油菜蜂花粉乙醇提取物對異丙腎上腺素致心肌細(xì)胞肥大的保護作用及機制研究

陳立府，孟 菲,2，李志良,2，謝仕慧，史培穎,3 *

1福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)；2福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；3天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實驗室，福州 350002

心力衰竭(heart failure，HF)是一種常見的心血管病綜合征，是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，其致殘率和死亡率均較高。心臟肥大(cardiac hypertrophy，CH)是HF過程中的早期適應(yīng)性反應(yīng)，但是長時間的CH會加速心肌纖維化和心臟收縮功能障礙，進而加快HF的進程[1]。CH不僅會引發(fā)充血性心力衰竭，也是高血壓、心臟瓣膜病、擴張型心肌病、心肌缺血、心肌梗死、心律失常和猝死的獨立危險因素[2]。對CH的控制可以顯著延緩心肌病的進程。延緩或避免CH的發(fā)生是一個主要的治療目標(biāo)。

異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)屬于腎上腺素能受體激動劑。重復(fù)或連續(xù)注射ISO興奮β1-腎上腺素能受體，可使心肌產(chǎn)生毒性損傷，增加心肌的收縮力和耗氧量致使心律失常、后負(fù)荷增高和心肌缺血壞死等，導(dǎo)致心肌重塑，從而誘發(fā)代償性CH[3]。因此，ISO常被用來建立CH模型。研究表明ISO誘導(dǎo)的CH會伴有心肌細(xì)胞面積增加、蛋白質(zhì)合成過多以及CH的標(biāo)記基因如心鈉素(ANP)、腦鈉肽(BNP)和β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)等的再激活[4,5]。

蜂花粉是眾多蜂產(chǎn)品中的典型代表之一，所含成分豐富。據(jù)Thakur等的統(tǒng)計顯示，蜂花粉主要成分包括碳水化合物(54.22%)、蛋白質(zhì)(21.30%)、脂質(zhì)(5.31%)、纖維(8.75%)、灰分(2.91%)等[6]，還含有酚酸類化合物、黃酮類化合物、多胺、核苷、氨基酸、脂肪酸、維生素等[6-8]。蜂花粉具有抗氧化[9]、抗心肌梗死[7]、保護肝腎[10]等多種藥理活性，具有潛在的應(yīng)用價值。課題組前期研究了五味子蜂花粉乙醇提取物及其主要成分對H2O2損傷H9c2心肌細(xì)胞的保護作用及其機制[11]，證實蜂花粉的抗氧化能力對心肌細(xì)胞損傷具有保護作用。油菜蜂花粉是蜂產(chǎn)品市場的熱銷品之一，Zhang等[9]通過比較不同蜂花粉中總酚和總黃酮含量及抗氧化能力的差異，發(fā)現(xiàn)油菜蜂花粉的總酚和總黃酮含量較高，抗氧化能力也較強。本文以常見蜂花粉—油菜蜂花粉乙醇提取物(rape bee pollen ethanol extract，RBPEE)為研究對象，鑒定其主要化學(xué)成分，并研究其對ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的干預(yù)作用及可能的分子機制，為蜂花粉資源的深度開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 蜂花粉

油菜(BrassicanapusL.)蜂花粉于2018年12月購自鮮蜂堂青海養(yǎng)蜂基地，按照國標(biāo)GB/T 30359-2013進行蜂花粉純度鑒定，純度大于95%，符合實驗要求，于4 ℃保存。

1.1.2 心肌細(xì)胞系

H9c2(2-1)(Procell CL-0089)心肌細(xì)胞株購買自普諾賽生命科技有限公司(武漢，中國)。

1.1.3 主要實驗試劑

純凈水(怡寶)；色譜級甲醇、乙腈(德國Merck)；甲酸、磷酸鹽緩沖溶液PBS(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；胎牛血清FBS、DMEM高糖培養(yǎng)基(賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司)；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(美國HyClone公司)；鹽酸異丙腎上腺素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；尿苷、鳥苷(純度≥98%)、卡托普利、細(xì)胞級DMSO(北京索萊寶科技有限公司)；BCA蛋白定量測定試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；YF?488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(YF?488-Phalloidin)(綠色)(蘇州宇恒生物科技有限公司)；TransZol UP試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；PCR引物(福州尚亞生物技術(shù)有限公司)。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

