氧化苦參堿對特應(yīng)性皮炎模型小鼠的保護作用

孫 赟陳桂芳高 娟張麗娟張 祎*王睿睿*

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500；2.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實驗室，昆明 650500)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種較為常見的慢性皮膚疾病，容易復(fù)發(fā)，常發(fā)病于嬰兒和兒童，少見發(fā)病于成年人。AD是一種特殊類型的濕疹[1－2]，其主要癥狀是皮膚瘙癢，伴隨不同程度的皮屑脫落和皮膚潰爛，嚴重者甚至?xí)a(chǎn)生睡眠障礙，具有慢性遷延和反復(fù)發(fā)作的特征。近年來AD的發(fā)病是呈上升的趨勢[3]，目前發(fā)病機制尚未完全闡明，其病因十分復(fù)雜，可能與遺傳、免疫、環(huán)境、感染、精神心理、皮膚屏障受損等多種因素有關(guān)[4]。

中西醫(yī)治療AD的方法各有不同[5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)從基因、免疫、皮膚屏障功能、感染等多種因素進行了深入的研究，在診斷以及流行病學(xué)方面取得了一定成績。對于AD的治療，常用方法是使用抗組胺藥，以及在局部使用潤膚劑、皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑等，但使用時間過長會產(chǎn)生副作用，患者耐受程度較低。中醫(yī)對AD疾病的治療藥物較多，有湯劑，散劑、油膏劑、外洗劑等，包括了口服和外用等劑型，在治療和減少復(fù)發(fā)方面均有一定特色和優(yōu)勢[6]。

氧化苦參堿具有廣泛的藥理作用，如抗病毒、抗炎、抗心律失常、抗纖維化、免疫抑制及抗腫瘤等[7－12]，研究標明，氧化苦參堿可改善小鼠濕疹及慢性濕疹皮損，顯著減輕炎癥反應(yīng)[13－16]。本文擬探討氧化苦參堿治療AD小鼠模型的藥效作用和初步作用機制，為AD治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，雌雄各半，6~8周齡，體重(20±2)g；SPF級雌性BALB/c小鼠，6~8周齡，體重(20±2)g，均購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]。小鼠飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境中[SYXK(滇)2017-005]，溫度:22℃~24℃，濕度:45%~55%，光照12 h為一個循環(huán)。本實驗經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查委員會審查(R-0620160015)，符合國家實驗動物福利相關(guān)規(guī)定。實驗遵循實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

氧化苦參堿，≥98%(HPLC)，上海源葉生物科技有限公司，批號Y30S6Y17043；醋酸地塞米松，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號170512；右旋糖酐，Biotopped公司，批號17-0270-01；2，4-二硝基氯苯，成都貝斯特試劑有限公司，批號Z0016B5；丙酮，云南楊林工業(yè)開發(fā)區(qū)油滇藥業(yè)有限公司，批號20160325；橄欖油，山東魯花集團有限公司，批號20180803；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市光復(fù)精細化工研究所，批號50116；IgE ELISA試劑盒，聯(lián)科生物，批號A27591234；IL-4 ELISA試劑盒，聯(lián)科生物，批號A20481252；IL-13 ELISA試劑盒，聯(lián)科生物，批號A21300855。全波長多功能酶標儀，昆明倍捷科技有限公司，型號:Plus384；－80℃超低溫冰箱，美國Thermo Forma公司，型號:Forma 902；低溫高速離心機，德國Eppendorf公司，型號:5810R；電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司，型號:AR224CN。

1.3 實驗方法

1.3.1 氧化苦參堿對右旋糖酐致小鼠瘙癢模型的影響

將50只KM小鼠按性別體重隨機分為5組，設(shè)空白對照組、模型對照組、陽性對照組(醋酸地塞米松1.5 mg/kg)以及氧化苦參堿高、低劑量(100、50 mg/kg)組，每組10只；地塞米松組、氧化苦參堿各劑量組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每日2次，連續(xù)7次。空白對照組、模型對照組灌胃等體積的0.5%CMC-Na。末次給藥后10 min，在每只小鼠左后足腳墊內(nèi)注射右旋糖酐50μL，觀察并記錄15 min內(nèi)小鼠舔后足的次數(shù)，小鼠連續(xù)舔后足出現(xiàn)短暫停頓記為1次瘙癢。

