單次大劑量對比多次小劑量STZ誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠糖尿病腎病模型的研究

冷昌龍皮明山龔曉康

(江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，武漢 430000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是以蛋白尿、水腫、高血壓和腎功能不全為主要臨床表現(xiàn)的糖尿病并發(fā)癥，也是引起終末期腎病，導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要病因之一[1]。DN在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，20%~30%的糖尿病患者會并發(fā)糖尿病腎病，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2]。目前對DN的研究雖然很多，但其具體的發(fā)病機制仍未完全闡明。因此，建立一種簡單、經(jīng)濟、穩(wěn)定可靠，同時病理表現(xiàn)與人類糖尿病腎病類似的動物模型對于深入研究DN的發(fā)病機制及新藥開發(fā)有著非常重要的意義。DN動物模型主要分為誘發(fā)型和自發(fā)型[3－4]。自發(fā)型模型大小鼠價格昂貴，對環(huán)境要求高，嚴(yán)重限制了相關(guān)研究的開展。誘發(fā)型模型常用STZ進行誘導(dǎo)，造模過程中STZ的注射劑量直接影響動物模型成模率及成模穩(wěn)定性，但國內(nèi)外STZ造模法中STZ劑量選用報道眾多，尚存有爭議[5－6]。本研究選取單次大劑量單次注射和多次小劑量連續(xù)注射STZ聯(lián)合高糖高脂飲食建立DN模型，對比觀察造模過程中模型的穩(wěn)定性，旨在探索更為合理的糖尿病腎病的造模方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠(18~20)g，共48只，購于北京維通利華公司[SCXK(京)2016-0006]。飼養(yǎng)于江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心[SYXK(鄂)2018-0042]，恒溫恒濕(溫度:(23±2)℃，相對濕度:60%~70%)，12 h明暗交替，動物自由進食飲水。本實驗通過江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理審查(IACUC20191210)，依據(jù)優(yōu)化、減少、替代的3R原則進行實驗設(shè)計。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，用pH＝4.2的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中配制，現(xiàn)配現(xiàn)用；安準(zhǔn)血糖儀及血糖試紙(瑞士羅氏公司)；尿蛋白檢測試劑盒、血清肌酐檢測試劑盒、血清尿素氮檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、低密度脂蛋白檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；PAS染色試劑盒(上海源葉生物)；高糖高脂飼料(10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%普通飼料，江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)。小鼠代謝籠(上海玉研生物)；AU5800全自動生化分析儀(美國Beckman)；MULTISKAN GO酶標(biāo)儀(美國Thermo)；EC 350-1石蠟包埋機(美國Thermo)；MICROM HM 340E石蠟切片機(美國Thermo)；BX 51顯微鏡(日本OLYMPUS)。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖尿病腎病模型小鼠制備及分組

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分為3組，即普通飼料喂養(yǎng)組(對照組)12只，高脂高糖飼料喂養(yǎng)＋STZ單次大劑量組18只，高脂高糖飼料喂養(yǎng)＋STZ多次小劑量組18只。STZ造模組喂養(yǎng)高脂飼料4周后，小鼠禁食不禁水12 h，隨后對照組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液；多次小劑量組連續(xù)4 d腹腔注射STZ 50 mg/kg，單次大劑量組腹腔注射STZ 150 mg/kg一次，STZ注射2 h后給小鼠進食以防止低血糖。整個實驗期間，STZ造模組小鼠均采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)。實驗期間，按照動物實驗的3R原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。

