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    苦參堿介導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化逆轉(zhuǎn)肺癌A549順鉑耐藥株活性研究*

    2021-10-09 04:23:42吳軍莫紹雄韋懿桐馮志強梁俐
    醫(yī)藥導報 2021年10期
    關鍵詞:表型孵育空白對照

    吳軍,莫紹雄,韋懿桐,馮志強,梁俐

    (1.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院胸心血管外科,南寧 530023;2.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,南寧 530021)

    肺癌是人類最常見的惡性腫瘤,以順鉑(cisplatin,DDP)為代表的鉑類是肺癌化學治療(化療)最主要的藥物之一。然而部分患者對順鉑耐藥是肺癌化療失敗的主要原因。因此,尋求解決腫瘤化療耐藥的有效途徑,是目前腫瘤治療研究領域的熱點之一。苦參堿(matrine,MT)是豆科屬植物苦參的主要有效成分,能促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[1]。研究顯示MT具有腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用[2],然而MT逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥的作用機制目前仍未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在腫瘤細胞耐藥過程中起到非常關鍵作用,是腫瘤耐藥的一個新的重要機制[3]。本課題組已證實MT可以抑制腫瘤細胞 EMT[4]。然而,MT逆轉(zhuǎn)肺癌的耐藥性是否與其抑制肺癌細胞 EMT 相關,筆者目前尚未見相關報道。本研究旨在探討MT能否逆轉(zhuǎn)對DDP耐藥的肺癌A549/DDP細胞的耐藥性,以及是否通過抑制肺癌細胞EMT發(fā)揮作用,以期為肺癌治療提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1主要試劑 苦參堿(成都普思生物科技有限公司,批號:PS000536,含量≥98%);1640 培養(yǎng)基(美國 Gibco 公司,批號:31800-014);胎牛血清(美國 Hyclone公司,批號:SH30084.03);胰蛋白酶(上海碧云天公司,批號:C0203);細胞凋亡檢測試劑盒(萬類生物公司,批號:WLa001);全蛋白提取試劑盒(萬類生物公司,批號:WLA019);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(萬類生物公司,批號:WLA004);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(萬類生物公司,批號:WLA005);p-65 抗體、p-p65抗體、Slug 抗體、β-actin 抗體(萬類生物公司,批號:WL01273b,WL02169,WL01508,WL01372);噻唑藍(MTT,美國凱基公司,批號:KGA311);Transwell 小室(美國 Corning 公司,批號:3422);Cy3 標記山羊抗兔 IgG(上海碧云天公司,批號:A0516);FITC 標記山羊抗小鼠 IgG(上海碧云天公司,批號:A0568);E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)(英國 abcam 公司,批號:Ab1416,Ab92547)。

    1.2主要儀器 倒置顯微鏡(廈門麥克奧迪公司,型號:AE31);熒光顯微鏡(日本OLUMPUS公司,型號:DP73);流式細胞儀(美國艾森生物公司,型號:NovoCyte);全自動酶標儀(美國 BIOTEK 公司,型號:ELX-800);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司,型號:DH36001B);凝膠成像系統(tǒng)(北京六一公司,型號:WD-9413B);雙垂直蛋白電泳儀(北京六一公司,型號:DYCZ-24DN);電泳儀(北京六一公司,型號:DYY-7C);轉(zhuǎn)移槽(北京六一公司,型號:DYCZ-40D);超速冷凍離心機(湖南湘儀公司,型號:H-2050R)。

    1.3細胞培養(yǎng)及分組人肺腺癌耐順鉑細胞株 A549/DDP(中南大學細胞庫),A549/DDP細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中,于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至 70%時進行傳代。取對數(shù)生長期A549/DDP細胞,分為對照組、MT組、DDP組、MT+DDP組。對照組不做處理,MT組加入16 μmol·L-1MT,DDP組加入3×10-3μmol·L-1DDP,MT+DDP 組加入16 μmol·L-1MT及3×10-3μmol·L-1DDP,誘導 24 h 后用于后續(xù)實驗。

    1.4MTT 法檢測細胞活性 將處于對數(shù)生長期的 A549/DDP 細胞接種至 96孔培養(yǎng)板中,每孔約5×10-3個細胞,分為空白對照組、MT 組??瞻讓φ战M不做處理,MT 組分別加入1,4,16,32 μmol·L-1不同濃度 MT,于 5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后,去除培養(yǎng)基,細胞加入 MTT 50 μL,置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育 4 h,去除上清液,加入二甲亞砜(DMSO)150 μL,以溶解細胞形成的紫色結晶,在酶標儀上測定其在570 nm處吸光度(A)值,進行數(shù)據(jù)分析。細胞抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

