VEGF抑制劑對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)CRA血流動(dòng)力學(xué)的影響

侯立亭郭 洋胡紅霞

(開(kāi)封市中心醫(yī)院眼科，河南 開(kāi)封 475000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種糖尿病微血管并發(fā)癥，是一種特異性眼底病變，其主要的病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜微血管變化[1]。DR患者的發(fā)病率主要與糖尿病病程相關(guān)，患者常出現(xiàn)的臨床癥狀主要有硬性滲出、IRMA、出血斑點(diǎn)、微動(dòng)脈瘤等，缺血廣泛可降低患者視力，致視網(wǎng)膜脫離，嚴(yán)重情況下可致盲[2]。DR的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，較為復(fù)雜，目前相關(guān)研究主要表明其與高血糖引起的代謝紊亂有關(guān)，包括蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的形成和己糖胺途徑的激活。蛋白激酶C激活，造成血管功能紊亂及氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管閉塞、局部缺血及血管滲透性增強(qiáng)[3－4]。VEGF抑制劑可阻止脈絡(luò)膜新生血管形成，解除視網(wǎng)膜水腫，防治血管成分滲漏，改善視力，貝伐單抗屬于一種典型的VEGF抑制劑，在治療多種晚期腫瘤中效果明顯，目前已經(jīng)有研究顯示通過(guò)玻璃體注射貝伐單抗，能治療眼部新生血管性疾病，但是患者會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥，其作用機(jī)制也尚不明確[5]。本文將研究VEGF抑制劑對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠的干預(yù)效果及對(duì)CRA血流動(dòng)力學(xué)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取40只SPF級(jí)、健康雄性大鼠，4~6周齡，平均年齡(4.8±0.9)周，體重為170~190 g，平均體重(171.0±9.5)g，由廣東斯嘉景達(dá)生物科技有限公司提供[SCXK(粵)2020-0052]，經(jīng)開(kāi)封市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批批準(zhǔn)(IACUC-201805-K1)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，所有大鼠在我院動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(粵)2021-0251]適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲水，12 h晝夜節(jié)律，溫度為20~25℃，濕度為40%~50%。

1.2 主要試劑與儀器

貝伐單抗(上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào):B873505-1)；無(wú)菌檸檬酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):2003-10)；LBY-HJ四通道血小板聚集儀(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司，貨號(hào):79028)；Laser Doppler Flowmetry激光血流儀(瑞典perimed，型號(hào):P457)；血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生)；雙抗體夾人酶聯(lián)免疫法試劑盒(上海西唐生物公司，貨號(hào):F26260)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 糖尿病性視網(wǎng)膜病變大鼠模型建立

對(duì)照組大鼠10只給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組、無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組各10只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。在8周后，對(duì)照組給予生理鹽水，模型組、無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組大鼠給予腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素。3 d后尿糖3＋，采集大鼠尾靜脈血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L，糖尿病大鼠造模成功。各組大鼠飲食情況如前，繼續(xù)喂養(yǎng)4周后，行眼底血管熒光造影檢查，確立大鼠出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變，建模成功。

1.3.2 干預(yù)

無(wú)菌檸檬酸組給予0.05 mL的無(wú)菌檸檬酸腹腔干預(yù)；VEGF抑制劑組大鼠給予玻璃體腔內(nèi)注入0.05 mL貝伐單抗干預(yù)；對(duì)照組、模型組給予等體積的生理鹽水干預(yù)，四組均連續(xù)給藥每天1次，各組均連續(xù)干預(yù)2周。

1.3.3 CRA血流參數(shù)檢測(cè)

應(yīng)用飛利浦IU22型彩色多普勒檢查，探頭頻率:10 MHz。腹腔注射麻醉，在獲取連續(xù)5個(gè)以上穩(wěn)定心動(dòng)周期時(shí)，檢測(cè)干預(yù)2周后大鼠右眼CRA各項(xiàng)血流參數(shù)。根據(jù)多普勒超聲血流指標(biāo)測(cè)定峰值血流速度:EDV、PSV、RI及PI。重復(fù)上述操作3次，取各項(xiàng)指標(biāo)的平均值。

