• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    VEGF抑制劑對糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠的干預(yù)效果及對CRA血流動力學(xué)的影響

    2021-10-20 02:48:20侯立亭郭洋胡紅霞
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2021年9期
    關(guān)鍵詞:水平模型

    侯立亭郭 洋胡紅霞

    (開封市中心醫(yī)院眼科,河南 開封 475000)

    糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是一種糖尿病微血管并發(fā)癥,是一種特異性眼底病變,其主要的病理改變?yōu)橐暰W(wǎng)膜微血管變化[1]。DR患者的發(fā)病率主要與糖尿病病程相關(guān),患者常出現(xiàn)的臨床癥狀主要有硬性滲出、IRMA、出血斑點、微動脈瘤等,缺血廣泛可降低患者視力,致視網(wǎng)膜脫離,嚴重情況下可致盲[2]。DR的發(fā)生機制尚未完全明確,較為復(fù)雜,目前相關(guān)研究主要表明其與高血糖引起的代謝紊亂有關(guān),包括蛋白質(zhì)非酶糖基化終末產(chǎn)物的形成和己糖胺途徑的激活。蛋白激酶C激活,造成血管功能紊亂及氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng),導(dǎo)致血管閉塞、局部缺血及血管滲透性增強[3-4]。VEGF抑制劑可阻止脈絡(luò)膜新生血管形成,解除視網(wǎng)膜水腫,防治血管成分滲漏,改善視力,貝伐單抗屬于一種典型的VEGF抑制劑,在治療多種晚期腫瘤中效果明顯,目前已經(jīng)有研究顯示通過玻璃體注射貝伐單抗,能治療眼部新生血管性疾病,但是患者會出現(xiàn)并發(fā)癥,其作用機制也尚不明確[5]。本文將研究VEGF抑制劑對糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠的干預(yù)效果及對CRA血流動力學(xué)的影響。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物

    選取40只SPF級、健康雄性大鼠,4~6周齡,平均年齡(4.8±0.9)周,體重為170~190 g,平均體重(171.0±9.5)g,由廣東斯嘉景達生物科技有限公司提供[SCXK(粵)2020-0052],經(jīng)開封市中心醫(yī)院倫理委員會審批批準(IACUC-201805-K1)。實驗開始前,所有大鼠在我院動物研究實驗中心[SYXK(粵)2021-0251]適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,自由飲水,12 h晝夜節(jié)律,溫度為20~25℃,濕度為40%~50%。

    1.2 主要試劑與儀器

    貝伐單抗(上海麥克林生化科技有限公司,貨號:B873505-1);無菌檸檬酸(中國藥品生物制品檢定所,批號:2003-10);LBY-HJ四通道血小板聚集儀(上海寰熙醫(yī)療器械有限公司,貨號:79028);Laser Doppler Flowmetry激光血流儀(瑞典perimed,型號:P457);血糖儀(美國強生);雙抗體夾人酶聯(lián)免疫法試劑盒(上海西唐生物公司,貨號:F26260)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 糖尿病性視網(wǎng)膜病變大鼠模型建立

    對照組大鼠10只給予標準飼料喂養(yǎng),模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組各10只大鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。在8周后,對照組給予生理鹽水,模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組大鼠給予腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素。3 d后尿糖3+,采集大鼠尾靜脈血測血糖,血糖≥16.7 mmol/L,糖尿病大鼠造模成功。各組大鼠飲食情況如前,繼續(xù)喂養(yǎng)4周后,行眼底血管熒光造影檢查,確立大鼠出現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變,建模成功。

    1.3.2 干預(yù)

    無菌檸檬酸組給予0.05 mL的無菌檸檬酸腹腔干預(yù);VEGF抑制劑組大鼠給予玻璃體腔內(nèi)注入0.05 mL貝伐單抗干預(yù);對照組、模型組給予等體積的生理鹽水干預(yù),四組均連續(xù)給藥每天1次,各組均連續(xù)干預(yù)2周。