1.3.2 氧化苦參堿對AD模型小鼠的影響

60只BALB/c小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組(BC)、模型對照組(DEX)、陽性對照組(醋酸地塞米松2 mg/kg)(OXM)、氧化苦參堿低、中、高劑量組(25、50、100 mg/kg；OXY-L、OXYM、OXY-H)，每組8只。實驗前1 d，所有小鼠用電推剪加脫毛膏進行背部脫毛(2 cm×2 cm)，暴露皮膚；實驗第1、2天，除空白對照組外，其余小鼠在背部皮膚涂抹以丙酮-橄欖油混合溶液為溶媒配制的3%2，4-二硝基氯苯(DNCB)溶液，每次100μL，第3~6天不作任何處理，第7天開始每隔2 d涂抹1次1%DNCB溶液，每次70μL，共3次?？瞻讓φ战M小鼠背部皮膚僅涂抹丙酮-橄欖油混合溶液，涂抹時間和體積與造模組一致。自實驗第1天開始各組分別灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)給藥14 d，每天稱重。末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后30 min麻醉，腹主動脈取血，剖取脾和胸腺、稱重，計算臟器系數(shù)，剪取背部造模處皮損組織切為兩部分，一部分置于－80℃冰箱，一部分置于10%中性福爾馬林溶液中備用。

分離血清，采用ELISA試劑盒測定血清中總IgE和Th2型細胞因子IL-4、IL-13的含量；10%中性福爾馬林固定的皮損組織經(jīng)脫水、透蠟、包埋、切片等制備成病理切片，HE染色觀察一般組織病理學(xué)變化；石蠟切片經(jīng)脫蠟進行甲苯胺藍(TB)染色以觀察皮損組織真皮層中肥大細胞(mast cell，MC)的浸潤情況，每組隨機選取8個視野，拍照，封片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad prism 8.0.2軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以平均數(shù)±標準差(±s)表示，用單因素方差分析和t檢驗分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧化苦參堿對瘙癢模型小鼠的影響

與模型對照組相比，氧化苦參堿高低劑量可減少小鼠的抓癢次數(shù)(P<0.01)，對右旋糖酐所致瘙癢有一定程度的抑制，以50 mg/kg效果較佳，因此選擇此劑量為受試劑量繼續(xù)探究氧化苦參堿對特應(yīng)性皮炎實驗的干預(yù)效果及初步作用機制(圖1)。

圖1 對右旋糖酐所致小鼠瘙癢的影響(n＝10)Figure 1 Effect of oxymatrine on itching mice model induced by dextran

2.2 氧化苦參堿對AD模型小鼠的影響

2.2.1 氧化苦參堿對AD小鼠一般情況的影響

與模型對照組相比，陽性對照組小鼠體重偏低，氧化苦參堿各劑量12 d后小鼠體重均呈現(xiàn)上升趨勢(圖2)。

圖2 對AD小鼠體重的影響(n＝8)Figure 2 Effect of oxymatrine on the body weight of AD mice

2.2.2 氧化苦參堿對AD模型小鼠臟器系數(shù)的影響

與模型對照組相比，氧化苦參堿高劑量可降低AD模型小鼠的胸腺系數(shù)(P<0.01)表現(xiàn)出類似地塞米松樣的免疫抑制作用；氧化苦參堿高中劑量可降低小鼠脾系數(shù)(P<0.05)，推測可能與抑制被過度激活的B淋巴細胞有關(guān)(圖3)。

圖3 對AD模型小鼠臟器系數(shù)的影響(n＝8)Figure 3 Effect of oxymatrine on organ coefficients of AD model mice

