冬凌草甲素通過調(diào)控UBC9表達(dá)對肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的影響

梁會娟任志芳劉 偉張彥忠

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)辦公室，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.濮陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 濮陽 457000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一種常見的慢性肝損傷的傷口愈合反應(yīng)，是慢性肝病最終發(fā)展為肝硬化或肝細(xì)胞癌的重要病理過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)是肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞，正常肝中HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝受到異常刺激時(shí)，HSC活化、增殖并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，導(dǎo)致肝ECM合成和降解失衡，促進(jìn)HF形成[1]。因此，如何有效的抑制HSC增殖，誘導(dǎo)其凋亡是防治HF的重要措施。冬凌草甲素是從冬凌草中分離得到的二萜類化合物，具有抗炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)功能[2－3]。有文獻(xiàn)報(bào)道冬凌草甲素可誘導(dǎo)HSC凋亡和周期阻滯，抑制內(nèi)源性和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)誘導(dǎo)的ECM合成，是一種潛在的預(yù)防HF藥物[4]。然而，冬凌草甲素抗HF的潛在分子機(jī)制并未完全闡明。泛素結(jié)合酶9(ubiquitin Conjugating Enzyme 9，UBC9)是小泛素樣分子相關(guān)修飾物(small ubiquitin-like molecular related modifiers，SUMO)泛素化過程的唯一接合酶，研究顯示UBC9參與HSC凋亡過程，下調(diào)UBC9可抑制HF進(jìn)程[5]。但冬凌草甲素能否調(diào)控UBC9影響HF進(jìn)程尚未可知。本研究以UBC9為切入點(diǎn)，探討冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖、凋亡的影響和分子機(jī)制，以期為冬凌草甲素用于臨床防治HF提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6購于美國模式生物保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

杜爾伯格伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清購于美國Gibco公司；冬凌草甲素(批號111721-201704，純度≥99.7%)購于中國食品藥品檢定研究院；UBC9小干擾RNA(UBC9 small interfering RNA，si-UBC9)及其陰性對照(small interfering RNA nagative control，si-NC)、UBC9過表達(dá)載體(UBC9 overexpression vector， pcDNA-UBC9)、空載體(Empty vector plasmid，pcDNA)由上海吉瑪制藥公司提供；凋亡試劑盒、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購于上海碧云天公司；山羊抗兔二抗、兔源UBC9抗體、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、p21、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl相關(guān)X蛋白(Bcl associated x protein，Bax)抗體購于上海賽信通生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于大連TaKaRa生化科技公司；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

復(fù)蘇HSC-T6細(xì)胞后，用含1%青鏈霉素雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度為70%~80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞密度到80%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分別采用冬凌草甲素濃度為10、20、40μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞48 h，依次記為冬凌草甲素-低組、冬凌草甲素-中組、冬凌草甲素-高組[6]。同時(shí)設(shè)置對照組即正常培養(yǎng)的HSCT6細(xì)胞。按照下述方法檢測HSC-T6細(xì)胞增殖、凋亡、增殖凋亡相關(guān)蛋白、UBC9的表達(dá)水平。

為證實(shí)冬凌草甲素對肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的影響與調(diào)控UBC9表達(dá)有關(guān)，將HSC-T6細(xì)胞分為si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-UBC9組(轉(zhuǎn)染si-UBC9)、冬凌草甲素＋pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA后用含40 μmol/L冬凌草甲素的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育48 h)、冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9組(轉(zhuǎn)染pcDNA-UBC9后用含40μmol/L冬凌草甲素的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育48 h)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。

1.3.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

取5×103個(gè)對數(shù)期HSC-T6細(xì)胞接種96孔板，當(dāng)細(xì)胞貼壁后，按照上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行干預(yù)處理后，加入20μL MTT試劑，反應(yīng)4 h，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，再加入150μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，當(dāng)結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的吸光度(absorbance，A)值。細(xì)胞增殖抑制率＝[(A對照孔－A實(shí)驗(yàn)孔)/(A對照孔－A空白孔)]×100%