    1.3.3 CRA血流參數(shù)檢測

    應(yīng)用飛利浦IU22型彩色多普勒檢查,探頭頻率:10 MHz。腹腔注射麻醉,在獲取連續(xù)5個以上穩(wěn)定心動周期時,檢測干預(yù)2周后大鼠右眼CRA各項血流參數(shù)。根據(jù)多普勒超聲血流指標測定峰值血流速度:EDV、PSV、RI及PI。重復(fù)上述操作3次,取各項指標的平均值。

    1.3.4 血液流變學(xué)指標檢測

    采用激光血流儀檢測大鼠干預(yù)2周后全血粘度。大鼠心腔采血2.5 mL,血小板聚集率檢測用四通道血小板聚集儀。大鼠心腔采血1.5 mL,血小板黏附率檢測用體外血栓形成、血小板黏附兩用儀。

    1.3.5 脂聯(lián)素、空腹血糖(FBG)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、白介素-1β(IL-1β)水平檢測

    血糖測試前對動物禁食12 h,使用血糖儀檢測FBG水平。抽取大鼠尾部靜脈血2 mL,采用PBS緩沖液進行洗滌處理,轉(zhuǎn)速為2000 r/min離心干預(yù)10 min,摒棄上清液,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法試劑盒檢測各組大鼠血漿中脂聯(lián)素、ICAM-1、IL-1β水平。

    1.3.6 病理學(xué)觀察

    采用LDF激光血流儀及眼球固定象限測定法檢測干預(yù)2周后各組大鼠雙眼血流。檢查完成后將大鼠處死,摘取每只大鼠左側(cè)眼球,10%甲醛固定24 h,經(jīng)脫鈣、脫水、透明以及包埋等處理制成石蠟塊,保存待用。將組織進行切片,HE染色,光鏡下觀察病理學(xué)變化。

    1.3.7 Western blot檢測Ras、Raf-1及ERK表達量檢測

    將所采集到的大鼠左側(cè)眼球組織標本,進行研磨,然后加入蛋白緩沖液,常規(guī)蛋白提取,BCA法定量分析。50μg蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)到PVDF膜,在TBST中將5%的脫脂奶粉避光封閉1 h,洗滌后加入一抗稀釋溶液(Ras、Raf-1及ERK按照1∶1000比例進行稀釋),在4℃的環(huán)境中保存過夜,洗滌后加入二抗稀釋溶液(Ras、Raf-1及ERK按照1∶5000比例進行稀釋),在溫床中孵育1 h后再次洗滌,加入發(fā)光液ECL,使軟件分析蛋白條帶灰度值,內(nèi)參蛋白是GAPDH。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析處理。計量資料采用平均數(shù)±標準差(±s)描述,多組間比較采用齊性方差檢驗,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠CRA血流參數(shù)比較

    如表1所示,與正常大鼠相比,模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組EDV、PSV水平降低,RI及PI水平升高,具有顯著性差異(P<0.05);與模型組相比,無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組EDV、PSV水平升高,RI及PI水平降低,具有顯著性差異(P<0.05);與無菌檸檬酸組相比,VEGF抑制劑組EDV、PSV水平升高,RI及PI水平降低,具有顯著性差異(P<0.05)。

    表1 各組大鼠CRA血流參數(shù)比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of CRA blood flow parameters of rats in each group

    表1 各組大鼠CRA血流參數(shù)比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of CRA blood flow parameters of rats in each group

    注:與對照組相比,a P<0.05;與模型組相比,b P<0.05;與無菌檸檬酸組相比,c P<0.05。Note.Compared with the control group,a P<0.05.Compared with the model group,b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group,c P<0.05.

