血小板微粒介導miR-4306調(diào)控糖尿病大鼠主動脈血管內(nèi)皮細胞損傷的作用及機制研究

王瑞青鄭彩虹朱 巍郭彩紅

(1.北京航天總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100076；2.山西白求恩醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 030000)

糖尿病患者所引起的心血管疾病風險大約是正常人群的3倍，動脈粥樣硬化是糖尿病性心血管疾病的主要病理疾病，其中主動脈血管內(nèi)皮功能損傷在糖尿病所致的早期動脈粥樣硬化中起關(guān)鍵作用[1]，一氧化氮(notric oxide，NO)水平降低及內(nèi)皮通透性增加等是糖尿病致心血管病變的重要原因。以往研究糖尿病與內(nèi)皮功能損傷之間機制多集中于炎癥、氧化應激、高血糖及胰島素抵抗等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病(diabetic metillus，DM)、冠心病等疾病血小板激活明顯增強，激活的血小板具有促凝作用，導致血管內(nèi)皮損傷；血小板激活后能夠產(chǎn)生血小板微顆粒(platelet microparticles，PMPs)，PMPs黏附到血管壁釋放花生四烯酸，介導炎癥因子和黏附分子附著于內(nèi)皮細胞，減少一氧化氮的合成和一氧化氮合酶的活性，損傷內(nèi)皮功能，此外PMPs與低密度脂蛋白、脂肪酸相關(guān)，加重對內(nèi)皮損傷，加速動脈粥樣硬化的進展[2－3]。DM患者血漿中PMPs表達量明顯升高，但DM合并早期動脈粥樣硬化患者血漿中PMPs是否參與DM主動脈血管內(nèi)皮損傷，其具體的作用機制是什么是尚不清楚。本研究通過探討分析PMPs在DM主動脈血管內(nèi)皮損傷的作用及機制研究，以期為臨床治療糖尿病大血管并發(fā)癥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

60只8~12周齡健康雄性SD大鼠，SPF級，體重(200±20)g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2015-0123]，所有實驗動物均飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所屏障動物房SYXK號(京)2019-0023]，飼養(yǎng)環(huán)境為:溫度20℃~25℃，內(nèi)外環(huán)境氣壓差≥10 Pa，相對濕度在40%~70%，照明強度在15~20 lx，動物自由取食飲水。本實驗經(jīng)過北京航天總醫(yī)院IACUC的批準(MAM17039)；本研究依照3R原則(the rules of 3R)實施。

1.2 主要試劑與儀器

CD61流式抗體(美國BD公司)；凝血酶、阿司匹林、Hepes(美國Sigma公司)；RNA提取試劑盒Biozol、脫 氧 核 糖 核 酸(dNTP)、VEGFA、ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65及GAPDH鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；鼠抗人單克隆抗體eNOS、兔抗人多克隆抗體Caspase-3(Cell Signaling technology公司)。FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；HT7700透射電鏡(日本Hitachi公司)；實時定量PCR儀(德國eppendorf公司)；LKB-Bromma 2197型電泳儀(瑞典LKB公司)；microlab 300半自動化分析儀(荷蘭威圖公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物造模及分組

60只大鼠隨機分為對照組(NC組，n＝30)和DM組(DM組，n＝30)。其中NC組、DM組均給予等體積的生理鹽水。DM組大鼠造模:高脂高糖飼料(普通飼料中加入10%蔗糖、5%蛋黃及10%煉豬油)喂養(yǎng)，4周后禁食12 h，按照45 mg/kg經(jīng)腹腔注射STZ(溶于pH＝4.4、濃度為0.1 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中)，NC組腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。于注射第3天通過尾靜脈取血測定各組隨機血糖。注射STZ后隨機血糖仍高于16.7 mmol/L表明造模成功[4]。所有動物待造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)8周。

1.3.2 PMPs分離提取及鑒定

造模成功8周后，禁食12 h，于第2天按照50 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉處理，將收集的血液置于含有檸檬酸鹽的BD管中，采用漸進性離心法制備無血小板血漿，以缺乏血小板血漿校準富血小板血漿，調(diào)整血小板計數(shù)在10.0×1010/L。采用ADP(10μmol/L)20μL刺激富血小板血漿15 min，3700 r/min離心5 min。棄去上清液，加入PBS 80μL后將PMPs進行重懸，制得PMPs懸液。取20 μL PMPs液和20μL富血小板血漿液于2個流式管中，分別加入5μL APC-FITC-CD61鼠抗人抗體。震蕩搖勻后，室溫避光孵育30 min，采用1%多聚甲醛進行固定。流式細胞術(shù)檢測之前加入0.82μm標準微球5μL進行定位。每組PMPs通過分光光度計法測定PMPs中蛋白含量，調(diào)整每組PMPs蛋白含量在0.25 mg/L，用于后續(xù)各項實驗。