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

用適量結(jié)合緩沖液重懸各組HSC-76細(xì)胞，向500μL細(xì)胞懸液中添加5μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI溶液，混合均勻后，室溫避光條件下反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 蛋白質(zhì)印記(Western blot)檢測蛋白表達(dá)水平

使用RIPA裂解液對各組HSC-T6細(xì)胞進(jìn)行裂解。制備十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠。將蛋白樣品與適量上樣緩沖液混勻，沸水浴加熱3 min變性蛋白。取30μg蛋白樣品上樣后100 V電泳90 min分離蛋白樣品，濕法轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜后，置于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜。置于稀釋的一抗溶液中室溫反應(yīng)2 h；置于二抗稀釋液中孵育1 h。顯影后用凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白(內(nèi)參為GAPDH)的相對表達(dá)水平。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測UBC9 mRNA表達(dá)水平

TRIzol試劑提取各組HSC-76細(xì)胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)合成的cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。2－ΔΔCt法分析UBC9 mRNA相對表達(dá)水平。引物序列(5’-3’):UBC9上游GGAAGTCCCGAGACAAAGGG，下游CAGCCACGAA ACCAAATGGG，GAPDH上游TGGACCAAGTACAT GAACCACC，下游CTGGTGATTGGACACGGTGA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。兩組間統(tǒng)計(jì)分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響

與對照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細(xì)胞CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素對HSC-T6細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響具有劑量依賴性。見表1和圖1。

表1 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表1 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 1 Effect of Oridonin on the proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1 CyclinD1 p對照組Control group 0.00±0.03 0.64±0.冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 11.25±1.17* 0.52±0.冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 28.36±2.74*＃ 0.39±0.冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 49.68±4.33*＃＆ 0.24±0.203.542 41.244 F蛋白rotein p21蛋白p21 protein 06 0.20±0.02 05* 0.33±0.03*04*＃ 0.46±0.04*＃03*＃＆0.59±0.05*＃＆ 62.593 P 0.000 0.000 0.000?

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 1 Expression of proliferation-related proteins

2.2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響

與對照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)、凋亡率顯著升高(P<0.05)，且冬凌草甲素對HSC－T6細(xì)胞凋亡和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響具有劑量依賴性。見表2和圖2。

圖2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響Figure 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表2 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 2 Effect of Oridonin on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups凋亡率(%)Apoptosis rate Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein對照組Control group 7.32±0.71 0.77±0.07 0.29±0.03冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 11.65±1.23* 0.64±0.06* 0.44±0.04*冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 17.32±1.65*＃ 0.52±0.04*＃ 0.56±0.05*＃冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 22.14±2.19*＃＆ 0.36±0.03*＃＆ 0.68±0.06*＃＆52.834 33.264 38.826 P 0.000 0.000 0.000 F

2.3 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6中UBC9表達(dá)的影響

與對照組比較，冬凌草甲素-低、-中、-高劑量組HSC-T6細(xì)胞UBC9 mRNA和UBC9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，冬凌草甲素對UBC9 mRNA和UBC9蛋白表達(dá)的影響具有依賴性。見表3和圖3。

圖3 UBC9蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of UBC9 protein

表3 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6中UBC9表達(dá)的影響(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

表3 冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6中UBC9表達(dá)的影響(±s，n＝3)Table 3 Effects of Oridonin on UBC9 expression in rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素-低組組相比，＃P<0.05；與冬凌草甲素-中組組相比，＆P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin-low group，＃P<0.05.Compared with the Oridonin-medium group，＆P<0.05.