    組別Groups 舒張期最低流速(mm/s)EDV 收縮期峰值血流速度(mm/s)PSV 阻力指數(shù)RI 搏動指數(shù)PI對照組Control group 108.12±20.25 178.83±25.14 0.41±0.11 0.50±0.13模型組Model group 31.53±8.42a 58.92±11.37a 1.12±0.32a 1.35±0.35a無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 47.46±10.29ab 84.16±14.52ab 0.85±0.20ab 0.91±0.22ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 90.26±16.55abc 155.57±18.67abc 0.68±0.10abc 0.69±0.12abc F 16.566 20.614 9.953 10.799 P 0.001 0.001 0.001 0.001

    2.2 病理學(xué)觀察

    如圖1所示,對照組大鼠細胞內(nèi)外節(jié)形態(tài)規(guī)整,視網(wǎng)膜各層細胞排列整齊。模型組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)血管擴張,視網(wǎng)膜各層細胞結(jié)構(gòu)排列紊亂,細胞間水腫。無菌檸檬酸組大鼠周細胞輕度水腫,各層細胞結(jié)構(gòu)排列紊亂。VEGF抑制劑組視網(wǎng)膜各層細胞排列較完整。

    圖1 大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀察(HE染色)Figure 1 Histopathological observation of retina in rats(HE staining)

    2.3 各組大鼠血液流變學(xué)指標比較

    如表2所示,與正常大鼠相比,模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平升高,具有顯著性差異(P<0.05);與模型組相比,無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平降低,具有顯著性差異(P<0.05);與無菌檸檬酸組相比,VEGF抑制劑組全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平降低,具有顯著性差異(P<0.05)。

    表2 各組大鼠血液流變學(xué)指標比較(±s,n=10)Table 2 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group

    表2 各組大鼠血液流變學(xué)指標比較(±s,n=10)Table 2 Comparison of hemorheological indexes of rats in each group

    注:與對照組相比,a P<0.05;與模型組相比,b P<0.05;與無菌檸檬酸組相比,c P<0.05。Note.Compared with the control group,a P<0.05.Compared with the model group,b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group,c P<0.05.

    組別Groups全血粘度(mPa/s)Whole blood viscosity血小板聚集(%)Platelet aggregation rate血小板黏附(%)Platelet adhesion rate對照組Control group 1.13±40.22 58.65±13.92 26.31±5.20模型組Model group 1.96±0.63a 85.24±19.76a 48.73±12.82a無菌檸檬酸組terile citric acid group 1.75±0.45ab 76.31±17.53ab 39.18±10.35a VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.40±0.35abc 62.18±15.10abc 33.30±8.22ab 3.109 4.902 4.178 P 0.001 0.001 0.001 F Sbc

    2.4 各組大鼠脂聯(lián)素、空腹血糖水平比較

    如表3所示,與正常大鼠相比,模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平降低,F(xiàn)BG水平升高,具有顯著性差異(P<0.05);與模型組相比,無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平升高,F(xiàn)BG水平降低,具有顯著性差異(P<0.05);與無菌檸檬酸組相比,VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平升高,F(xiàn)BG水平降低,具有顯著性差異(P<0.05)。

    表3 各組大鼠脂聯(lián)素、FBG水平比較(±s,n=10)Table 3 Comparison of adiponectin and FBG levels of rats in each group

    表3 各組大鼠脂聯(lián)素、FBG水平比較(±s,n=10)Table 3 Comparison of adiponectin and FBG levels of rats in each group

    注:與對照組相比,a P<0.05;與模型組相比,b P<0.05;與無菌檸檬酸組相比,c P<0.05。Note.Compared with the control group,a P<0.05.Compared with the model group,b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group,c P<0.05.

    組別Groups脂聯(lián)素(mg/L)Adiponectin空腹血糖(mmol/L)FBG對照組Control group 2.29±0.71 5.35±1.18模型組Model group 0.31±0.10a 17.48±3.08a無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 0.58±0.25ab 12.51±2.61ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.65±0.55abc 8.91±1.70abc 11.726 17.445 P 0.001 0.001 F

    2.5 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較

    如表4所示,與正常大鼠相比,模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平升高,具有顯著性差異(P<0.05);與模型組相比,無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平降低,具有顯著性差異(P<0.05);與無菌檸檬酸組相比,VEGF抑制劑組VEGF、ICAM-1及IL-1β水平降低,具有顯著性差異(P<0.05)。

    表4 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較(±s,n=10)Table 4 Comparison of VEGF,ICAM-1 and IL-1β levels of rats in each group

    表4 各組大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平比較(±s,n=10)Table 4 Comparison of VEGF,ICAM-1 and IL-1β levels of rats in each group

    注:與對照組相比,a P<0.05;與模型組相比,b P<0.05;與無菌檸檬酸組相比,c P<0.05。Note.Compared with the control group,a P<0.05.Compared with the model group,b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group,c P<0.05.

