基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒拷貝數(shù)的檢測方法的建立及應(yīng)用

盧天宇高 虹楊博超于佳楠徐亞新王若琳秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

在臨床實(shí)踐中，可供移植用的人類組織器官目前仍面臨嚴(yán)重的短缺問題，使用源自豬的細(xì)胞、組織或器官進(jìn)行異種移植，是解決該問題的潛在途徑之一[1]。豬內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)是一種C型逆轉(zhuǎn)錄病毒，在進(jìn)化過程中以前病毒DNA的形式被整合在豬基因組中[2]。目前PERV對(duì)于體內(nèi)人類細(xì)胞的感染風(fēng)險(xiǎn)尚不確定，而供體豬不能通過無特定病原體培育、早期斷奶或胚胎移植等方式消除PERV，從而造成了異種移植的潛在生物安全隱患[3]。因此，精確的測定PERV在供體動(dòng)物中的拷貝數(shù)，以預(yù)測PERV的感染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于異種移植的臨床研究及應(yīng)用具有重要的意義。

傳統(tǒng)檢測PERV拷貝數(shù)通常使用Southern blot[4]、熒光原位雜交[5]以及定量PCR(quantitative PCR，qPCR)[6－7]等方法，不同的方法對(duì)PERV的拷貝數(shù)測定結(jié)果有所差異[8]。其中，最常使用的qPCR方法在每次檢測時(shí)都必須進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，而單次所能夠檢測樣品數(shù)較少，加之PERV在不同來源的豬基因組中的拷貝數(shù)變化較大[9]，擴(kuò)增效率很難保證一致，易造成檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性低和重復(fù)性差。

數(shù)字PCR作為新興的技術(shù)，越來越廣泛的用于核酸樣品的分析，例如基因表達(dá)的檢測[10]、病毒拷貝數(shù)的分析和絕對(duì)定量分析[11－13]以及拷貝數(shù)變異分析[14]等。相比于qPCR技術(shù)，使用數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量分析不依賴于引物擴(kuò)增效率，不需要使用標(biāo)準(zhǔn)品，可以直接測定出樣品中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，極大地減少了技術(shù)干擾，是真正意義上的絕對(duì)定量[15]。而微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)則是通過微滴發(fā)生油將整個(gè)反應(yīng)體系分割成多個(gè)反應(yīng)微滴，再在單個(gè)微滴內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立的PCR擴(kuò)增，通過讀取熒光信號(hào)確定陽性微滴和陰性微滴，根據(jù)泊松分布的原理推算目標(biāo)基因的拷貝數(shù)[16－17]。

本研究采用雙重?zé)晒釺aqMan探針，分別以豬GAPDH和TFRC作為內(nèi)參基因，通過對(duì)于退火溫度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)以及檢測樣本量等參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，建立了基于ddPCR技術(shù)的PERV拷貝數(shù)檢測方法。通過與基于qPCR檢測方法的比較，我們展示了所建立的PERV拷貝數(shù)檢測新方法具有更高的靈敏度和更好重復(fù)性，為異種移植研究中PERV拷貝數(shù)的檢測提供更好的技術(shù)和參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品

將豬GAPDH基因(3430~4294 bp)、TFRC基因(1200~1947 bp)和PERV的pol基因(3344~4115 bp)，長度分別為730、665和748 bp的DNA片段，克隆到pEASY(3929 bp)載體上，獲得pEASYGAPDH、pEASY-TFRC和pEASY-pol質(zhì)粒。紫外分光光度計(jì)測定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度而計(jì)算拷貝數(shù)，通過10倍梯度稀釋，獲得107、106、105、104、103、102、10和1 copies/μL的濃度梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.1.2 豬基因組DNA

本研究中采用的豬基因組DNA樣品，分別是來自2個(gè)豬胚胎成纖維細(xì)胞(porcine embryonic fibroblasts，PEF)、豬的腎表皮細(xì)胞系PK15以及來自3個(gè)不同個(gè)體的巴馬小型豬的肺部組織，按照基因組提取試劑盒說明書獲得細(xì)胞和組織基因組。