1.3.3 大鼠主動脈VECs培養(yǎng)、鑒定

選取正常SD大鼠3只，無菌條件下打開胸腔，取胸主動脈置于無菌D-Hanks液中，取出外周結(jié)締組織、殘留血液。制備VECs，將獲得主動脈組織置于含有20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6 d左右，棄去主動脈并換液。細胞原代培養(yǎng)至融合80%，即傳代，每隔1 d換液1次。細胞傳第2代后，待細胞爬片生長融合至70%左右，用4%多聚甲醛固定，加入3%過氧化氫室溫孵育，PBS沖洗后加入非免疫山羊血清封閉1 h，滴加Ⅷ因子抗體(1∶100稀釋)，4℃過夜。沖洗掉一抗后加入辣根過氧化酶標記的兔抗鼠IgG(1∶500稀釋)，經(jīng)乙醇梯度洗脫，二甲苯透明后，中性樹脂封片，采用PBS代替一抗作為陰性對照。每張蓋玻片隨機選擇5個視野計數(shù)細胞。

1.3.4 VECs與PMPs共培養(yǎng)

在12孔板中培養(yǎng)VECs至細胞融合80%左右，經(jīng)PBS沖洗后，每孔加入1 mL不含抗生素的高糖DMEM/F12，將不同組別的PMPs加入到細胞中，搖勻后放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，分別共培養(yǎng)2、4、8、12 h后收集細胞。采用CCK-8法檢測不同時間VECs細胞增殖活性，以細胞活性抑制率達到50%左右[(某一作用時間點－剛加藥后)/剛加藥后]為最佳作用時間。

1.3.5 免疫熒光激光共聚焦檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達

取對數(shù)生長的VECs，調(diào)整細胞數(shù)5×104/L并接種于置有蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁以后按照各組別分別給予PMPs預處理，根據(jù)1.3.4項所確定的最佳作用時間孵育細胞后，經(jīng)3.5%的多聚甲醛固定10 min，0.2%Triton X-100冰上破膜15 min，采用3.0%牛血清蛋白封閉抗原封閉30 min，沖洗后加入鼠抗人單克隆抗體eNOS、兔抗人多克隆抗體Caspase-3后4℃孵育過夜，次日采用FITC二抗孵育1 h，再經(jīng)DAPI染核后在激光共聚焦顯微鏡下隨機選取視野進行拍照，實驗重復3次。

1.3.6 流式細胞術(shù)檢測VECs凋亡情況

取對數(shù)生長的VECs，調(diào)整細胞數(shù)為5×104/L并接種于置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁以后按照各組別分別給予PMPs預處理，根據(jù)1.3.4項確定的最佳作用時間孵育細胞，培養(yǎng)結(jié)束后消化細胞，將細胞轉(zhuǎn)移至EP管中離心(12000 r/min離心10 min)，PBS沖洗后加入binding buffer，調(diào)整細胞為每mL 106個，從中吸取500μL并加入2.5μL AnnexinV和5.0μL PI，孵育5 min后，過300目篩上機檢測。