1.3.2 標(biāo)本采集及檢測

注射STZ前及注射STZ后2、4、6、8、10周測量并記錄小鼠體重及飲水量；注射STZ前及注射STZ后2、4、6、8、10周各組小鼠禁食12 h后采取剪尾法測量空腹血糖；注射STZ后2、6、10周各組小鼠入代謝籠收集24 h尿液，采用考馬斯亮藍法測定24 h尿蛋白含量；注射STZ后第10周各組小鼠眼眶取血，2000 r/min離心取上清，用全自動生化分析儀檢測血清TC、TG、LDL、Scr及BUN，其中Scr采用苦味酸法，BUN采用脲酶法；小鼠處死后迅速剝離雙腎，生理鹽水清洗，濾紙吸干，剝離外包膜后稱雙腎重量，采用公式:腎臟指數(shù)＝m1/m2×100%(m1為小鼠雙腎總重量；m2為小鼠的體重)；將腎置于10%中性福爾馬林中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋并切片，石蠟切片梯度脫蠟至水，蒸餾水洗2 min，過碘酸溶液氧化10 min，流水洗10 min，希夫(Schiff)試劑染色10 min，流水洗5 min，蘇木精染核2 min，流水沖洗10 min，常規(guī)脫水、透明、封片、拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示，采用Graph Pad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用one-way ANOVA和Duncantest檢驗方法，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 狀態(tài)觀察

注射STZ后，給予小鼠充足飼料及飲水，隔天更換墊料以保持環(huán)境清潔。STZ注射72 h后，單次大劑量注射組及多次小劑量注射組小鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿情況。STZ注射后第4周和第5周，單次大劑量組小鼠均死亡1只。到實驗結(jié)束時，單次大劑量組共死亡小鼠2只，而對照組和多次小劑量組無小鼠死亡。

2.2 小鼠體重變化

實驗期間，單次大劑量組小鼠體重緩慢增加，而多次小劑量組小鼠體重出現(xiàn)負(fù)增長，注射STZ 10周后多次小劑量組小鼠體重顯著低于對照組和單次大劑量組(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠建模前后體重的變化(±s)Figure 1 Change of body weight in each group before and after modeling

2.3 小鼠空腹血糖變化

注射STZ后，單次大劑量組空腹血糖迅速升高，在第4周達到峰值，且顯著高于陰對照組及多次小劑量組(P<0.001，P<0.05)，但此后呈逐漸降低的趨勢；多次小劑量組空腹血糖持續(xù)升高并保持穩(wěn)定在較高水平至實驗結(jié)束，在注射STZ后的第8~10周，多次小劑量組空腹血糖顯著高于單次大劑量組(P<0.01)，見圖2。

圖2 各組小鼠建模前后空腹血糖的變化(±s)Figure 2 Change of fasting blood glucose in each group before and after modeling

2.4 小鼠飲水量變化

注射STZ后，單次大劑量組小鼠飲水量迅速增加，在第4周后達到峰值，且顯著高于對照組及多次小劑量組(P<0.001，P<0.05)，隨后有所降低，但仍顯著高于正常對照(P<0.001)。注射STZ后多次小劑量組飲水量持續(xù)升高并保持穩(wěn)定至實驗結(jié)束，在第8~10周時，顯著高于單次大劑量組(P<0.01)，見圖3。

圖3 各組小鼠24 h飲水量的變化(±s)Figure 3 Change of water intake in each group

2.5 小鼠24 h尿蛋白變化

STZ注射后的第2、6周，與對照組相比，單次大劑量組和多次小劑量組的24 h尿蛋白含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，但造模組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第10周時，單次大劑量組24 h尿蛋白有所降低，且顯著低于多次小劑量組(P<0.001)，見圖4。

圖4 各組小鼠24 h尿蛋白的變化(±s)Figure 4 Change of 24 h urine protein in each group

2.6 各組小鼠血清TC、TG及LDL比較

STZ注射10周后，與正常對照組比較，多次小劑量組血清TC、TG及LDL水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。相較對照組，單次大劑量組血清TC及LDL水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，兩組間TG水平無顯著性差異(P>0.05)。多次小劑量組血清TG水平顯著高于單次大劑量組(P<0.001)，見表1。

表1 各組小鼠血清TC、TG及LDL水平比較(±s)Table 1 Comparion of serum TC，TG and LDL in each group

表1 各組小鼠血清TC、TG及LDL水平比較(±s)Table 1 Comparion of serum TC，TG and LDL in each group

注:與對照組相比，***P<0.001；與單次大劑量組相比，＃＃＃P<0.001。Note.Compared with the control group，***P<0.001.Compared with the single high-dose group，＃＃＃P<0.001.