1.3.4 血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

采用激光血流儀檢測(cè)大鼠干預(yù)2周后全血粘度。大鼠心腔采血2.5 mL，血小板聚集率檢測(cè)用四通道血小板聚集儀。大鼠心腔采血1.5 mL，血小板黏附率檢測(cè)用體外血栓形成、血小板黏附兩用儀。

1.3.5 脂聯(lián)素、空腹血糖(FBG)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白介素-1β(IL-1β)水平檢測(cè)

血糖測(cè)試前對(duì)動(dòng)物禁食12 h，使用血糖儀檢測(cè)FBG水平。抽取大鼠尾部靜脈血2 mL，采用PBS緩沖液進(jìn)行洗滌處理，轉(zhuǎn)速為2000 r/min離心干預(yù)10 min，摒棄上清液，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法試劑盒檢測(cè)各組大鼠血漿中脂聯(lián)素、ICAM-1、IL-1β水平。

1.3.6 病理學(xué)觀察

采用LDF激光血流儀及眼球固定象限測(cè)定法檢測(cè)干預(yù)2周后各組大鼠雙眼血流。檢查完成后將大鼠處死，摘取每只大鼠左側(cè)眼球，10%甲醛固定24 h，經(jīng)脫鈣、脫水、透明以及包埋等處理制成石蠟塊，保存待用。將組織進(jìn)行切片，HE染色，光鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.3.7 Western blot檢測(cè)Ras、Raf-1及ERK表達(dá)量檢測(cè)

將所采集到的大鼠左側(cè)眼球組織標(biāo)本，進(jìn)行研磨，然后加入蛋白緩沖液，常規(guī)蛋白提取，BCA法定量分析。50μg蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)到PVDF膜，在TBST中將5%的脫脂奶粉避光封閉1 h，洗滌后加入一抗稀釋溶液(Ras、Raf-1及ERK按照1∶1000比例進(jìn)行稀釋)，在4℃的環(huán)境中保存過(guò)夜，洗滌后加入二抗稀釋溶液(Ras、Raf-1及ERK按照1∶5000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，使軟件分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參蛋白是GAPDH。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述，多組間比較采用齊性方差檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CRA血流參數(shù)比較

如表1所示，與正常大鼠相比，模型組、無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組EDV、PSV水平降低，RI及PI水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組EDV、PSV水平升高，RI及PI水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無(wú)菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組EDV、PSV水平升高，RI及PI水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 各組大鼠CRA血流參數(shù)比較(±s，n＝10)Table 1 Comparison of CRA blood flow parameters of rats in each group

表1 各組大鼠CRA血流參數(shù)比較(±s，n＝10)Table 1 Comparison of CRA blood flow parameters of rats in each group

注:與對(duì)照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無(wú)菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups 舒張期最低流速(mm/s)EDV 收縮期峰值血流速度(mm/s)PSV 阻力指數(shù)RI 搏動(dòng)指數(shù)PI對(duì)照組Control group 108.12±20.25 178.83±25.14 0.41±0.11 0.50±0.13模型組Model group 31.53±8.42a 58.92±11.37a 1.12±0.32a 1.35±0.35a無(wú)菌檸檬酸組Sterile citric acid group 47.46±10.29ab 84.16±14.52ab 0.85±0.20ab 0.91±0.22ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 90.26±16.55abc 155.57±18.67abc 0.68±0.10abc 0.69±0.12abc F 16.566 20.614 9.953 10.799 P 0.001 0.001 0.001 0.001

2.2 病理學(xué)觀察

如圖1所示，對(duì)照組大鼠細(xì)胞內(nèi)外節(jié)形態(tài)規(guī)整，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)血管擴(kuò)張，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，細(xì)胞間水腫。無(wú)菌檸檬酸組大鼠周細(xì)胞輕度水腫，各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂。VEGF抑制劑組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列較完整。

圖1 大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察(HE染色)Figure 1 Histopathological observation of retina in rats(HE staining)

2.3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較

如表2所示，與正常大鼠相比，模型組、無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無(wú)菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較(±s，n＝10)Table 2 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group

表2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較(±s，n＝10)Table 2 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group