Agilent 1290 Infinity LC儀器、Agilent 6530 QTOF質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司)；5% CO2培養(yǎng)箱(C150)(Binder)；生物安全柜(Hfsafe-1500 A2電動型)(廣州莫菲公司)；倒置熒光顯微鏡(TS2-C-S-EC-ELWD 0.3)(Nikon)；倒置顯微鏡(TS-100f)(Nikon)；酶標(biāo)儀(Infinite F50、Infinite Pro200)(Tecan)；Real-Time System C1000 Touch Thermal Cycler PCR儀(BIORAD)；梯度PCR儀(Applied Biosystems)；超微量分光光度計(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)；培英HZQ-F100全溫雙層振蕩培養(yǎng)箱(濟南好來寶醫(yī)療器材有限公司)；FreeZone(Plus)4.5 L冷凍干燥機(賽默飛)；3K15臺式高速冷凍離心機(Sigma)。

1.2 實驗方法

1.2.1 RBPEE的制備及主要成分鑒定

1.2.1.1 RBPEE的制備

根據(jù)課題組前期研究[11]，用粉碎機將干燥后的蜂花粉粉碎，稱取蜂花粉粉末，以料液比1∶15加入70%乙醇混勻，進行搖床振搖提取(240 rpm，37 ℃)結(jié)合超聲提取(振搖24 h，超聲20 min)，重復(fù)操作2次。將提取液進行抽濾，濾液在4 ℃條件下，8 000 rpm離心10 min，取上清液于圓底燒瓶中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(46～50 ℃，0.07 MPa)至浸膏狀，收集底物進行冷凍干燥，收集凍干粉備用。

1.2.1.2 RBPEE主要成分鑒定

精確稱量10 mg蜂花粉凍干粉，將其溶解于1 mL的70%甲醇溶液中，渦旋2 min后超聲5 min，再14 000 rpm離心10 min，取上清液至進樣瓶中，用于UPLC-MS分析。

1.2.1.2.1 UPLC條件

UPLC分析在Agilent 1290 Infinity LC儀器上進行，該儀器由四元泵、自動進樣器、柱溫室和二極管陣列檢測器組成。樣品在Zorbax SB-C18色譜柱(3.5 μm，100 mm × 2.1 mm內(nèi)徑)上分離。流動相為超聲除氣后的0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫條件如下：0～3 min：10%(B)；3～10 min：10%～65%(B)；10～10.5 min：65%～80%(B)；10.5～15 min：80%(B)。UV檢測波長設(shè)定為254 nm。柱溫和流速分別設(shè)置為20 ℃和0.2 mL/min，進樣體積1 μL[11]。

1.2.1.2.2 Q-TOF MS條件

UPLC系統(tǒng)連接到配備Dual ESI電噴霧離子源的Agilent 6530 QTOF質(zhì)譜儀：毛細(xì)管電壓在(-)ESI模式下為3.5 kV；霧化器壓力為40 psig；干燥氣體(氮氣)流量為10.0 L/min，溫度為325 ℃；OCT 1 RF Vpp為750 V。掃描范圍為m/z100～1 500。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)樣品制備

完全培養(yǎng)基：10%胎牛血清+1%青霉素、鏈霉素雙抗+89% DMEM高糖培養(yǎng)基；不完全培養(yǎng)基：1%青霉素、鏈霉素雙抗+99% DMEM高糖培養(yǎng)基；細(xì)胞凍存液：55% DMEM高糖培養(yǎng)基+40%胎牛血清+5% DMSO。

使用細(xì)胞級DMSO配制蜂花粉以及卡托普利(Captopril)儲備液：RBPEE制成100 mg/mL的儲備液；卡托普利儲備液濃度為1 mmol/L。10 mmol/L的ISO儲備液用完全培養(yǎng)液直接溶解制得。臨用時，分別用完全培養(yǎng)液稀釋上述儲備液至所需濃度。

1.2.3 細(xì)胞分組及給藥

H9c2細(xì)胞經(jīng)種板孵育24 h后，按表1分組情況進行加樣：除陰性對照組加完全培養(yǎng)液，陽性對照組加0.1 mmol/L卡托普利，其他組加入對應(yīng)體積各濃度梯度RBPEE溶液進行培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后加入不完全培養(yǎng)液進行饑餓12 h，最后經(jīng)PBS清洗后，除陰性對照組加完全培養(yǎng)液，其余各組都加入50 μmol/L的ISO損傷細(xì)胞48 h。