2.2.3 氧化苦參堿對血清總IgE含量的影響

與空白對照組相比，模型對照組小鼠外周血總IgE含量增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型對照組比較相比，陽性藥和氧化苦參堿高劑量均能顯著抑制AD模型小鼠外周血總IgE的表達(P<0.05)(圖4)。

圖4 對AD小鼠外周血總IgE含量的影響(n＝8)Figure 4 Effect of oxymatrine on the total IgE content of peripheral blood in AD mice

2.2.4 氧化苦參堿對外周血Th2型細胞因子含量的影響

與空白對照組相比，模型對照組小鼠外周血IL-4、IL-13含量均有增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型對照組相比，陽性藥和氧化苦參堿均能顯著抑制AD模型小鼠外周血IL-4、IL-13含量的表達(P<0.05)(圖5)。

圖5 對小鼠血清Th2型細胞因子的影響(n＝8)Figure 5 Effect of oxymatrine on the content of Th2 type cytokine in AD mice serum

2.2.5 氧化苦參堿對AD模型小鼠皮損組織病理的影響

與空白對照組相比，模型對照組小鼠皮損處皮膚結(jié)構(gòu)嚴重受損，角化過度，棘層肥厚明顯伴灶性海綿水腫，真皮血管擴張充血并伴有大量炎癥細胞浸潤，毛囊結(jié)構(gòu)減少。與模型對照組相比，陽性對照組小鼠表皮各層結(jié)構(gòu)較清晰，表皮增厚明顯減輕，真皮未見血管擴張，炎性細胞較模型組明顯減輕，毛囊結(jié)構(gòu)明顯增多；氧化苦參堿各劑量組小鼠皮膚炎性細胞浸潤減少，角質(zhì)層角化不全有所緩解(圖6)。

圖6 對小鼠皮損皮膚一般組織病理的影響(HE染色)Figure 6 Effect of oxymatrine on the general histopathology of skin lesions in mice(HE staining)

2.2.6 氧化苦參堿對AD模型小鼠皮損肥大細胞浸潤的影響

與空白對照組相比，模型對照組小鼠皮損處肥大細胞浸潤明顯增多；與模型對照組相比，地塞米松和氧化苦參堿各劑量均能顯著減少皮損處肥大細胞的浸潤，具體結(jié)果見圖7。

圖7 對小鼠皮損肥大細胞浸潤的影響(TB染色)Figure 7 Effect of oxymatrine on mast cell infiltration in the lesions of AD model mice(TB staining)

3 討論

AD是慢性易復(fù)發(fā)的皮膚炎癥性疾病，發(fā)病機制復(fù)雜，其中免疫功能異常是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細胞免疫中T淋巴細胞在AD中的作用已較為明確，在急性期AD病變主要由Th2細胞和IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子主導(dǎo)，慢性期以Th1型細胞反應(yīng)為主[17－19]。Th2細胞分泌的IL-4、IL-5、IL-13可誘導(dǎo)淋巴B細胞產(chǎn)生IgE，間接活化肥大細胞。因此，在AD發(fā)病機制中，Th2型細胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13即是調(diào)控AD的關(guān)鍵細胞因子，同時肥大細胞活化后會產(chǎn)生一系列炎癥因子，并與T細胞、嗜酸性粒細胞等相互作用，共同參與AD的皮膚瘙癢和炎癥反應(yīng)過程，證明Th細胞、B淋巴細胞及肥大細胞均在AD機制中扮演重要角色。因此，抑制Th2型細胞因子表達，調(diào)控肥大細胞應(yīng)該能夠有效抑制AD。

本研究表明，中藥苦參中有效成分氧化苦參堿能明顯改善小鼠的皮膚病理癥狀、減輕皮膚增厚，減少肥大細胞的數(shù)目以及Th2型細胞因子等在皮膚組織的表達，對AD小鼠有治療作用，并提示氧化苦參堿治療AD小鼠的作用機制可能與減少皮膚真皮層中肥大細胞浸潤、減輕Th2型細胞因子的表達有關(guān)，但氧化苦參堿如何通過下調(diào)Th2型細胞因子表達進而減少肥大細胞的募集和激活還有待于進一步的研究。