組別Groups n甘油三酯(mmol/L)TG膽固醇(mmol/L)TC低密度脂蛋白(mmol/L)LDL對照組Control 12 3.54±0.08 1.12±0.06 1.25±0.04多次小劑量組Multiple low-dose 18 6.86±0.38*** 2.04±0.25***＃＃＃2.63±0.14***單次大劑量組Single high-dose 16 6.25±0.43*** 1.29±0.15 2.29±0.15***

2.7 各組小鼠血清腎功能及腎臟指數(shù)比較

STZ注射10周后，與正常對照組相比，多次小劑量組血清尿素氮、血清肌酐及腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.001)。與正常對照組相比，單次大劑量組血清尿素氮及腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.001，P<0.05)，血清肌酐無顯著性差異(P>0.05)。多次小劑量組血清肌酐及腎臟指數(shù)顯著高于單次大劑量組(P<0.001，P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠腎功能及腎臟指數(shù)比較(±s)Table 2 Comparion of kidney function and kidney index in each group

表2 各組小鼠腎功能及腎臟指數(shù)比較(±s)Table 2 Comparion of kidney function and kidney index in each group

注:與對照組相比，*P<0.05，***P<0.001；與單次大劑量組相比，＃＃P<0.01，＃＃＃P<0.001。Note.Compared with the control group， *P<0.05，***P<0.001.Compared with the single high-dose group，＃＃P<0.01，＃＃＃P<0.001.

組別Groups n血清尿素氮(mmol/L)BUN血清肌酐(mmol/L)Scr腎臟指數(shù)(%)KI對照組Control 12 21.19±0.85 19.95±3.01 1.20±0.04多次小劑量組Multiple low-dose 18 29.43±0.91*** 77.51±13.84***＃＃＃1.69±0.18***＃＃單次大劑量組Single high-dose 16 27.37±1.30*** 31.80±6.25 1.42±0.04*

2.8 各組小鼠腎病理的變化

為檢測小鼠腎中的還原糖水平，對各組小鼠的腎進行PAS染色。與對照組相比，兩種劑量組小鼠腎小球系膜細胞增生，系膜基質(zhì)增多，且腎小球著色明顯增多，還原糖水平顯著高于對照組(P<0.001)。兩種劑量組比較，發(fā)現(xiàn)多次小劑量組還原糖的累積顯著高于單次大劑量組(P<0.001)，表明多次小劑量組腎小球損傷更為顯著，見圖5。

圖5 各組小鼠腎形態(tài)變化(PAS)Figure 5 Histological observation of kidney tissues in each group