表1 細(xì)胞分組給藥情況Table 1 Cell group administration

1.2.4 心肌細(xì)胞骨架染色及表面積測定

將各組給藥處理的H9c2心肌細(xì)胞根據(jù)YF?488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色說明書進行固定染色。細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后用含有4%多聚甲醛溶液冰上固定15 min，PBS清洗后再利用0.5% Trion X-100溶液在室溫下透化10 min，繼續(xù)用PBS清洗，隨后用200 μL PBS溶液稀釋5 μL YF熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲液配成染液，室溫避光孵育30 min進行染色。PBS清洗后在倒置熒光顯微鏡400倍的視野下進行觀察并拍照。每組隨機選取4～6個視圖，用Oplenic軟件對照片中心肌細(xì)胞的表面積進行測量，取其平均值。

1.2.5 細(xì)胞總蛋白含量、SOD和GSH的測定

細(xì)胞總蛋白含量、SOD和GSH測定方法根據(jù)測定試劑盒說明書微調(diào)后進行操作。即，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細(xì)胞并終止，1 000 rpm離心5 min，棄上清，再加入1 mL生理鹽水吹打混勻，1 000 rpm離心5 min棄上清，留細(xì)胞沉淀，再加入0.3 mL生理鹽水，冰水浴下電動研磨，每次15～20 s，間隔30 s，總共研磨4次，不離心根據(jù)蛋白定量測定試劑盒、SOD測定試劑盒(WST-1法)和微量還原型GSH測定試劑盒(微板法)說明書加樣表直接取樣檢測。

1.2.6 細(xì)胞MDA測定

細(xì)胞MDA含量測定方法根據(jù)測定試劑盒(微板法)說明書微調(diào)后進行操作。消化、清洗、離心后留沉淀加入0.5 mL試劑五提取液懸浮細(xì)胞，混勻2 min后冰水浴下電動研磨破碎細(xì)胞，每次15～20 s，間隔30 s，總共研磨4次，取0.1 mL破碎后的細(xì)胞懸液于1.5 mL離心管中(預(yù)先在管蓋上刺一個小孔)，然后根據(jù)說明書加樣表進行操作計算。

1.2.7 實時熒光定量PCR

按給藥分組情況處理細(xì)胞后按照TransZol UP試劑盒對各組細(xì)胞的RNA進行提取，并進行RNA濃度的測定。使用HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix 試劑盒，根據(jù)說明書將所得樣品的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。從65 ℃到95 ℃，以0.5 ℃/5 s逐漸增溫，同時檢測熒光信號來獲得熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器生成的循環(huán)閾值Ct，取重復(fù)組別的平均Ct值做數(shù)據(jù)分析，計算各基因的相對表達(dá)量。根據(jù)引物設(shè)計原則，利用NCBI網(wǎng)頁端設(shè)計PCR引物(見表2)。

表2 PCR擴增的引物序列Table 2 Primer sequences for PCR amplification

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用GraphPad Prism 8.0軟件單因素方差分析對各組樣品進行顯著性差異分析。當(dāng)P< 0.05時，表示具有顯著性差異；當(dāng)P< 0.01時，表示差異具有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 UPLC-ESI-QTOF MS分析RBPEE的主要成分

RBPEE在254 nm處的UV色譜圖和負(fù)離子模式的總離子流色譜圖見圖1，初步鑒定了7種主要成分，包括1種糖類、2種核苷類、1種多胺和3種黃酮類化合物，鑒定結(jié)果見表3。

表3 RBPEE中的各峰分配情況Table 3 Peak assignments for the analysis of RBPEE

圖1 RBPEE在254 nm的UV色譜圖(A)和負(fù)離子模式的總離子流色譜圖(B)Fig.1 UV chromatogram at 254 nm (A) and total ion chromatogram in negative ion mode of RBPEE (B)

峰1的[M-H]-離子的質(zhì)荷比為195.051 45，分子式為C6H12O7，不飽和度為1，該化合物初步推測為葡萄糖酸[11]。峰2的[M-H]-離子的質(zhì)荷比為243.062 16，分子式為C9H12N2O，不飽和度為5，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，該化合物鑒定為尿苷[11]；峰3的[M-H]-離子的質(zhì)荷比為282.084 06，分子式為C10H13N5，不飽和度為7，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，該化合物鑒定為鳥苷[11]。峰4的[M-H]-離子的質(zhì)荷比為436.223 02，分子式為C25H31N3O4，不飽和度為12，該化合物初步鑒定為N′,N′′-雙(對香豆酰)亞精胺[8]。峰5的[M-H]-離子的質(zhì)荷比為625.142 37，分子式是C27H30O17，不飽和度為13，該化合物初步鑒定為槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷[8]。峰6和峰7具有相同分子離子，其[M-H]-離子質(zhì)荷比分別為609.145 92和609.143 18，分子式為C27H30O16，不飽和度都為13，根據(jù)先前報道[8]，峰6初步鑒定為槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-鼠李糖苷，峰7鑒定為山奈酚-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷。