1.2 主要試劑與儀器

基因組提取試劑盒(全式金，中國)；用于qPCR的TB Green Mix(TaKaRa公司，中國)；微滴生成油、微滴讀取油、ddPCR的反應(yīng)液、微滴生成卡(Bio-Rad，美國)；MseI內(nèi)切酶(NEB，中國)；96孔板(ABI，美國)；Nano Drop紫外分光光度(賽默飛，美國)；QX20TM Droplet Digital PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，美國，包括微滴發(fā)生儀、微滴分析儀和熱膜封口儀)；CFX定量PCR儀(Bio-Rad，美國)；T100梯度PCR儀(Bio-Rad，美國)；引物和探針均由北京六合華大合成，具體信息見表1。

表1 檢測PERV拷貝數(shù)所用的引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probes

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微滴數(shù)字PCR

(1)基因組酶切:500 ng基因組采用5 U MseI限制性內(nèi)切酶，37℃水浴2 h。

(2)微滴生成:配制20μL反應(yīng)體系(其中包含反應(yīng)液mix 10μL，引物各900 nmol/L，探針各250 nmol/L，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；騇seI酶切后的基因組1μL，補(bǔ)充水至20μL)加入微滴反應(yīng)卡中。在微滴反應(yīng)卡加入70μL微滴生成油，發(fā)生卡膠墊蓋好后，將微滴發(fā)生卡放在微滴生成儀中生成微滴。

(3)PCR擴(kuò)增:將生成的微滴轉(zhuǎn)移到96孔板中，用PX1進(jìn)行膜熱封后，96孔板放在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)參為95℃10 min；94℃30 s，退火溫度1 min，40~50個(gè)循環(huán)；98℃10 min，所有步驟升溫速度均為2℃/s。

(4)微滴讀取:擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板放入QX200微滴分析儀中，采用Quantsoft軟件進(jìn)行微滴讀取。

1.3.2 qPCR反應(yīng)體系和條件

本實(shí)驗(yàn)中qPCR的反應(yīng)體系為25μL(TB Green mix 12.5μL、10μmol/L PCR引物各1μL、模板DNA約100 ng、補(bǔ)充水至25μL)。PCR反應(yīng)條件為95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.3 ddPCR退火溫度的優(yōu)化

選擇63.0℃、61.9℃、60.9℃、59.9℃、58.6℃、57.5℃6個(gè)溫度，進(jìn)行退火和延伸溫度的優(yōu)化。以104copies/μL的3個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以及1.25 ng的PEF 10?；蚪M為模板，確定最佳退火溫度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Quantasoft軟件對(duì)ddPCR數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像處理和結(jié)果分析，本研究中所有涉及的ddPCR反應(yīng)微滴生成數(shù)均在10000~15000，符合ddPCR泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，保證了后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用GraphPad進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和差異分析，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，三組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 微滴數(shù)字PCR退火溫度的優(yōu)化

以104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分別在63.0℃、61.9℃、60.9℃、59.9℃、58.6℃、57.5℃6個(gè)退火溫度下進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示pEASYGAPDH、pEASY-TFRC和pEASY-pol標(biāo)準(zhǔn)品在這6個(gè)溫度條件下均能檢測到熒光信號(hào)，在不同退火溫度下沒有顯著差別(圖1A和表2)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒在不同退火溫度下ddPCR檢測的拷貝數(shù)Table 2 Copy numbers of standard plasmids detected by ddPCR at different annealing temperatures

以63.0℃、61.9℃、60.9℃、59.9℃、58.6℃、57.5℃為退火和延伸溫度，PEF基因組作為模板，分別以GAPDH和TFRC為內(nèi)參基因進(jìn)行ddPCR檢測。如一維散點(diǎn)圖所示，pol基因、GAPDH基因和TFRC基 因 分 別 在59.9℃~61.9℃、57.5℃~63.0℃、57.5℃~60.9℃進(jìn)行退火和延伸溫度適合(圖1B和1C)。綜上，本研究選用59.9℃作為后續(xù)ddPCR反應(yīng)的最佳退火和延伸溫度。