    組別Groups血管內(nèi)皮生長因子(pg/mL)VEGF細胞間黏附分子-1(ng/L)ICAM-1白介素-1β(pg/mL)IL-1β對照組Control group 40.76±9.53 58.08±8.22 6.38±1.15模型組Model group 91.19±19.48a 89.65±19.71a 18.15±4.26a無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 75.81±16.32ab 78.84±18.39ab 12.02±3.01ab VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 53.15±13.70abc 67.39±11.55abc 8.10±2.12abc 9.509 4.008 6.914 P 0.001 0.001 0.001 F

    2.6 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達量比較

    如表5、圖2所示,與正常大鼠相比,模型組、無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達量升高,具有顯著性差異(P<0.05);與模型組相比,無菌檸檬酸組、VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達量降低,具有顯著性差異(P<0.05);與無菌檸檬酸組相比,VEGF抑制劑組Ras、Raf-1及ERK表達量降低,具有顯著性差異(P<0.05)。

    圖2 Ras、Raf-1及ERK蛋白表達Western blot圖Figure 2 Western blot of Ras,Raf-1 and ERK protein expression

    表5 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達量比較(±s,n=10)Table 5 Comparison of the expression levels of Ras,Raf-1 and ERK in each group of rats

    表5 各組大鼠Ras、Raf-1及ERK表達量比較(±s,n=10)Table 5 Comparison of the expression levels of Ras,Raf-1 and ERK in each group of rats

    注:與對照組相比,a P<0.05;與模型組相比,b P<0.05;與無菌檸檬酸組相比,c P<0.05。Note.Compared with the control group,a P<0.05.Compared with the model group,b P<0.05.Compared with the sterile citric acid group,c P<0.05.

    組別Groups Ras Raf-1 ERK對照組Control group 1.34±0.41 1.45±0.23 0.73±0.14模型組Model group 5.82±1.64a 3.91±0.92a 2.42±0.78無菌檸檬酸組Sterile citric acid group 3.67±1.13ab 2.53±0.75ab 1.59±0.40 VEGF抑制劑組VEGF inhibitor group 1.98±0.62abc 1.90±0.51abc 1.05±0.21 12.010 5.885 9.242 P 0.001 0.001 0.001 Faababc

    3 討論

    在我國DR的發(fā)病率逐年上升,其主要是由多種因素共同作用導(dǎo)致的,是目前國內(nèi)外導(dǎo)致低視力及致盲的重要疾病,不及時的有效治療會隨著病情發(fā)展導(dǎo)致失明,尋找有效的治療方法尤為重要[6]。隨著病程的不斷進展,DR促使其局部缺血缺氧,促使毛細血管通透性增加,促使新生血管生成等,新生血管會導(dǎo)致結(jié)締組織增生及玻璃體出血等,進一步增加視力喪失及視網(wǎng)膜脫離風(fēng)險[7]。較多學(xué)者為臨床治療提高新的靶點,發(fā)現(xiàn)血管生成抑制因子與血管生成刺激因子之間的動態(tài)平衡在其發(fā)展與發(fā)生過程中具有重要作用[8]。VEGF其生物活性可以被抑制劑阻斷,是最重要的眼內(nèi)新生血管生長因子,達到抑制新生血管生成的目的[9-10]。