1.3.7 qRT-PCR檢測miR-4306表達情況

將0.5μL Has-micro-4306-mimics、microRNAinhibitor-NC以及Has-micro-4306-inhibitor分別與100μL DMEM/F12以及2μL Lipofectamine混合，將混合液按照每孔15μL接種于培養(yǎng)有VECs的12孔板上，培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基。加入不同組別PMPs后，后續(xù)按照1.3.4項中最佳最用時間繼續(xù)培養(yǎng)細胞。按照處理方式不同分為正常PMPs組(Ctrl組)、正常PMPs＋MicroRNA-inhibitor-NC組(miR-NC組)、正常PMPs＋Has-micro-4306-mimics組(mimic-NC組)、正常PMPs＋Has-micro-4306-inhibitor組(inhibitor-NC組)、模型PMPs組(M組)、模型PMPs＋MicroRNA-inhibitor-NC組(miR-M組)、模型PMPs＋Has-micro-4306-mimics組(mimic-M組)、模型PMPs＋Has-micro-4306-inhibitor組(inhibitor-M組)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞。按照試劑盒要求提取各組細胞中總RNA，嚴格按照PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄cDNA。反應體系:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10μL，PCR引物2μL，DNA模板2μL，DEPC水6μL，總反應體系為20μL。每個樣本設(shè)置3個復孔，PCR反應條件:95℃預變性20 s，94℃變性5 s，55℃退火45 s，共進行40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，反應結(jié)束后計算每個基因的循環(huán)閾值(Ct)，同時與內(nèi)參基因U6比較，確定各組基因表達水 平。 miR-4306上游引物序列: 5’-GCTAACCCGCCGGACACTTTTCACCTTA-3’；下游引物序列:5’-CGGTTCGACAACTATTTAGCTACA-3’，基因片段大小212 bp。內(nèi)參U6上游引物序列:5’-GTCGCATCAGCTAGCTTTTCAGGCTA-3’；下游引物序列:5’-GCCTATACGCTCGTCATCGGTAGT-3’，基因片段大小124 bp。

1.3.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測VEGFA/ERK1/2/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白

取各組細胞懸液經(jīng)離心沉淀后，收集細胞后加入200μL細胞裂解液(含有蛋白酶抑制劑)至冰上裂解45 min，再以12000 r/min離心30 min，取上清液，采用考馬斯亮藍進行總蛋白質(zhì)定量。上清液中加入1/4倍量5×SDS上樣緩沖液混合，煮沸7~8 min，以10%SDS-PAGE膠體，在120 V電壓，200 mA恒定電流下電泳2 h，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上。采用5%的脫脂奶粉TBST緩沖液封閉(4℃過夜)，洗去封閉液，加入鼠抗人VEGFA、ERK、p-ERK、IκBα、p-IκBα、NF-κBp65，TBST洗膜3次后，加入標記有辣根過氧化物酶二抗(山羊抗小鼠IgG)室溫孵育1 h，經(jīng)TBS洗膜3次后，將化學熒光發(fā)光底物均勻地加到膜的表面，置于曝光試劑盒中曝光，顯影、定影等，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值。掃描目標蛋白灰度值與GAPDH比較所得的灰度值比進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行分析處理。正態(tài)分布資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示，組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni’s postt檢驗，基因檢測結(jié)果ΔCt值作圖，采用2－ΔΔCt行非參數(shù)檢驗，△Ct值＝Ct(miR-4306均值)－Ct(U6均值)，2－△△Ct中 的 △△Ct ＝[( Ct(實驗樣本miR-4306均值)－Ct(實驗樣本U6均值)]－[(Ct(對照樣本miR-4306均值)－Ct(對照樣本U6均值)]。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PMPs與VECs分離、鑒定

采用Western blot及流式細胞檢測法分析鑒定，結(jié)果顯示，與富血小板血漿比，PMPS中CD61表達明顯升高(P<0.05)，見圖1A、1B。原代培養(yǎng)VECs結(jié)果顯示，細胞為“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)，細胞經(jīng)免疫組化染色后，細胞質(zhì)顏色明顯加深，Ⅷ因子呈高表達，因此鑒定細胞為VECs，見圖1C。

圖1 PMPs及VECs的鑒定結(jié)果Figure 1 Identification results of PMPs and VECs

2.2 CCK-8法檢測PMPs對VECs細胞增殖活性的影響

研究結(jié)果顯示，DM組在PMPs作用2 h后，與0 h比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，VECs與PMPs共培養(yǎng)4 h后，細胞出現(xiàn)明顯的固縮變形，細胞形態(tài)不完整，有內(nèi)陷，結(jié)構(gòu)破壞嚴重。當作用4、8、12 h，細胞抑制率分別為48.44%(40.27%~54.37%)、63.41%(57.69%~72.33%)、66.26%(58.60%~74.24%)，與0 h比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，因此選擇作用4 h為最佳作用時間，見圖2。

圖2 CCK-8法檢測不同時間各組PMPs對VECs細胞增殖活性的影響Figure 2 CCK-8 method to detect the effect of PMPs in each group on the proliferation activity of VECs at different times

