骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為肝細胞的研究進展

李裕珍馮麗娟潘益巧阮博文周曉玲

(1.廣西中醫(yī)藥大學，南寧53000；2.廣西中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣西 柳州 545000)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)是屬于中胚層的一類多能干細胞，存在于骨髓中的基質(zhì)干細胞，為最早發(fā)現(xiàn)的多向分化潛能干細胞，具有自我增殖、多向分化、免疫調(diào)節(jié)、促進造血及修復損傷器官的作用[1－2]，且在不同誘導條件下可以向肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞、成骨細胞等分化[3－4]。由于BMSCs多向分化功能，且容易獲取、體外增殖快、傳代基因穩(wěn)定性良好、移植免疫排斥少等優(yōu)點使其成為近年誘導分化研究的熱點[5]。大量動物研究表明，通過細胞移植技術將BMSCs移植進入受損肝中，對損傷的肝具有一定的修復作用，其主要是通過不同的誘導條件使BMSCs定向分化為有功能的肝細胞[6－7]；臨床研究也發(fā)現(xiàn)，自體移植BMSCs可以改善肝病患者各項生化指標，減少晚期肝病患者不良反應，有效提高其生活質(zhì)量[8－9]。然而，對于BMSCs的常用分離培養(yǎng)和鑒定方法，以及其向肝細胞分化的誘導方法及分化機制尚缺乏系統(tǒng)整理及總結。因此本文主要對此進行綜述，為更好發(fā)揮BMSCs在肝損傷性疾病治療中的應用提供思路。

1 BMSCs的常用分離培養(yǎng)和鑒定方法

1.1 BMSCs的常用分離培養(yǎng)方法

目前常用的BMSCs分離培養(yǎng)方法有全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法、骨組織消化分離法、離心法、流式細胞儀分離法、免疫磁珠分選法等[10－12]，其中后兩者因操作復雜、分離成本高且分離后細胞轉化效果差等使其運用受限，目前大多數(shù)研究中使用的是操作更為方便且獲得細胞數(shù)量較多、增殖能力較強的全骨髓貼壁分離法和密度梯度離心法[13]，但因其分離純度欠佳，因此有學者在全骨髓貼壁分離法基礎上進行創(chuàng)新優(yōu)化，其中徐麗娟等[14]創(chuàng)新性地使用小鼠3 d乳鼠骨片法，將乳鼠骨片直接進行培養(yǎng)，當梭形細胞在骨片周圍密度大于50%時，按比例進行三次傳代，此法獲得了純度較高的BMSCs；向俊西等[15]則在接種一定時間后將接種不滿意的細胞進行重新接種，并按12、24 h更換一次培養(yǎng)液，經(jīng)優(yōu)化后的誘導方法更簡便、快捷地獲得了滿意的大鼠BMSCs；兩者改良后的培養(yǎng)方法最后均可得到純度較高的BMSCs，有效解決因細胞分離純度不佳影響實驗結果的問題，更有利于實驗的研究。

1.2 BMSCs常用鑒定方法

在BMSCs鑒定方面，文獻多報道BMSCs在形態(tài)上表現(xiàn)為纖維狀或長梭形[16－17]，未發(fā)現(xiàn)其特異性的表面標志物，但因其不表達造血干細胞表面標志物，故常用陰性和陽性選擇相結合的方法進行鑒定?，F(xiàn)認為成熟且合格的BMSCs多表達陽性或強陽性的CD29、CD90、CD73、CD105、CD49，不表達或弱表達CD11、CD31、CD34、CD44、CD45等[18－20]。

2 BMSCs誘導向肝細胞分化的常用方法

BMSCs具有多向分化性，但其向肝細胞分化需要嚴格的分化條件及多種細胞因子的參與，因此如何提高及保證BMSCs向肝細胞分化的有效率并將其應用于臨床治療是目前研究的重點和難點。研究發(fā)現(xiàn)通過相應的物質(zhì)誘導，如中藥含藥血清、細胞因子、模擬肝樣微環(huán)境或其他物理干預等誘導的方式，可促使BMSCs不同程度地向肝細胞分化。