    視網(wǎng)膜CRA是供應(yīng)視網(wǎng)膜內(nèi)參的主要血管,屬于終末動脈,是眼動脈的分支,在維持視覺功能方面起重要的作用。視網(wǎng)膜動脈參數(shù)可用來反映視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)狀況,與視網(wǎng)膜微循環(huán)的狀態(tài)[11]。本文研究顯示,VEGF抑制劑能提高大鼠EDV、PSV水平升高,降低RI及PI水平,從而改善視網(wǎng)膜CRA血流動力學(xué)狀況。機體長時間處于高血糖狀態(tài)易造成血-視網(wǎng)膜屏障受損,血小板聚集性增強,同時視網(wǎng)膜毛細血管閉塞,視網(wǎng)膜血管彈性下降,促進新生血管形成,引起視網(wǎng)膜毛細血管增生與微血管瘤[12-13]。本文結(jié)果指出,VEGF抑制劑能降低大鼠全血粘度、血小板聚集率及血小板黏附率水平。脂聯(lián)素是脂肪細胞特異性分泌的一種蛋白質(zhì),在糖尿病合并癥的發(fā)展中具有重要的作用,其水平增高可引起微循環(huán)障礙[14]。本文中,與無菌檸檬酸組相比,VEGF抑制劑組脂聯(lián)素水平升高,F(xiàn)BG水平降低。

    VEGF是血管內(nèi)皮細胞特異的促有絲分裂素,過度表達會增加血管的滲透性,促進血管的異常增殖,其與組織中新生血管數(shù)量具有密切聯(lián)系,能特異性的作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞[15]。炎性細胞黏附與血管內(nèi)皮細胞是由ICAM-1介導(dǎo)的,損害局部血管,導(dǎo)致活化氧自由基、炎癥遞質(zhì)等,引起血管通透性增加,加重視網(wǎng)膜的損傷[16-17]。IL-1β在DR中加重視網(wǎng)膜病變,誘導(dǎo)ICAM-1等黏附因子,起關(guān)鍵作用的一種致炎因子[18]。本文指出,VEGF抑制劑通過能降低糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠VEGF、ICAM-1及IL-1β水平,在抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠炎癥方面作用顯著。Ras/Raf-1/ERK通路是調(diào)控細胞增殖、凋亡與分化的重要途徑,是一個蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng),在VEGF介導(dǎo)的血管生成信號通路上起促進VEGF表達的作用[19]。VEGF抑制劑相對分子量小,能夠穿透視網(wǎng)膜,與血管內(nèi)皮生長因子特異性結(jié)合,加快緩解水腫,防治視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生滲漏,阻止血管新生、再生,減輕炎癥反應(yīng),改善視網(wǎng)膜功能[20]。本文研究結(jié)果顯示,VEGF抑制劑對糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠Ras、Raf-1及ERK蛋白表達有一定的調(diào)控作用,為其作用機制提供研究方向。本文研究的局限性主要體現(xiàn)在,本文研究實驗僅做了一個時間點的視網(wǎng)膜病變的觀察,在抑制糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)展這一結(jié)論研究方面,數(shù)據(jù)不充分,仍需要后續(xù)多試驗點加以證實。

    綜上所述,VEGF抑制劑可改善糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型大鼠CRA血流動力學(xué)與血液流變學(xué)指標,降低VEGF、ICAM-1及IL-1β水平,抑制血管新生。