注:與對(duì)照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無(wú)菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups全血粘度(mPa/s)Whole blood viscosity血小板聚集(%)Platelet aggregation rate血小板黏附(%)Platelet adhesion rate對(duì)照組Control group 1.13±40.22 58.65±13.92 26.31±5.20模型組Model group 1.96±0.63a 85.24±19.76a 48.73±12.82a無(wú)菌檸檬酸組terile citric acid group 1.75±0.45ab 76.31±17.53ab 39.18±10.35a VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.40±0.35abc 62.18±15.10abc 33.30±8.22ab 3.109 4.902 4.178 P 0.001 0.001 0.001 F Sbc

2.4 各組大鼠脂聯(lián)素、空腹血糖水平比較

如表3所示，與正常大鼠相比，模型組、無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平降低，F(xiàn)BG水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平升高，F(xiàn)BG水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無(wú)菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平升高，F(xiàn)BG水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 各組大鼠脂聯(lián)素、FBG水平比較(±s，n＝10)Table 3 Comparison of adiponectin and FBG levels of rats in each group

表3 各組大鼠脂聯(lián)素、FBG水平比較(±s，n＝10)Table 3 Comparison of adiponectin and FBG levels of rats in each group

注:與對(duì)照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無(wú)菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups脂聯(lián)素(mg/L)Adiponectin空腹血糖(mmol/L)FBG對(duì)照組Control group 2.29±0.71 5.35±1.18模型組Model group 0.31±0.10a 17.48±3.08a無(wú)菌檸檬酸組Sterile citric acid group 0.58±0.25ab 12.51±2.61ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.65±0.55abc 8.91±1.70abc 11.726 17.445 P 0.001 0.001 F

2.5 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較

如表4所示，與正常大鼠相比，模型組、無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無(wú)菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

表4 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較(±s，n＝10)Table 4 Comparison of VEGF，ICAM-1 and IL-1β levels of rats in each group

表4 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較(±s，n＝10)Table 4 Comparison of VEGF，ICAM-1 and IL-1β levels of rats in each group

注:與對(duì)照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無(wú)菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(pg/mL)VEGF細(xì)胞間黏附分子-1(ng/L)ICAM-1白介素-1β(pg/mL)IL-1β對(duì)照組Control group 40.76±9.53 58.08±8.22 6.38±1.15模型組Model group 91.19±19.48a 89.65±19.71a 18.15±4.26a無(wú)菌檸檬酸組Sterile citric acid group 75.81±16.32ab 78.84±18.39ab 12.02±3.01ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 53.15±13.70abc 67.39±11.55abc 8.10±2.12abc 9.509 4.008 6.914 P 0.001 0.001 0.001 F

2.6 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達(dá)量比較

如表5、圖2所示，與正常大鼠相比，模型組、無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達(dá)量升高，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，無(wú)菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達(dá)量降低，具有顯著性差異(P<0.05)；與無(wú)菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達(dá)量降低，具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2 Ras、Raf-1及ERK蛋白表達(dá)Western blot圖Figure 2 Western blot of Ras，Raf-1 and ERK protein expression

表5 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達(dá)量比較(±s，n＝10)Table 5 Comparison of the expression levels of Ras，Raf-1 and ERK in each group of rats

表5 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達(dá)量比較(±s，n＝10)Table 5 Comparison of the expression levels of Ras，Raf-1 and ERK in each group of rats

注:與對(duì)照組相比，a P<0.05；與模型組相比，b P<0.05；與無(wú)菌檸檬酸組相比，c P<0.05。Note.Compared with the control group，a P<0.05.Compared with the model group，b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group，c P<0.05.

組別Groups Ras Raf-1 ERK對(duì)照組Control group 1.34±0.41 1.45±0.23 0.73±0.14模型組Model group 5.82±1.64a 3.91±0.92a 2.42±0.78無(wú)菌檸檬酸組Sterile citric acid group 3.67±1.13ab 2.53±0.75ab 1.59±0.40 VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.98±0.62abc 1.90±0.51abc 1.05±0.21 12.010 5.885 9.242 P 0.001 0.001 0.001 Faababc