2.1 中藥含藥血清誘導

目前中藥被廣泛應用于肝病的臨床治療中，特別是對于中晚期肝病，中藥有明顯改善患者臨床癥狀且毒副作用小、不良反應少等特點，為中藥方劑聯(lián)合BMSCs移植治療終末期肝病提供新思路，但由于中藥復方成分多樣且復雜，作用靶點廣泛，同時也限制了對其機制的研究。因此探索利用中藥含藥血清促使BMSCs向肝細胞分化也是現(xiàn)今熱點。

活血化瘀類中藥復方是治療氣滯血瘀型肝硬化的經(jīng)典方劑。研究表明鱉甲煎丸含藥血清對BMSCs向肝細胞轉化有促進作用，且有改善肝纖維化及調(diào)節(jié)免疫等作用，肯定了中藥對BMSCs誘導分化的作用，但具體的作用機制尚未明確[21]。韓海嘯等[22]研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)肝益氣通絡湯藥物血清不僅可以有效誘導BMSCs定向分化為肝細胞，且對BMSCs具有增殖作用，并隨著藥物濃度的增加及培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量就不斷增多。另外，基于“腎主骨生髓”理論，Zhou等[23]通過評估不同干預辦法移植BMSCs治療肝硬化大鼠的療效，選用BMSCs聯(lián)合中藥濟生腎氣湯(JSSQ組)進行干預，結果證實了中藥濟生腎氣湯聯(lián)合BMSCs移植對改善肝硬化大鼠的治療作用，其機制可能JSSQ具有滋補肝腎，促進骨髓再生的功能，其在體內(nèi)發(fā)揮了類似于細胞歸巢誘導劑的作用，促進了BMSCs的誘導分化及遷移，從而參與肝細胞的再生修復。瘀血阻絡、肝腎陰虛型均是終末期肝病患者的主要證型之一[24]，在誘導BMSCs向肝細胞分化過程中，多數(shù)學者[21－22]以活血化瘀、調(diào)肝通絡功效的方藥為主，誘導分化結果良好，而部分學者[23，25]以補腎生髓、滋陰養(yǎng)血法也明顯改善了大鼠肝纖維化程度，詳見表1。因此活血化瘀法中藥血清誘導是否適應于所有終末期肝病尚待進一步研究，針對不同證型的肝病所采用中藥含藥血清的可進行不斷地探索。

表1 常用中藥含藥血清分類及代表Table 1 Classification and representation of commonly used Chinese medicine sera containing drugs

2.2 細胞因子誘導

細胞因子是一類由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)刺激而合成、分泌的具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)，現(xiàn)多被應用于誘導BMSCs向肝細胞分化。潘興南等[26]研究發(fā)現(xiàn)肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)體外誘導BMSCs向肝細胞分化以質(zhì)量濃度≥20μg/L且誘導時間≥6 h/d為宜，誘導效果與HGF濃度及每日誘導時間呈正相關性。Putra等[27]發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的刺激下，BMSCs可向損傷肝組織遷移并可進一步轉化為原代肝細胞，且發(fā)現(xiàn)靜脈內(nèi)給藥途徑是BMSCs移植的最佳途徑。吳增城等[28]探討半乳糖凝集素-3(Gal-3)聯(lián)合HGF誘導大鼠BMSCs向肝細胞轉化的可行性及最佳誘導劑量，觀察記錄不同濃度及不同時間下BMSCs的細胞形態(tài)學改變，結果發(fā)現(xiàn)各組BMSCs形態(tài)逐漸向肝細胞分化，與陽性對照組細胞相似，其中濃度0.5μg/mL的組別在第28天時間段與對照組IAR20細胞最為相似，且甲胎蛋白、清蛋白熒光染色陽性率最高，mRNA表達較其它各組明顯增高。譚銘輝等[29]發(fā)現(xiàn)使用galectin-3誘導BMSCs分化為肝細胞會出現(xiàn)白蛋白(albumin，ALB)mRNA及角蛋白18(cytokeratin 18，CK－18)mRNA及AFP蛋白表達增加，與HGF聯(lián)合進行誘導時可提高BMSCs向肝細胞誘導分化的效率。