3 討論

目前DN動物模型的建立方法主要分為自發(fā)性模型[7]和誘發(fā)性模型[8]。自發(fā)性DN模型由于其存在遺傳因素作用，糖尿病腎病的產(chǎn)生與臨床患者更為相似，但是相較于普通誘導(dǎo)鼠類模型的獲得渠道更為狹窄，價格較高，制約了其在DN研究中的廣泛使用。誘發(fā)性DN模型采用腹腔或尾靜脈注射一定劑量STZ，從而特異性損傷胰島β細胞[9]，使胰島素分泌不足，模擬糖尿病的發(fā)生，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)喂養(yǎng)4~8周，可出現(xiàn)DN早期癥狀。脂代謝紊亂是DN重要危險因素之一，芝敏等[10]比較不同飲食結(jié)構(gòu)建立2型糖尿病腎病大鼠模型時發(fā)現(xiàn)，高糖高脂可導(dǎo)致糖尿病腎病大鼠更為明顯的高血壓和更加嚴(yán)重的微量白蛋白尿，且易導(dǎo)致腎小球硬化，病理損害相對較重。C57BL/6J小鼠是有腹部肥胖和2型糖尿病基因傾向的近交系小鼠，具有ob/ob遺傳背景，對脂肪誘導(dǎo)血糖升高較敏感[11－12]。因此，本研究以C57BL/6J小鼠作為研究對象，首先利用高糖高脂飲食誘導(dǎo)出胰島素抵抗，然后注射STZ引起β細胞受損并誘發(fā)形成糖尿病模型，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)喂養(yǎng)高脂高糖飼料，大大縮短了DN的造模時間。已有研究表明STZ的劑量與胰島的損傷程度呈明顯的正相關(guān)[13－14]，STZ劑量過大則小鼠易死亡[15]，劑量過小則成模率低[16]。本研究選擇150 mg/kg、50 mg/kg STZ分別進行單次大劑量腹腔注射及多次連續(xù)小劑量腹腔注射建立DN模型。結(jié)果顯示兩種處理方式均能使模型組小鼠出現(xiàn)尿量增多、飲水量增多，體重下降等糖尿病癥狀。單次大劑量組和多次小劑量組在STZ注射后的第4周空腹血糖分別為20.54 mmol/L和15.64 mmol/L，10周時血糖分別為13.75 mmol/L和18.30 mmol/L。這些結(jié)果說明單次大劑量STZ注射可使小鼠的血糖水平快速升高，但穩(wěn)定性較差，隨著實驗的進行，血糖水平會有所恢復(fù)；而多次小劑量STZ注射組小鼠的血糖水平升高緩慢，但持續(xù)上升，并一直維持在較高水平。

蛋白尿的出現(xiàn)是腎受累的明顯特征，表明了糖尿病的并發(fā)癥—糖尿病腎病的產(chǎn)生[17]。實驗中，對小鼠24 h尿蛋白量進行動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，注射STZ后，單次大劑量組24 h尿蛋白持續(xù)上升至第6周后開始下降，而多次小劑量組小鼠尿蛋白持續(xù)升高，在第10周多次小劑量組24 h尿蛋白顯著高于單次大劑量組。造模10周后，多次小劑量組血清肌酐水平及腎臟指數(shù)均高于單次大劑量組，表明多次小劑量組小鼠腎功能損傷更為顯著?；|(zhì)增生和間質(zhì)纖維化是糖尿病腎病進展的主要病理特征[18]。腎PAS染色顯示，單次大劑量組腎小球系膜輕度增生，細胞外基質(zhì)增多，改變不夠典型，而多次小劑量組組腎已出現(xiàn)典型病理改變:系膜區(qū)明顯擴張甚至彌漫性系膜硬化、系膜細胞增生及細胞外基質(zhì)顯著增多，腎小球、腎小管基底膜增厚。根據(jù)Mogensen對DN分期標(biāo)準(zhǔn)[19]，單次大劑量組小鼠至少到達DN的Ⅱ期，多次小劑量組小鼠達DN的Ⅲ期。上述結(jié)果表明，相比于單次大劑量注射STZ，多次小劑量注射STZ對C57BL/6J小鼠造成的腎損傷更為明顯。

綜上所述，實驗結(jié)果表明單次大劑量和多次小劑量注射STZ的方法均能誘發(fā)C57BL/6J小鼠DN。單次大劑量注射與多次小劑量注射方法相比，操作簡單，用藥量小，但對小鼠的毒性較大，死亡率較高，成模率較低，血糖水平波動幅度大，有些小鼠可逐漸恢復(fù)至正常血糖水平。多次小劑量連續(xù)注射STZ聯(lián)合高糖高脂飲食，小鼠死亡率低，血糖穩(wěn)定，腎病理改變典型，是理想的DN造模方法。