2.2 RBPEE對細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、表面積和總蛋白含量的影響

ISO處理48 h后，通過顯微(400×)觀察，發(fā)現(xiàn)陰性對照組細(xì)胞形態(tài)及生存狀態(tài)良好，未見異常變化，細(xì)胞呈單層簇狀，多呈放射狀的同心圓排列，收縮有力；模型組心肌細(xì)胞呈現(xiàn)顯著的病理性形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞核暗淡，間質(zhì)水腫，細(xì)胞肥大，胞間隙明顯縮小，排列紊亂。與模型組相比，卡托普利組和RBPEE處理組細(xì)胞形態(tài)及生存狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，心肌細(xì)胞形態(tài)回縮，細(xì)胞間隙恢復(fù)(見圖2)。各組細(xì)胞經(jīng)鬼筆環(huán)肽染色后，模型組與陰性對照組相比，細(xì)胞明顯肥大，細(xì)胞骨架的微絲密度增大，細(xì)胞形態(tài)中梭形占比減少、圓形占比增加，胞間隙明顯縮小，分布不均勻且排列紊亂，更易聚集成團。與模型組比較，卡托普利組和RBPEE處理組的細(xì)胞體積明顯縮小，形態(tài)恢復(fù)梭形，細(xì)胞骨架微絲密度顯著降低，細(xì)胞間隙增加，排列恢復(fù)齊整。

圖2 RBPEE對H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響(左:未染色，右:鬼筆環(huán)肽染色)Fig.2 Effect of RBPEE on morphology of H9c2 cardiomyocytes (left:no staining,right:phalloidin staining)注：A：陰性對照組；B：模型組；C：陽性對照組；D：低濃度組，E：中濃度組，F(xiàn)：高濃度組；“→”指示細(xì)胞失去梭形呈圓形；“○”標(biāo)注細(xì)胞胞間隙明顯縮小聚集成團。下同。Note:A:Negative control;B:Model;C:Positive control;D:Low concentration;E:Middle concentration;F:High concentration;“→” indicates a loss of spindle and a round shape;“○” note that the intercellular space is significantly reduced and aggregates.The same below.

細(xì)胞骨架染色后的細(xì)胞表面積結(jié)果如表4所示，模型組相較于陰性對照組的細(xì)胞表面積平均增大了40.28%，不同濃度的RBPEE處理后分別降低了24.93%(低濃度組)、26.58%(中濃度組)、29.24%(高濃度組)，且都具有顯著性差異(P< 0.01，相較于模型組)。

表4 RBPEE對H9c2細(xì)胞表面積的影響

RBPEE處理后的各組細(xì)胞經(jīng)過48 h的ISO損傷后，各組細(xì)胞總蛋白含量結(jié)果如圖3所示。模型組的總蛋白含量相較于陰性對照組顯著增加(P< 0.01)；與模型組相比，低、中、高濃度RBPEE預(yù)處理后，總蛋白含量均顯著降低(P< 0.01)。

圖3 RBPEE處理對心肌細(xì)胞總蛋白含量的影響(n = 6)Fig.3 Effect of RBPEE treatment on total protein content in cardiomyocytes (n = 6)注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01; Compared with model,## P < 0.01.

綜上，RBPEE能夠顯著降低肥大心肌細(xì)胞的表面積和總蛋白含量，對ISO致心肌細(xì)胞肥大具有保護作用。

2.3 RBPEE對心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平的影響

RBPEE處理后，心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP、BNP和β-MHC的mRNA表達(dá)水平如圖4所示。在ISO處理的模型組中，ANP、BNP和β-MHC的基因表達(dá)水平相較于陰性對照組顯著增加(P< 0.01)。與模型組相比，低、中、高濃度RBPEE組ANP和BNP基因表達(dá)水平顯著降低(P< 0.01)；中、高濃度RBPEE組β-MHC基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。綜上，RBPEE能夠顯著降低三種心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平，對ISO致心肌細(xì)胞肥大具有保護作用。

圖4 RBPEE處理對心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物基因表達(dá)的影響(n = 3)Fig.4 Effect of RBPEE treatment on the gene expression of hypertrophy markers in cardiomyocytes (n = 3)注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01;Compared with model, ## P < 0.01.