2.2 微滴數(shù)字PCR循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

根據(jù)Bio-Rad官方建議，ddPCR反應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)應(yīng)為40個(gè)，但在以基因組為模板對(duì)退火溫度優(yōu)化時(shí)，PERVpol基因擴(kuò)增后的陰、陽微滴較難分開(圖1B和1C)，易造成結(jié)果分析的偏差。因此，本研究通過提高PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)來優(yōu)化這一反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)分別采用40、45和50個(gè)擴(kuò)增循環(huán)對(duì)PEF的基因組模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的提高對(duì)于微滴生成并沒有顯著影響(圖2A)。但是，隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，pol基因擴(kuò)增微滴的陰、陽性信號(hào)逐漸分開(圖2B)。因此，本研究確定50個(gè)擴(kuò)增循環(huán)作為后續(xù)ddPCR檢測的反應(yīng)條件。

圖1 不同退火溫度下ddPCR擴(kuò)增一維散點(diǎn)圖Figure 1 One-dimensional scatter plot of ddPCR at different annealing temperatures

圖2 ddPCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化Figure 2 Optimization of ddPCR cycle number

2.3 dd PCR檢測范圍的確定

本研究將3個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行ddPCR檢測。結(jié)果顯示，隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度降低，陽性微滴數(shù)減少，3個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)品以106copies/μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的微滴全部為陽性微滴，超出了檢測上限；以1 copy/μL的標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的微滴中并未檢測到陽性微滴(圖3A)。采用ddPCR檢測標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)與紫外分光光度計(jì)測定的DNA拷貝數(shù)，在檢測范圍內(nèi)具有良好的相關(guān)性，pol基因r2＝0.992，P<0.001、GAPDH基因r2＝0.9976，P<0.0001、TFRC基因r2＝0.996，P<0.001(圖3B)。

本研究將PEF基因組按照107.5、5、2.5、1.25和0.625 ng為模板進(jìn)行ddPCR。樣本以10 ng基因組為模板，陽性微滴數(shù)超過了總微滴數(shù)的90%(圖3C)。隨著基因組模板濃度的降低，檢測結(jié)果的變異系數(shù)提高(圖3 D)。因此在滿足ddPCR反應(yīng)不超過檢測上限的基礎(chǔ)上，提高模板量能夠提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測PERV拷貝數(shù)時(shí)，采用基因組模板在1.25~7.5 ng進(jìn)行PERV拷貝數(shù)的檢測為宜。

圖3 ddPCR對(duì)于PERV拷貝數(shù)的檢測范圍Figure 3 Range of template for PERV copy number detected by ddPCR

2.4 樣本檢測

對(duì)來自3個(gè)細(xì)胞和3個(gè)肺組織的基因組樣本，采用ddPCR和qPCR兩種方法進(jìn)行PERV拷貝數(shù)的檢測。結(jié)果顯示，ddPCR檢測PERV拷貝數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)在0.44%~8.29%之間，顯著低于同一樣本qPCR檢測結(jié)果的變異系數(shù)，顯示了ddPCR檢測結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性(表3)。

表3 ddPCR和qPCR測定不同來源豬基因組中PERV的拷貝數(shù)(±s)Table 3 PERV copy numbers in pig genome detected by ddPCR and qPCR

表3 ddPCR和qPCR測定不同來源豬基因組中PERV的拷貝數(shù)(±s)Table 3 PERV copy numbers in pig genome detected by ddPCR and qPCR

注:數(shù)據(jù)來自3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。Note.Data came from three independent replicates.

微滴式數(shù)字PCR(copies/μL)ddPCR樣品Samples熒光定量PCR(copies/μL)qPCR GAPDH為內(nèi)參GAPDH as reference gene TFRC為內(nèi)參TFRC as reference gene GAPDH為內(nèi)參GAPDH as reference gene TFRC為內(nèi)參TFRC as reference gene拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient of variation拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient of variation拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient of variation拷貝數(shù)Copy number變異系數(shù)Coefficient o variation PEF 6＃ 32.50±0.14 0.44% 33.25±2.76 8.29% 67.53±13.43 19.89% 24.38±4.06 16.66%PEF 10＃ 33.17±1.42 4.27% 32.87±1.03 3.12% 210.44±63.70 30.27% 52.00±12.67 24.37%PK15 59.10±3.87 6.65% 57.60±0.66 1.14% 175.75±32.26 18.41% 78.70±2.65 3.37%肺1＃Lung 1＃ 41.07±0.93 2.26% 28.83±0.71 2.46% 49.52±5.92 11.95% 32.58±3.76 11.54%肺2＃Lung 2＃ 40.37±0.31 0.76% 32.60±0.56 1.71% 69.10±7.76 11.24% 42.33±3.11 7.35%肺3＃Lung 3＃ 39.50±2.02 5.12% 32.40±1.18 3.64% 64.68±9.23 14.27% 40.88±2.65 6.63%