    猜你喜歡
    水平模型
    一半模型
    張水平作品
    重要模型『一線三等角』
    重尾非線性自回歸模型自加權(quán)M-估計的漸近分布
    作家葛水平
    火花(2019年12期)2019-12-26 01:00:28
    加強上下聯(lián)動 提升人大履職水平
    3D打印中的模型分割與打包
    老虎獻臀
    FLUKA幾何模型到CAD幾何模型轉(zhuǎn)換方法初步研究
    做到三到位 提升新水平
    中國火炬(2010年8期)2010-07-25 11:34:30
    99热国产这里只有精品6| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲国产精品999| 亚洲成人免费av在线播放| 国产成人欧美| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲成国产人片在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲综合色网址| 欧美精品av麻豆av| 欧美久久黑人一区二区| xxxhd国产人妻xxx| 一级毛片女人18水好多| 丝袜美足系列| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产熟女午夜一区二区三区| 中国国产av一级| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产精品成人在线| 超色免费av| 一区在线观看完整版| 欧美日韩福利视频一区二区| 热99re8久久精品国产| 性少妇av在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 午夜激情久久久久久久| 国产麻豆69| 日本vs欧美在线观看视频| 免费av中文字幕在线| 国产成人a∨麻豆精品| 国产亚洲av高清不卡| 日韩视频在线欧美| 中文字幕人妻丝袜制服| 两人在一起打扑克的视频| 91精品国产国语对白视频| 国产亚洲av高清不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 美女高潮到喷水免费观看| 丝袜人妻中文字幕| 精品第一国产精品| 一二三四在线观看免费中文在| 国产在线观看jvid| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久国产精品人妻蜜桃| 又紧又爽又黄一区二区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 男男h啪啪无遮挡| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日本av手机在线免费观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 91字幕亚洲| 动漫黄色视频在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 欧美97在线视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av电影在线进入| 电影成人av| 最黄视频免费看| 狂野欧美激情性xxxx| 我的亚洲天堂| 又黄又粗又硬又大视频| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品中文字幕在线视频| av在线app专区| 另类亚洲欧美激情| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | a 毛片基地| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美性长视频在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲欧美激情在线| 丰满少妇做爰视频| 色播在线永久视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久国产精品麻豆| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲少妇的诱惑av| 男女之事视频高清在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜激情av网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产激情久久老熟女| 五月天丁香电影| 免费少妇av软件| 男女之事视频高清在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲视频免费观看视频| 青草久久国产| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美在线黄色| a级毛片在线看网站| 欧美大码av| 性色av一级| 国产精品二区激情视频| 女警被强在线播放| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| av在线app专区| 男女之事视频高清在线观看| 国产一区二区 视频在线| 动漫黄色视频在线观看| videosex国产| 成年人黄色毛片网站| 成人三级做爰电影| www.熟女人妻精品国产| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 精品一品国产午夜福利视频| 国产av精品麻豆| 黄片大片在线免费观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品国产国语对白av| 国产在视频线精品| 成年av动漫网址| 亚洲久久久国产精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产色视频综合| av天堂久久9| 久久人人爽人人片av| 欧美精品高潮呻吟av久久| 精品视频人人做人人爽| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品高清国产在线一区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产高清视频在线播放一区 | 精品久久久久久电影网| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲国产欧美网| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线精品无人区一区二区三| 在线看a的网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产av国产精品国产| 欧美性长视频在线观看| 国产高清视频在线播放一区 | 人妻久久中文字幕网| 精品第一国产精品| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费黄频网站在线观看国产| 丝袜人妻中文字幕| 丝袜美足系列| 国产精品国产av在线观看| 久久九九热精品免费| 大片免费播放器 马上看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 桃红色精品国产亚洲av| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲av国产av综合av卡| 日日爽夜夜爽网站| 日韩一区二区三区影片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线永久观看黄色视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄片播放在线免费| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲 国产 在线| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲av国产av综合av卡| 精品欧美一区二区三区在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 18禁观看日本| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 精品免费久久久久久久清纯 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产在线观看jvid| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| 99热国产这里只有精品6| 国产高清国产精品国产三级| 精品久久久精品久久久| 国产成人欧美| 国产真人三级小视频在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 一级片免费观看大全| 免费观看a级毛片全部| 国产亚洲欧美精品永久| av在线播放精品| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品二区激情视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品成人在线| 国产国语露脸激情在线看| 黑人猛操日本美女一级片| 无限看片的www在线观看| 悠悠久久av| 欧美黄色片欧美黄色片| 1024视频免费在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 曰老女人黄片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 99国产综合亚洲精品| 首页视频小说图片口味搜索| 国产成人a∨麻豆精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产淫语在线视频| 大香蕉久久成人网| 国产精品一区二区在线不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| www.