2.4 RBPEE對H9c2心肌細(xì)胞中SOD、GSH和MDA的影響

RBPEE處理后各組細(xì)胞中SOD活力和GSH、MDA的含量如表5所示。相較于陰性對照組，模型組中SOD活力和GSH含量都顯著降低(P< 0.01)，MDA含量則顯著升高(P< 0.01)。三種濃度RBPEE處理后的SOD活性和GSH含量較模型組顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)；MDA含量在RBPE處理后較模型組均顯著降低(P< 0.01)。實驗結(jié)果表明，給予RBPEE處理后可以降低ISO對H9c2心肌細(xì)胞造成的氧化損傷，提高細(xì)胞的抗氧化能力。

表5 RBPEE對H9c2細(xì)胞中SOD、GSH和MDA的影響Table 5 Effect of RBPEE on SOD,GSH and MDA in H9c2 cells = 6)

2.5 RBPEE對心肌細(xì)胞中炎癥相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)的影響

RBPEE處理對心肌細(xì)胞白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的mRNA表達(dá)水平的影響如圖5所示，相較于陰性對照組，模型組上述基因的表達(dá)水平均顯著增加(P< 0.01)；與模型組相比，低、中、高濃度RBPEE組IL-6和TNF-α的基因表達(dá)水平顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)；中、高濃度RBPEE組IL-2的基因表達(dá)水平顯著降低(P< 0.05，P< 0.01)。上述結(jié)果表明，給予RBPEE預(yù)處理后，可以顯著降低ISO對H9c2心肌細(xì)胞造成的炎癥反應(yīng)，提高細(xì)胞的抗炎能力。

圖5 RBPEE處理對心肌細(xì)胞炎癥相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)的影響(n = 3)Fig.5 Effect of RBPEE treatment on the gene expression of inflammation-related factors in cardiomyocytes (n = 3) 注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，# P < 0.05，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01;Compared with model, # P < 0.05,## P < 0.01.

2.6 RBPEE對心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)指標(biāo)mRNA表達(dá)的影響

在RBPEE處理后，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)和半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)的mRNA表達(dá)水平變化情況如圖6所示，模型組中上述基因的表達(dá)水平相較于陰性對照組均有顯著變化(P< 0.01)：除抗凋亡基因Bcl-2的基因表達(dá)水平和Bcl-2/Bax的比值顯著降低外，其余四個基因的表達(dá)水平都顯著提高；在低、中、高濃度的RBPEE處理后，Bax的基因表達(dá)水平相較于模型組顯著降低(P< 0.01)，而Bcl-2的基因表達(dá)水平以及Bcl-2/Bax的比值相較于模型組顯著提高(P< 0.05，P< 0.01)；在低、高濃度的RBPEE處理后，Caspase-3的基因表達(dá)水平相較于模型組顯著降低(P< 0.05)；在高濃度的RBPEE處理后，Caspase-8和Caspase-9的基因表達(dá)水平相較于模型組顯著降低(P< 0.01)。上述結(jié)果表明RBPEE可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而降低ISO誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞肥大損傷。

圖6 RBPEE處理對心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)的影響(n = 3)Fig.6 Effect of RBPEE treatment on the gene expression of apoptosis-related factors in cardiomyocytes (n = 3)注：與陰性對照組相比，** P < 0.01；與模型組相比，# P < 0.05，## P < 0.01。Note:Compared with negative control,** P < 0.01;Compared with model, # P < 0.05,## P < 0.01.

3 討論與結(jié)論

CH的特征主要有心肌細(xì)胞體積增大、蛋白質(zhì)合成增加、質(zhì)量變大以及心室壁增厚。ANP、BNP和β-MHC作為CH的分子標(biāo)記物，它們在CH進程中再表達(dá)，由心肌細(xì)胞自主產(chǎn)生和釋放，積極參與補償機制，調(diào)節(jié)心臟功能[5]。在本研究中，心肌細(xì)胞表面積明顯增大，總蛋白含量顯著增加以及三種心肌細(xì)胞肥厚性標(biāo)志物的mRNA表達(dá)水平顯著提高，表明ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型成功。使用RBPEE處理后，細(xì)胞表面積和總蛋白含量相較于模型組有顯著縮減，三種心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物mRNA的表達(dá)水平也有顯著降低，表明RBPEE對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大具有較好的預(yù)防效果。