2.3 中藥含藥血清聯(lián)合細胞因子誘導

Fu等[30]采用中藥一貫煎含藥血清聯(lián)合HGF和基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)在體外誘導BMSCs向肝細胞分化，結果表明含中藥血清組(YGJ組)經(jīng)過一定的時間誘導后，BMSCs的形態(tài)逐漸向肝細胞樣轉化，其所含ALB和CK－18陽性細胞的比例均比其它組升高。由此說明一貫煎含藥血清聯(lián)合與HGF和SDF-1誘導小鼠BMSCs可以促進其定向分化為肝細胞，較單純的細胞因子誘導轉化率高。陳艷等[31]從中藥姜黃中提取姜黃素聯(lián)合成纖維細胞生長因子－4，F(xiàn)GF-4)誘導BMSCs定向分化發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)適當劑量的姜黃素可單獨有效誘導BMSCs分化為肝細胞，但聯(lián)合FGF-4的時候可降低姜黃素的濃度，且安全可靠，值得進一步研究其具體作用機制。

2.4 模擬肝微環(huán)境

微環(huán)境在BMSCs向肝細胞定向分化過程中有至關重要的作用，通過模擬肝臟微環(huán)境可誘導干細胞向肝細胞分化，但具體的機制尚待研究。彭琴等[32]發(fā)現(xiàn)肝衰竭組及中藥含藥組中的甲胎蛋白、肝組織蛋白、吲哚胺2，3—雙加氧酶表達均高于正常組，且中藥含藥組的蛋白表達量高于肝衰竭組，證明了中藥含藥血清能增強BMSCs在肝衰竭微環(huán)境下的肝細胞分化趨勢及免疫調(diào)節(jié)活性，提高肝細胞分化率。Razban等[33]選用硫酸乙酰肝素和IV型膠原模擬肝微環(huán)境對BMSCs進行誘導分化，結果表明CYP3A4酶活性，AFP，ALB和c-MET蛋白水平升高，證明力BMSCs具有分化為肝樣細胞、改善肝功能的功效。李偉等[34]認為膽汁淤積的病理狀態(tài)下，可以為BMSCs向肝細胞的分化提供良好的細胞微環(huán)境，因此探討?zhàn)瞿懷鍖Υ笫驜MSCs向肝細胞分化的影響，結果證明瘀膽血清可誘導BMSCs向肝細胞的定向分化，促進肝細胞的生長。

大量研究表明肝細胞和非肝實質(zhì)細胞在體外共培養(yǎng)可通過異質(zhì)細胞間的相互作用充分模擬肝細胞在體內(nèi)的生存環(huán)境，促進肝細胞增殖與分化，并保持肝細胞特有的生物學功能。因此，共培養(yǎng)是肝細胞大規(guī)模、高活性培養(yǎng)并最終推廣運用的理想培養(yǎng)方式。Zhang等[35]研究證明在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，BMSCs保持正常增殖和活力的同時，強烈表達ALB、AFP和cytokeratin-18的mRNA蛋白水平，對BMSCs分化為肝細胞起了決定性的作用。另外，與傳統(tǒng)的2 D培養(yǎng)基相比，3 D系統(tǒng)可高度模擬天然器官環(huán)境，既保持BMSCs的分化能力，也有利于維持肝細胞的高復制能力。Liu等[36]利用poly(lactic acid-glycolic acid)(PLGA)支架模擬3 D系統(tǒng)，將BMSCs和肝細胞進行共培養(yǎng)，結果證明了PLGA支架中BMSCs誘導分化為肝細胞的能力，而且表明1∶5(BMSCs:hepatocyte-like cells)的比例最適合BMSCs支持PLGA支架中的肝細胞代謝和穩(wěn)定。