自偷自拍.com| 国产精品.久久久| 日本wwww免费看| 人人澡人人妻人| 一级a爱视频在线免费观看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 青青草视频在线视频观看| 久久国产精品影院| 两个人免费观看高清视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一本综合久久免费| 久久精品国产a三级三级三级| 他把我摸到了高潮在线观看 | 欧美xxⅹ黑人| av网站在线播放免费| 国产精品久久久久成人av| 国产免费av片在线观看野外av| 久久性视频一级片| 窝窝影院91人妻| 亚洲伊人色综图| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 夫妻午夜视频| 午夜激情av网站| 精品一区二区三卡| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产熟女午夜一区二区三区| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产成人免费观看mmmm| 99九九在线精品视频| 国产精品免费视频内射| 欧美黑人精品巨大| 丝袜人妻中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 嫩草影视91久久| av有码第一页| 国产黄色免费在线视频| 色播在线永久视频| 97在线人人人人妻| a级毛片在线看网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 精品视频人人做人人爽| 69精品国产乱码久久久| 我的亚洲天堂| 免费黄频网站在线观看国产| a在线观看视频网站| 91精品国产国语对白视频| 免费少妇av软件| 国产色视频综合| 午夜福利影视在线免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| av网站免费在线观看视频| av天堂久久9| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美xxⅹ黑人| 国产一卡二卡三卡精品| 丝袜人妻中文字幕| 看免费av毛片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产有黄有色有爽视频| 女人精品久久久久毛片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线永久观看黄色视频| 国产麻豆69| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲欧美激情在线| 宅男免费午夜| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 捣出白浆h1v1| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久ye,这里只有精品| 人妻人人澡人人爽人人| 精品视频人人做人人爽| av福利片在线| a 毛片基地| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 9191精品国产免费久久| 十八禁高潮呻吟视频| 久久毛片免费看一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 国产亚洲欧美精品永久| 超碰成人久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 制服诱惑二区| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产男女超爽视频在线观看| 久久 成人 亚洲| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产精品一区二区在线不卡| 考比视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久久国产电影| 亚洲精华国产精华精| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 交换朋友夫妻互换小说| 精品卡一卡二卡四卡免费| 免费在线观看完整版高清| 老司机福利观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99久久国产精品久久久| 久久久久久人人人人人| 一区在线观看完整版| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品久久久精品久久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品影院久久| 黄色视频,在线免费观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 大香蕉久久网| av一本久久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 午夜老司机福利片| 一二三四在线观看免费中文在| 岛国毛片在线播放| 免费av中文字幕在线| 婷婷成人精品国产| 成人亚洲精品一区在线观看| 伦理电影免费视频| 男女午夜视频在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品 欧美亚洲| 99国产精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 热re99久久精品国产66热6| 黄色视频不卡| 国产区一区二久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 女性生殖器流出的白浆| av福利片在线| 亚洲精品国产av成人精品| 搡老岳熟女国产| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产高清videossex| 18禁观看日本| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久久久久免费视频了| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 中文字幕制服av| 免费观看a级毛片全部| 久久久久久免费高清国产稀缺| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜两性在线视频| 成年人黄色毛片网站| 国产精品一二三区在线看| 亚洲av国产av综合av卡| 97精品久久久久久久久久精品| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩人妻精品一区2区三区| www日本在线高清视频| 国产伦人伦偷精品视频| 女性被躁到高潮视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 岛国在线观看网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品久久久久久精品电影小说| 51午夜福利影视在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 成人免费观看视频高清| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品九九99| 亚洲精品av麻豆狂野| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 窝窝影院91人妻| 日本黄色日本黄色录像| 国精品久久久久久国模美| 男女床上黄色一级片免费看| 日本av手机在线免费观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 搡老乐熟女国产| 久热这里只有精品99| 