正常情況下，由于機體可以通過SOD等抗氧化酶類以及GSH、類胡蘿卜素以及維生素C等非酶類抗氧化物等物質(zhì)來及時清除組織氧化代謝產(chǎn)生的過量自由基，從而保證機體內(nèi)自由基實現(xiàn)動態(tài)平衡，維持機體正常運作[10]。氧化應(yīng)激的損傷途徑主要是通過活性氧(ROS)與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)生過氧化反應(yīng)，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷與代謝障礙，進而引發(fā)各種疾病。當(dāng)細(xì)胞膜受ROS攻擊時，膜上磷脂分子中的不飽和脂肪酸氧化生成MDA等脂質(zhì)過氧化物。因此機體細(xì)胞受氧化損傷的程度通過細(xì)胞內(nèi)SOD活力、GSH含量以及MDA含量的變化來反映[11,12]。NF-κB途徑被認(rèn)為是促炎信號傳導(dǎo)途徑，經(jīng)氧化應(yīng)激反應(yīng)激活的NF-κB可以從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核，從而促進細(xì)胞促炎介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，如IL-6和TNF-α等[13]。因此檢測促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)量可以判斷心肌細(xì)胞受炎癥反應(yīng)的影響程度。我們利用ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大會使細(xì)胞中的SOD活力和GSH含量顯著降低，MDA含量顯著升高，心肌細(xì)胞中IL-6、TNF-α和IL-2的mRNA表達(dá)水平顯著提高，表明心肌細(xì)胞肥大伴隨著氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)RBPEE處理后，SOD活力和GSH含量顯著增加、MDA含量顯著降低、三種炎癥反應(yīng)因子的基因表達(dá)水平顯著降低，表明RBPEE可以通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來預(yù)防ISO對心肌細(xì)胞的損傷作用。

細(xì)胞凋亡的主要途徑有外源性途徑(死亡受體途徑)、內(nèi)源性線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[14]。在死亡受體途徑中，Caspase-8在被死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)激活后，啟動信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致末端效應(yīng)器Caspase-3或Caspase-7等的自動活化，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡信號[14]。在線粒體途徑中，當(dāng)線粒體受到外界刺激后，Bcl-2家族中的凋亡促進因子Bax調(diào)控線粒體外膜通透性，促使線粒體外膜透化，導(dǎo)致線粒體膜腔隙內(nèi)的細(xì)胞色素C與三磷酸脫氧腺苷(dATP)、凋亡蛋白酶激活因子(APAF1)形成凋亡多聚體復(fù)合物，釋放至胞漿，招募半胱氨酸蛋白酶9前體(pro-Caspase-9)，引起Caspase-9活化，啟動信號級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。Bcl-2是Bcl-2家族中的抗凋亡成員，Bcl-2與Bax的比值是評價心肌細(xì)胞凋亡的一個有效指標(biāo)[11]。在本實驗中，通過測定各處理組中Bcl-2、Bax、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的基因表達(dá)水平來判斷心肌細(xì)胞凋亡情況。實驗結(jié)果顯示ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大損傷伴隨著細(xì)胞凋亡進程。RBPEE預(yù)處理對Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3和Bax的基因表達(dá)水平具有顯著的抑制作用，Bcl-2的基因表達(dá)水平和Bcl-2/Bax的比值較模型組顯著升高，表明RBPEE對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有預(yù)防作用。

本實驗采用UPLC-QTOF MS對RBPEE的化學(xué)成分進行定性分析，初步鑒定了RBPEE中7種主要成分，包括1個糖類(葡萄糖酸)、2個核苷類(尿苷和鳥苷)、1個多胺類(N′,N′′-雙(對香豆酰)亞精胺)和3個黃酮二糖苷類化合物(槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-鼠李糖苷和山奈酚-3-O-(2′′-O-吡喃葡萄糖基)-吡喃葡萄糖苷)。研究表明尿苷和鳥苷都具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[15-17]；N1,N5-雙(對香豆酰)亞精胺具有良好的抗氧化性，可以提高細(xì)胞中總抗氧化能力，提高細(xì)胞中抗氧化酶SOD、CAT和GPx的酶活性，降低脂質(zhì)氧化水平[18]；黃酮二糖苷類化合物的苷元如槲皮素、山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等藥理作用[19,20]。因此，核苷類、多胺類和黃酮類化合物可能是RBPEE發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡作用的有效成分。

綜上，RBPEE對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大具有一定的預(yù)防作用，其作用機制可能與降低氧化應(yīng)激水平、抑制炎癥反應(yīng)和抗凋亡作用密切相關(guān)。