分組Groups UBC9 mRNA UBC9蛋白UBC9 protein對照組Control group 1.00±0.05 0.84±0.08冬凌草甲素-低組Oridonin-low group 0.75±0.07* 0.71±0.06*冬凌草甲素-中組Oridonin-medium group 0.63±0.06*＃ 0.56±0.04*＃冬凌草甲素-高組Oridonin-high group 0.49±0.04*＃＆ 0.41±0.03*＃＆F 44.532 33.216 P 0.000 0.000

2.4 干擾UBC9表達(dá)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響

與si-NC組比較，si-UBC9組HSC-T6細(xì)胞UBC9蛋白表達(dá)顯著降低，表明HSC-T6細(xì)胞中UBC9表達(dá)受到抑制。抑制UBC9表達(dá)后，HSC-T6細(xì)胞CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，增殖抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表4和圖4。

表4 干擾UBC9表達(dá)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表4 干擾UBC9表達(dá)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響(±s，n＝3)Table 4 Effects of inference with UBC9 expression on proliferation of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與si-NC組相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

分組Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein陰性對照si-NC 0.83±0.07 6.33±0.61 0.62±0.06 0.22±0.02干擾UBC9表達(dá)組si-UBC9 0.39±0.04* 41.58±4.22* 0.28±0.03* 0.55±0.05*t 9.453 14.319 8.779 10.614 P 0.001 0.000 0.001 0.000

圖4 UBC9和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 4 Expression of UBC9 protein

2.5 干擾UBC9表達(dá)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響

抑制UBC9表達(dá)后，HSC-T6細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低，凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表5和圖5。

表5 干擾UBC9表達(dá)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表5 干擾UBC9表達(dá)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響(±s，n＝3)Table 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與si-NC組相比，*P<0.05。Note.Compared with si-NC group，*P<0.05.

圖5 干擾UBC9表達(dá)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6凋亡的影響Figure 5 Effects of interference with UBC9 expression on the apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

2.6 過表達(dá)UBC9逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素(40μmol/L)對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用

與對照組比較，冬凌草甲素組HSC-T6細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表達(dá)顯著降低，p21和Bax蛋白表達(dá)、增殖抑制率、凋亡率顯著升高；與冬凌草甲素＋pcDNA組比較，冬凌草甲素＋pcDNAUBC9組HSC-T6細(xì)胞CyclinD1、Bcl-2和UBC9蛋白表達(dá)顯著升高，p21和Bax蛋白表達(dá)、增殖抑制率、凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表6和圖6。

表6 UBC9過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

表6 UBC9過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用(±s，n＝3)Table 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

注:與對照組相比，*P<0.05；與冬凌草甲素＋pcDNA組相比，＃P<0.05。Note.Compared with the control group，*P<0.05.Compared with the Oridonin＋pcDNA group，＃P<0.05.

分組Groups UBC9蛋白UBC9 protein抑制率(%)Inhibition ratio凋亡率(%)Apoptosis rate CyclinD1蛋白CyclinD1 protein p21蛋白p21 protein Bcl-2蛋白Bcl-2 protein Bax蛋白Bax protein對照組Control group 0.82±0.07 0.00±0.02 6.32±0.63 0.63±0.06 0.21±0.02 0.78±0.07 0.27±0.03冬凌草甲素Oridonin 0.41±0.04* 47.21±4.33* 21.62±2.13* 0.23±0.03* 0.57±0.05* 0.35±0.03* 0.67±0.06*冬凌草甲素＋pcDNA Oridonin＋pcDNA 0.38±0.03 48.65±4.72 23.58±2.36 0.22±0.02 0.58±0.06 0.34±0.03 0.69±0.07冬凌草甲素＋pcDNA-UBC9 Oridonin＋pcDNA-UBC9 0.71±0.07＃ 20.11±2.03＃ 11.28±1.14＃ 0.52±0.05＃ 0.33±0.03＃ 0.67±0.06＃ 0.39±0.04＃F 46.634 145.099 69.359 69.514 54.203 58.447 47.236 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖6 UBC9過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了冬凌草甲素對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖和凋亡的作用Figure 6 UBC9 overexpression reversed the effect of Rubescensine A on the proliferation and apoptosis of rat hepatic stellate cells HSC-T6

