收與Ca的吸收呈顯著協(xié)同作用，老根莖中Ca的吸收與土壤中Ca、Mg的吸收呈顯著負(fù)相關(guān)作用，莖中的K的吸收與土壤中P的吸收，莖中Mg的吸收與土壤中Mg的吸收呈負(fù)相關(guān)作用。與Zhang等[11]推測(cè)的多種營(yíng)養(yǎng)元素在滇重樓生長(zhǎng)過(guò)程中的積累可能存在競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同兩種效應(yīng)相一致。滇重樓的老根莖中氮、鈣和鎂的吸收三者之間具有協(xié)同作用，滇重樓葉中磷的含量隨土壤中鈣含量的增加而增加，而鈣和磷之間存在復(fù)雜的交互作用且具有物種特異性，高鈣可增加豆科植物對(duì)磷的吸收但抑制小麥、番茄等對(duì)磷的吸收[27,28]。

綜上所述，S8處理組的6種AM真菌:微白巨孢囊霉(G.albida)、巨大巨孢囊霉(G.gigantea)、美麗盾巨孢囊霉(S.calospora)、亮色盾巨孢囊霉(R.fulgida)、根內(nèi)球囊霉(R.intraradices)、近明球囊霉(C.claroideum)作為滇重樓生物菌肥的優(yōu)良菌種，為生物菌肥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示9種不同AM真菌菌劑的組合可以不同程度的影響營(yíng)養(yǎng)元素的含量轉(zhuǎn)移及蓄積，但是要想篩選最優(yōu)的混合菌劑還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其接種的比例及發(fā)酵液的成分等，以期為滇重樓的生物菌肥的研發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，以利于改變滇重樓營(yíng)養(yǎng)元素的吸收與蓄積，提升滇重樓的品質(zhì)。