3 討論

在我國(guó)DR的發(fā)病率逐年上升，其主要是由多種因素共同作用導(dǎo)致的，是目前國(guó)內(nèi)外導(dǎo)致低視力及致盲的重要疾病，不及時(shí)的有效治療會(huì)隨著病情發(fā)展導(dǎo)致失明，尋找有效的治療方法尤為重要[6]。隨著病程的不斷進(jìn)展，DR促使其局部缺血缺氧，促使毛細(xì)血管通透性增加，促使新生血管生成等，新生血管會(huì)導(dǎo)致結(jié)締組織增生及玻璃體出血等，進(jìn)一步增加視力喪失及視網(wǎng)膜脫離風(fēng)險(xiǎn)[7]。較多學(xué)者為臨床治療提高新的靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)血管生成抑制因子與血管生成刺激因子之間的動(dòng)態(tài)平衡在其發(fā)展與發(fā)生過(guò)程中具有重要作用[8]。VEGF其生物活性可以被抑制劑阻斷，是最重要的眼內(nèi)新生血管生長(zhǎng)因子，達(dá)到抑制新生血管生成的目的[9－10]。

視網(wǎng)膜CRA是供應(yīng)視網(wǎng)膜內(nèi)參的主要血管，屬于終末動(dòng)脈，是眼動(dòng)脈的分支，在維持視覺(jué)功能方面起重要的作用。視網(wǎng)膜動(dòng)脈參數(shù)可用來(lái)反映視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)狀況，與視網(wǎng)膜微循環(huán)的狀態(tài)[11]。本文研究顯示，VEGF抑制劑能提高大鼠EDV、PSV水平升高，降低RI及PI水平，從而改善視網(wǎng)膜CRA血流動(dòng)力學(xué)狀況。機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間處于高血糖狀態(tài)易造成血-視網(wǎng)膜屏障受損，血小板聚集性增強(qiáng)，同時(shí)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管閉塞，視網(wǎng)膜血管彈性下降，促進(jìn)新生血管形成，引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管增生與微血管瘤[12－13]。本文結(jié)果指出，VEGF抑制劑能降低大鼠全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞特異性分泌的一種蛋白質(zhì)，在糖尿病合并癥的發(fā)展中具有重要的作用，其水平增高可引起微循環(huán)障礙[14]。本文中，與無(wú)菌檸檬酸組相比，VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平升高，F(xiàn)BG水平降低。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的促有絲分裂素，過(guò)度表達(dá)會(huì)增加血管的滲透性，促進(jìn)血管的異常增殖，其與組織中新生血管數(shù)量具有密切聯(lián)系，能特異性的作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞[15]。炎性細(xì)胞黏附與血管內(nèi)皮細(xì)胞是由ICAM-1介導(dǎo)的，損害局部血管，導(dǎo)致活化氧自由基、炎癥遞質(zhì)等，引起血管通透性增加，加重視網(wǎng)膜的損傷[16－17]。IL-1β在DR中加重視網(wǎng)膜病變，誘導(dǎo)ICAM-1等黏附因子，起關(guān)鍵作用的一種致炎因子[18]。本文指出，VEGF抑制劑通過(guò)能降低糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平，在抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠炎癥方面作用顯著。Ras/Raf-1/ERK通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡與分化的重要途徑，是一個(gè)蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在VEGF介導(dǎo)的血管生成信號(hào)通路上起促進(jìn)VEGF表達(dá)的作用[19]。VEGF抑制劑相對(duì)分子量小，能夠穿透視網(wǎng)膜，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合，加快緩解水腫，防治視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生滲漏，阻止血管新生、再生，減輕炎癥反應(yīng)，改善視網(wǎng)膜功能[20]。本文研究結(jié)果顯示，VEGF抑制劑對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠Ras、Raf-1及ERK蛋白表達(dá)有一定的調(diào)控作用，為其作用機(jī)制提供研究方向。本文研究的局限性主要體現(xiàn)在，本文研究實(shí)驗(yàn)僅做了一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜病變的觀察，在抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)展這一結(jié)論研究方面，數(shù)據(jù)不充分，仍需要后續(xù)多試驗(yàn)點(diǎn)加以證實(shí)。

綜上所述，VEGF抑制劑可改善糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠CRA血流動(dòng)力學(xué)與血液流變學(xué)指標(biāo)，降低VEGF、ICAM-1及IL-1β水平，抑制血管新生。