3 討論

冬凌草甲素是東亞地區(qū)常用中草藥冬凌草的天然活性成分，近年來因其廣泛的生物活性和治療多種疾病的潛力而受到越來越多的關(guān)注。研究顯示，冬凌草甲素通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路抑制細(xì)胞增殖、觸發(fā)自噬、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展等機(jī)制對肝癌[7]、膽管癌[8]、神經(jīng)母細(xì)胞瘤[9]等多種類型惡性腫瘤表現(xiàn)出抗腫瘤作用，是潛在的癌癥候選治療藥物。冬凌草甲素還可抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織中平滑肌肌動蛋白和I型膠原蛋白表達(dá)，減輕肺泡空間塌陷、肺氣腫和炎癥細(xì)胞浸潤，防治肺纖維化病變[10]。此外，冬凌草甲素還可通過促進(jìn)P21相關(guān)的自噬來預(yù)防心肌肥大[11]。本研究探討冬凌草甲素的抗HF作用發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素可顯著抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并呈顯著的量效依賴關(guān)系，與Bohanon等[4]研究結(jié)果相吻合。CyclinD1和P21細(xì)胞增殖過程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，P21通過抑制周期素依賴激酶(cyclin dependent kinases，CDKs)/CyclinD1復(fù)合物活性，抑制G1-S期相變發(fā)揮抗增殖作用[12]。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控中重要的蛋白，Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低可促進(jìn)線粒體膜通透性改變，抑制孔道開放以及抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放，抑制Caspases活化進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生[13]。本研究顯示，冬凌草甲素呈劑量依賴性抑制CyclinD1、Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)P21、Bax表達(dá)，這提示冬凌草甲素可能通過調(diào)控CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白抑制HSC-T6增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

UBC9是UBC家族的重要成員，其通過促使活化的SUMO與目標(biāo)蛋白接合，進(jìn)而介導(dǎo)SUMO發(fā)揮蛋白調(diào)節(jié)作用，是纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。研究顯示，在腎臟纖維化過程中UBC9表達(dá)上調(diào)[15]。沉默UBC9通過抑制早幼粒細(xì)胞白血病蛋白類泛素化可降低主動脈縮窄小鼠心肌纖維化的發(fā)展，并部分改善其心功能[16]。在活化的人HSC細(xì)胞LX-2中UBC9表達(dá)顯著上調(diào)，沉默UBC9可明顯抑制HSC增殖，降低平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原的表達(dá)水平，進(jìn)而阻止HF[17]。此外，多種肝癌細(xì)胞中UBC9亦呈高表達(dá)，干擾UBC9表達(dá)可明顯降低肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，提高其凋亡水平[18－19]。為探討UBC9在冬凌草甲素抗HF中的作用，本研究檢測冬凌草甲素干預(yù)后HSC-T6細(xì)胞中UBC9表達(dá)水平，結(jié)果顯示冬凌草甲素呈劑量依賴性抑制UBC9表達(dá)水平，提示UBC9表達(dá)下調(diào)可能與冬凌草甲素的抗HF作用有關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，轉(zhuǎn)染si-UBC9干擾UBC9表達(dá)對HSC-T6細(xì)胞亦具有顯著的增殖抑制和凋亡作用。此外，本研究顯示過表達(dá)還能夠逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對HSC-T6細(xì)胞的增殖、凋亡以及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，提示冬凌草甲素對HSC-T6細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用抑制UBC9表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，冬凌草甲素可抑制HSC-T6細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而具有預(yù)防HF的潛在價(jià)值，其機(jī)制與抑制UBC9表達(dá)有關(guān)，這為開發(fā)冬凌草甲素用于臨床防治HF奠定了理論基礎(chǔ)。