2.5 其它誘導方法

此外，張瑋等[37]采用物理性的辦法研究在針刺對治療肝纖維化的體外作用機制，發(fā)現(xiàn)損傷及治療均等物理刺激療法可誘導BMSCs向肝細胞轉化，提高大鼠血清中細胞因子水平和改善肝纖維化程度，其機制可能與自身修復代償機制相關。孫婷[38]基于無創(chuàng)的超聲靶向微泡破壞技術探討誘導BMSCs靶向歸巢及分化為肝細胞的可行性，發(fā)現(xiàn)該技術可改善受損肝組織功能及抑制細胞凋亡，促進肝細胞的生長。Li等[39]研究發(fā)現(xiàn)超聲輻照結合HGF可加速人骨髓間充質(zhì)干細胞的肝分化。選擇物理性干預方法進行誘導BMSCs分化為肝細胞具有創(chuàng)傷小，副作用少的特點，對于實驗的研究可控及可操作性強。

隨著肝疾病進展至終末期肝病，門脈阻塞及門脈高壓情況越來越嚴重，進一步導致的血流動力學改變造成肝組織嚴重缺血缺氧，因此學者Rehn等[40]探討缺氧環(huán)境下BMSCs與肝細胞再生的關系，發(fā)現(xiàn)缺氧預處理可增強BMSCs和肝勻漿中的中VEGF的表達，提高細胞周期蛋白D1的表達并伴隨血清白蛋白水平的提高，證明了缺氧情況下BMSCs可促進肝細胞的生長及轉化，改善肝纖維化程度。許欣婷等[41]也證明了低氧環(huán)境下可促進BMSCs的增殖，利用細胞的轉化。

3 BMSCs的體內(nèi)誘導分化為肝細胞的途徑

BMSCs不僅能在體外誘導分化為肝細胞，在體內(nèi)也具有分化為肝樣細胞的途徑。Hwang等[42]將BMSCs植入肝硬化大鼠中，發(fā)現(xiàn)歸巢至肝組織中的BMSCs，可經(jīng)誘導分化為肝細胞樣細胞，改善肝硬化大鼠的纖維化程度。Jang等[43]也證實了證實了BMSCs在體內(nèi)被誘導分化為肝細胞，并發(fā)現(xiàn)TGFβ1信號通路的下游效應子P-Smad3/Smad3，且BMSCs移植抑制了Smad3的磷酸化。

4 BMSCs分化為肝細胞的相關機制

已有的研究表明，運用不同的誘導方法無論是在體內(nèi)還是體外均可誘導BMSCs成功定向分化為肝細胞，但具體的分子機制尚未明確[44－45]。目前大部分學者認為，BMSCs定向分化為肝細胞是基于部分基因被選擇性激活或出現(xiàn)差異性表達，從而使某些特異性蛋白合成及其空間分布。

4.1 Notch信號通路

Notch信號影響細胞正常形態(tài)發(fā)生的多個過程，包括細胞的分化、凋亡、增殖及細胞邊界的形成。柳柯等[46]發(fā)現(xiàn)BMSCs向肝細胞定向分化過程中其關鍵基因mRNA表達也會下降，在第11天的時候以Jagged-2、Delta-1、Delta-3、Notch-1、Notch-2、Notch-3和Presenilin-1的mRNA下降最為明顯；利用Jagged與BMSCs共同培養(yǎng)上調(diào)Notch信號通路其發(fā)現(xiàn)至21 d BMSCs才表達其表面標志物M2-PK和GST-P，明顯晚于對照組，且分化至26 d時仍未見白蛋白表達，證明了下調(diào)Notch信號通路有助于BMSCs定向分化為肝細胞。徐洪雨等[47]在研究者發(fā)現(xiàn)隨著細胞生長因子誘導BMSCs分化為肝細胞的分化率的增高，Notch-1蛋白表達及Notch-1 mRNA呈逐漸下降趨勢。