2.3 細胞凋亡情況分析

研究結(jié)果顯示，DM組細胞凋亡率(51.23±12.14)%，與NC組(9.27±3.04)%比差異有統(tǒng)計學意義(t＝12.547，P<0.01)，見圖3。

圖3 流式細胞術(shù)檢測不同組別細胞凋亡情況Figure 3 Flow cytometry to detect cell apoptosis in different groups

2.4 免疫熒光激光共聚焦檢測eNOS、Caspase-3表達

免疫熒光激光共聚焦結(jié)果顯示，DM組eNOS陽性表達率(82.54±19.58)%，與NC組(42.55±19.58)%比差異有統(tǒng)計學意義(t＝12.336，P<0.01)。DM組Caspase-3陽性表達率(26.39±7.91)%，與NC組(54.32±11.07)%比差異有統(tǒng)計學意義(t＝8.034，P<0.01)，見圖4。

圖4 免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測eNOS、Caspase-3表達情況Figure 4 Expression of eNOSand Caspase-3 detected by immunofluorescence laser confocal microscope

2.5 Western blot檢測VEGFA/ERK1/2/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達

研究結(jié)果顯示，mimic-NC組、inhibitor-NC組、M組、miR-M組、mimic-M組VEGFA、NF-κBp65、p-IκBα及p-ERK相對表達量與Ctrl組比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。mimic-M組、inhibitor-M組VEGFA、NF-κBp65、p-IκBα及p-ERK相對表達量與M組比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

圖5 Western blot檢測VEGFA/ERK1/2/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達Figure 5 Western blot detects the related proteins expression of VEGFA/ERK1/2/NF-κB signaling pathway

2.6 qRT-PCR檢測miR-4306轉(zhuǎn)染率情況

研究結(jié)果顯示，mimic-NC組、inhibitor-NC組miR-4306相對表達量與miR-NC組比，差異有統(tǒng)計學意義(t＝3.792、4.496，P<0.05或P<0.01)；mimic-M組、inhibitor-M組miR-4306相對表達量與miR-M組比，差異有統(tǒng)計學意義(t＝3.821、4.597，P<0.05或P<0.01)。mimic-NC組miR-4306相對表達量與inhibitor-NC組比，差異有統(tǒng)計學意義(t＝6.794，P<0.01)；mimic-M組miR-4306相對表達量與inhibitor-M組比，差異有統(tǒng)計學意義(t＝8.115，P<0.01)。M組miR-4306相對表達量與Ctrl組比，差異有統(tǒng)計學意義(t＝5.032，P<0.01)，見圖6。

圖6 qRT-PCR檢測不同組別miR-4306相對表達情況分析Figure 6 Relative expression of miR-4306 in different groups detected by qRT-PCR

3 討論

DM及其血管并發(fā)癥的發(fā)病率逐年上升，已成為全球亟待解決的熱點課題。研究顯示，DM患者心血管死亡風險發(fā)生率較一般人員高三倍[5]。動脈粥樣硬化是糖尿病心血管疾病的病理生理障礙基礎(chǔ)，內(nèi)皮功能損傷在早期動脈粥樣硬化中起關(guān)鍵作用[6]。血小板活化后導致血小板收縮、變形以及形成偽足，變形后的一些細胞膜會以出芽的方式形成小泡且脫落形成PMPs[7]。PMPs水平異常與冠心病、DM、類風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。研究顯示，PMPs主要通過PMPs攜帶的RNA和膜蛋白發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和生物信息傳遞作用，降低內(nèi)皮的增殖、分化及遷移，已證實與動脈粥樣硬化有關(guān)[9－10]。DM模型PMPs對血管內(nèi)皮細胞增殖的影響及其作用機制如何值得研究。通過本研究發(fā)現(xiàn)，DM模型PMPs與內(nèi)皮細胞共孵育后，增殖活性隨著時間明顯降低，且在培養(yǎng)4 h后出現(xiàn)明顯的細胞凋亡，細胞出現(xiàn)固縮邊緣，細胞完整性明顯被破壞，提示DM血漿中PMPs可能造成內(nèi)皮細胞損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，PMPs能夠降低細胞內(nèi)一氧化氮表達從而介導炎癥因子的表達，而這一作用與eNOS表達量顯著相關(guān)[11]。為了探討DM模型血漿中PMPs造成血管內(nèi)皮細胞損傷的原因是否與eNOS表達量有關(guān)，本研究采用激光共聚焦技術(shù)顯示，經(jīng)DM患者血漿PMPs處理的內(nèi)皮細胞(DM組)中eNOS陽性表達率顯著低于正常大鼠血漿PMPs處理組(NC組)，提示DM模型血漿中PMPs可能通過降低主動脈血管內(nèi)皮細胞中eNOS表達量，導致NO水平降低，誘發(fā)細胞凋亡。已有研究顯示，PMPs能夠誘導血管內(nèi)中性粒細胞活化，而中性粒細胞中釋放多種因子引起內(nèi)皮細胞損傷，進而導致血管內(nèi)皮通透性升高以及Caspase-3高表達，內(nèi)皮細胞凋亡率則明顯升高[12]，Caspase-3的升高能激活核酸內(nèi)切酶切割DNA并最終誘發(fā)細胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DM患者血漿PMPs處理的內(nèi)皮細胞(DM組)Caspase-3陽性率顯著高于正常大鼠血漿PMPs處理組(NC組)，這一結(jié)果提示DM模型中PMPs參與了DM動脈血管內(nèi)皮損傷，其主要原因可能與內(nèi)皮細胞凋亡因子Caspase-3高表達及血管內(nèi)皮細胞生長因子低表達存在明顯關(guān)系。