3 討論

隨著免疫抑制藥物研究和基因修飾供體動(dòng)物的快速發(fā)展，將豬源器官異種移植到非人靈長類動(dòng)物模型后，移植物可以存活數(shù)月甚至數(shù)年[19－21]，異種移植是否可應(yīng)用于臨床也被不斷的討論。但是，體外研究發(fā)現(xiàn)PERV可以感染人源細(xì)胞[22－23]，因此豬源組織器官異種移植到人體存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)。從當(dāng)前豬到非人靈長類模型的的研究結(jié)果，對(duì)供體豬體內(nèi)PERV活性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測可以提前預(yù)測并防范該風(fēng)險(xiǎn)[24]。因此，對(duì)PERV拷貝的精確檢測對(duì)于異種移植的臨床應(yīng)用具有重要的意義。

本研究采用ddPCR技術(shù)對(duì)豬基因組中PERV拷貝數(shù)的進(jìn)行檢測。與傳統(tǒng)的qPCR方法相比，檢測結(jié)果具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，所需的被檢測樣本量也僅是qPCR方法所需的1/10~1/20，更適操作中，微滴生成后，需將微滴轉(zhuǎn)移到其他模塊中進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。在轉(zhuǎn)移過程中可能造成液體的損失，從而導(dǎo)致目標(biāo)分子定量的低估[25]。因此，本研究中我們采用TaqMan熒光探針雙重微滴的方法，在同一微滴內(nèi)對(duì)內(nèi)參基因和目標(biāo)基因進(jìn)行絕對(duì)定量，從而規(guī)避了ddPCR的這一缺點(diǎn)。其次，ddPCR結(jié)果分析時(shí)確保陰性和陽性微滴的劃分對(duì)于結(jié)果的準(zhǔn)確性也非常重要，保證引物及探針的序列特異性和控制模板檢測范圍是控制這一因素的重要條件[26]。但是，PERV是作為前病毒被插入在豬基因組中，即使是高度保守的pol基因也含有點(diǎn)突變，且基因組中PERV的拷貝數(shù)較高，因此在ddPCR結(jié)果分析過程中微滴出現(xiàn)了“下雨”現(xiàn)象。為了解決這一問題，本研究中在選擇特異性較好的引物和探針的條件下，還提高了PCR的循環(huán)數(shù)，從而提高了陽性微滴熒光的振幅，解決了陽性微滴的識(shí)別，提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。這一結(jié)果也為采用ddPCR技術(shù)進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析時(shí)，優(yōu)化檢測條件提供了可行的方向。

在ddPCR中選擇適合的內(nèi)參基因，對(duì)于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性具有重要的影響。GAPDH和TFRC基因是豬基因組中的單拷貝基因[27]，在本研究中被選做內(nèi)參基因。結(jié)果顯示，在3個(gè)細(xì)胞來源的樣品中，分別采用兩個(gè)不同的內(nèi)參基因，PERV拷貝數(shù)檢測顯示了良好的一致性，在后續(xù)的研究中可以作為PERV拷貝數(shù)檢測的候選內(nèi)參基因。但是在組織樣品檢測中，GAPDH和TFRC分別作為內(nèi)參基因后所得到的結(jié)果略有差異。我們推測可能是由于組織樣本中含有多種類型的細(xì)胞，尤其是存在大量血細(xì)胞，而造成了這一差異[8]。因此，在后續(xù)研究中，從組織樣本分離單一類型的細(xì)胞進(jìn)行PERV拷貝數(shù)的檢測有可能提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究建立了基于ddPCR技術(shù)對(duì)PERV拷貝數(shù)的檢測方法，為異種移植供體動(dòng)物中PERV的監(jiān)測提供了可靠的方法，對(duì)于異種移植的臨床研究具有重要的意義。