午夜久久久在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 久久ye,这里只有精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久综合国产亚洲精品| 午夜福利,免费看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产av一区二区精品久久| 人妻久久中文字幕网| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日本wwww免费看| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲国产av影院在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲全国av大片| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一本综合久久免费| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产国语露脸激情在线看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品一区在线观看国产| 在线观看一区二区三区激情| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜福利视频精品| 两个人免费观看高清视频| 一区二区av电影网| 亚洲五月色婷婷综合| 免费高清在线观看日韩| 精品人妻在线不人妻| 91av网站免费观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| av在线app专区| 老鸭窝网址在线观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美黄色片欧美黄色片| 日本av手机在线免费观看| 国产精品九九99| 精品国产国语对白av| 老司机影院毛片| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品国产区一区二| 满18在线观看网站| 亚洲成人手机| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品国产国语对白av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 老司机福利观看| 国产xxxxx性猛交| 成年女人毛片免费观看观看9 | 高清黄色对白视频在线免费看| av在线播放精品| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲人成电影免费在线| 热re99久久精品国产66热6| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 久久青草综合色| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 免费不卡黄色视频| 青春草视频在线免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品人人爽人人爽视色| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 少妇 在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美 日韩 精品 国产| 热99re8久久精品国产| tube8黄色片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩视频在线欧美| 国产男女内射视频| 99re6热这里在线精品视频| 免费观看人在逋| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 热re99久久精品国产66热6| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 免费不卡黄色视频| 欧美午夜高清在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美黑人欧美精品刺激| 视频区图区小说| a级毛片黄视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 青青草视频在线视频观看| 丝袜喷水一区| 精品一区二区三卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 91九色精品人成在线观看| 人妻 亚洲 视频| 91麻豆av在线| 婷婷色av中文字幕| 免费少妇av软件| 少妇人妻久久综合中文| 美女国产高潮福利片在线看| 青春草视频在线免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 美女国产高潮福利片在线看| 午夜福利免费观看在线| 在线观看免费午夜福利视频| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久性视频一级片| 丰满迷人的少妇在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精品免费久久久久久久清纯 | 超色免费av| 亚洲情色 制服丝袜| 新久久久久国产一级毛片| a在线观看视频网站| 一二三四在线观看免费中文在| 国产有黄有色有爽视频| 不卡av一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 天堂8中文在线网| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 男女国产视频网站| 欧美黑人精品巨大| 丝袜美足系列| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久久久久免费高清国产稀缺| 成人国产av品久久久| av在线app专区| 亚洲伊人久久精品综合| 蜜桃国产av成人99| 后天国语完整版免费观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频 | 2018国产大陆天天弄谢| 日韩中文字幕视频在线看片| 9191精品国产免费久久| 亚洲九九香蕉| 99久久99久久久精品蜜桃| 51午夜福利影视在线观看| 精品高清国产在线一区| 久久中文看片网| 亚洲精品久久午夜乱码| 18禁国产床啪视频网站| 脱女人内裤的视频| 人妻 亚洲 视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲专区字幕在线| 十八禁网站网址无遮挡| 一级毛片精品| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 青青草视频在线视频观看| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲国产av新网站| 天天影视国产精品| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲第一av免费看| 国产成人免费观看mmmm| 麻豆乱淫一区二区| 99香蕉大伊视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 久9热在线精品视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| av福利片在线| 亚洲少妇的诱惑av| 国产成人影院久久av| 黄色 视频免费看| 欧美xxⅹ黑人| 另类精品久久| 桃花免费在线播放| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜成年电影在线免费观看| 丝袜喷水一区| 久久久久精品国产欧美久久久 | 美女中出高潮动态图| 女人精品久久久久毛片| 精品国产一区二区三区四区第35| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产一区有黄有色的免费视频| 三级毛片av免费| 国产亚洲精品第一综合不卡| 青草久久国产| 亚洲精品中文字幕在线视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 午夜两性在线视频| 欧美精品一区二区大全| 欧美成人午夜精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩免费高清中文字幕av| 国产一区二区激情短视频 | 午夜福利乱码中文字幕| 色播在线永久视频| 国产av又大| 99久久人妻综合| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 中文字幕精品免费在线观看视频| 中文欧美无线码| 久久狼人影院| 中国国产av一级| cao死你这个sao货| videos熟女内射| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频|