微小RNA(miRNAs)在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[13]。miR-4306是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNAs，有研究發(fā)現(xiàn)，在冠狀動脈疾病中人單核細胞衍生的巨噬細胞中miR-4306顯著上調(diào)，而miR-4306表達上調(diào)可以通過Akt/NF-κB信號通路導致血管內(nèi)皮損傷[14－15]。NF-κB是已經(jīng)被證實為炎癥誘發(fā)的關(guān)鍵因子，其調(diào)控信號通路被激活后將促進炎癥因子等的高表達；VEGFA是一種具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖作用的細胞因子，其能夠激活ERK信號通路，促進血管細胞的生長、增殖。為了探討DM模型中PMPs引血管內(nèi)皮細胞凋亡原因是否與miR-4306表達有關(guān)，本研究采用RT-PCR技術(shù)檢測不同組別中miR-4306表達情況。本研究加入了miR-4306模型劑和抑制劑，結(jié)果顯示加入mimic-4306后，通過分析研究顯示，經(jīng)DM患者血漿PMPs處理的內(nèi)皮細胞(DM組)中miR-4306相對表達量顯著升高，而Has-micro-4306-mimics和Has-micro-4306-inhibitor具有促進和抑制miR-4306表達的作用，提示DM模型血漿PMPs可能作用于miR-4306，且該miRNAs對內(nèi)皮細胞生長、凋亡產(chǎn)生作用。

為了進一步分析PMPs介導的miR-4306是否對下游VEGFA/ERK1/2/NF-κB信號通路中相關(guān)蛋白產(chǎn)生作用，本研究通過Western blot檢測分析顯示，與正常PMPs組(Ctrl組)比較，DM組(M組)中p-IκBα、NF-κBp65表達量顯著升高，而p-ERK及VEGFA則顯著降低，加入mimic-micro-4306后，無論是正常PMPs組還是DM中PMPs組p-IκBα、NFκBp65升高量更高，而加入inhibitor-micro-4306后p-IκBα、NF-κBp65降低明顯、p-ERK及VEGFA升高顯著，同時inhibitor-M組與inhibitor-NC組具有統(tǒng)計學差異，提示DM血漿中PMPs能夠通過miR-4306誘導p-IκBα、NF-κBp65升高，而降 低p-ERK及VEGFA的作用，進而引起內(nèi)皮細胞凋亡損傷，誘發(fā)動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，以上提示DM模型血漿PMPs可能一方面引起miR-4306高表達，進而促進p-IκBα、NF-κBp65水平升高，誘導炎癥反應、引起細胞凋亡，另一方面降低促進血管內(nèi)皮細胞生長因子表達量的降低，進而導致細胞生長受阻，引起細胞凋亡。

綜上，DM模型血漿中PMPs具有引起主動脈血管內(nèi)皮損傷的作用，其作用機制可能為PMPs作用于miR-4306，進而激活VEGFA/ERK1/2/NF-κB信號，從而誘導細胞凋亡、引起內(nèi)皮細胞生長因子表達下降。