4.2 NF-κB信號通路

NF-κB信號通路是控制許多細胞類型中細胞增殖，分化和凋亡的主要因素。Yang等[48]研究表明當阻斷了NF-κB信號后HGF誘導BMSCs分化為肝細胞效果下降，表明了HGF通過NF-κB信號傳導誘導BMSC向肝樣細胞的分化，其中機制可能與NF-κB信號的激活對于肝細胞的增殖和微管形成相關。王怡等[49]探討NF-κB在HGF和肝組織液(LTF)誘導BMSCs分化為肝細胞的影響中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)兩種細胞因子誘導下，細胞內(nèi)NF-κB蛋白及AAT蛋白表達量顯著增加，但予NF-κκB抑制劑干預后，兩者蛋白表達量隨時間延長而明顯下降。表明了NFκB信號通路對定向分化誘導的積極作用。

4.3 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt/β-catenin信號通路是Wnt途徑中的經(jīng)典信號通路之一，在BMSCs分化為肝細胞中發(fā)揮重要的作用。Xiang等[50]在研究中發(fā)現(xiàn)使用中藥一貫煎可促進BMSCs向肝細胞分化，在機制方面，當下調(diào)Wnt信號通路的同時會抑制干細胞的增殖轉而分化為有功能的肝細胞。吉楊丹等[51]發(fā)現(xiàn)miR-26b可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs向肝樣細胞分化；曾令鋒等[52]發(fā)現(xiàn)17β-E2作用于BMSCs時，除影響其生長激素的分泌量，還降低在氧化應激時的凋亡率，最后證明17β-E2對BMSCs分化為肝樣細胞的促進作用，其機制可能與17β-E2下調(diào)Wntβ-catenin信號蛋白Wnt3a和β-Catenin有關。

4.4 鈣離子對誘導分化的影響

鈣離子是機體各項生理活動不可缺少的離子，在細胞的發(fā)生、生長及凋亡過程有著重要作用。焦淑賢等[53]發(fā)現(xiàn)鈣離子參與了BMSCs分化為肝細胞的過程，當加入鈣拮抗劑后BMSCs分化率明顯降低，但是具體的作用機制及過程仍待進一步研究。

5 總結

運用BMSCs移植誘導分化為肝細胞技術治療終末期肝病在動物實驗方面取得了廣泛的認可，通過中藥含藥血清、細胞生長因子和物理刺激等誘導方法均使BMSCs定向誘導分化肝細胞，都不同程度地改善了大鼠肝纖維化情況，為在臨床上運用BMSCs移植治療終末期肝病提供了重要的借鑒意義，也為重癥肝病患者帶來希望的曙光。但是即使BMSCs移植技術在動物實驗方面取得了一定的療效，而真正將該技術運用于臨床仍是困難重重。首先從取材上來講，20歲以后，人體BMSCs的分化能力明顯下降，并且隨著年齡的增長BMSCs的增殖能力也會逐漸下降，極有可能限制由BMSCs所分化得到的肝細胞的臨床應用；其次對于BMSCs鑒定仍未能確定其特異性的表面標志物，最后BMSCs分化為肝細胞的調(diào)控機制尚未明確，對移植后會出現(xiàn)的不良反應及是否會進一步加重肝纖維化或加速疾病的進展尚待研究等。但BMSCs是具有巨大分化潛能及廣闊臨床應用前景的多功能干細胞之一，積極探索最佳的、能夠定向誘導BMSCs向肝細胞分化的誘導方法或誘導劑、移植途徑等，促進BMSCs的增值分化，發(fā)揮BMSCs對肝疾病的積極作用，提高BMSCs移植的臨床運用率仍然是現(xiàn)今肝病領域研究的重點內(nèi)容。