    1.5細胞免疫熒光觀察EMT 標志物E-cadherin及vimentin 表達變化 取對數(shù)生長期的A549/DDP細胞,分為空白對照組及MT組??瞻讓φ战M不做處理,MT組加入16 μmol·L-1的MT干預 24 h。細胞爬片后固定于4%多聚甲醛15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS) 沖洗,滴加0.1% tritonX-100 至完全覆蓋細胞室溫孵育30 min,PBS沖洗,山羊血清孵育15 min后一抗孵育20 h,PBS沖洗,熒光二抗孵育60 min后 PBS 沖洗,滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以復染核,PBS 沖洗,滴加抗熒光淬滅劑于載玻片上,將爬片倒扣在滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上封片,于熒光顯微鏡下觀察染色結果。

    1.6倒置顯微鏡觀察MT 干預A549/DDP 前后的細胞形態(tài)變化 取對數(shù)生長期A549/DDP 細胞,分為空白對照組及 MT 組??瞻讓φ战M不做處理,MT 組加入16 μmol·L-1的 MT 干預 24 h。倒置顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)變化并攝像。

    1.7Transwell小室檢測MT干預A549/DDP前后的細胞侵襲能力變化 取對數(shù)生長期的 A549/DDP 細胞,分組同“1.6”項。取稀釋好Matrigel 基質(zhì)膠加入預冷的Transwell 小室中,37 ℃孵育 2 h,使其凝固。取各組細胞制成懸液,調(diào)整細胞密度后在 Transwell 小室上室加入用含0.1%胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)液稀釋的細胞懸液,下室加入含 20%胎牛血清的 DMEM 高糖完全培養(yǎng)基。稀釋好的Matrigel 基質(zhì)膠在小室中間,腫瘤細胞在含低營養(yǎng)液的上室,為了獲得更多營養(yǎng),腫瘤細胞會穿過 Matrigel 基質(zhì)膠進入含高營養(yǎng)液的下室。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后,以穿入下室的細胞為侵襲細胞。甲醇固定,0.1%結晶紫室溫下染色,在倒置顯微鏡攝像,計數(shù)移至微孔膜下層的細胞,每張膜隨機選取 5 個視野,每個視野細胞計數(shù) 3 次,求平均值,具體方法同文獻[5]。

    1.8Western blotting檢測EMT表型相關標記物蛋白表達變化 取對數(shù)生長期的 A549/DDP 細胞,分為空白對照組、MT 組、DDP 組、MT+DDP 組。空白對照組不做處理,MT 組加入16 μmol·L-1MT,DDP 組加入3×10-3μmol·L-1DDP,MT+DDP 組加入16 μmol·L-1MT及3×10-3μmol·L-1DDP,誘導 24 h 后用 Western blotting法進行蛋白檢測。裂解細胞,4 ℃離心,取上清液,收集蛋白樣品。用 BCA 蛋白定量試劑盒定量后,每孔加入總蛋白 35 μg進行SDS-PAGE。在 12% SDS-PAGE上分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜,5% 脫脂牛奶孵育 2 h,加E-cadherin(1:1000)、vimentin(1:1000),Slug(1:500)、p-p65(1:500)、p65 (1:500)及β-actin(1:1000)一抗 4 ℃ 過夜,洗膜后加熒光二抗(1:5000 稀釋)室溫孵育 2h,洗膜 3 次后,與電致化學發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL) 底物加強蛋白反應,將膠片進行掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer 軟件)分析目標條帶的吸光度(A)值。

    1.9流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的 A549/DDP 細胞,分組同 “1.8”。將細胞離心后收集,去除上清液,用PBS洗滌細胞,離心5 min 收集細胞,去除上清液,緩沖液500 μL重懸細胞。加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后,加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)10 μL,混勻。室溫避光孵育15 min 后進行流式檢測。真正意義上凋亡細胞應該是AnnexinV 表達,PI不表達,即圖片中右下象限這個數(shù)據(jù),這是早期凋亡,也是真正的凋亡;但實際情況中,通常把 AnnexinV 表達,PI 表達這一區(qū)域(即圖中右上象限這個數(shù)據(jù))也計算進去,此部分屬于晚期凋亡,細胞膜已經(jīng)開始破裂。因此,檢測數(shù)據(jù)圖中右上象限及右下象限細胞率總和來計算凋亡率。

    2 結果

    2.1MT對A549/DDP 細胞增殖的抑制作用 MTT 實驗結果見圖 1。MT 能明顯抑制 A549/DDP 細胞的增殖。與空白對照組比較,在 MT 作用于 A549/DDP 細胞24 h 后,MT 可呈濃度依賴性明顯抑制肺癌 A549/DDP 細胞生長。在 1,4,16,32 μmol·L-1MT 濃度,隨著 MT 濃度升高,細胞生長抑制率依次增高,呈濃度依賴性(P<0.05);而 32 μmol·L-1MT 的細胞生長抑制率與 16 μmol·L-1MT相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    ①與空白對照組比較,P<0.05。

    2.2MT對A549/DDP細胞形態(tài)及細胞侵襲能力的影響 結果見圖2??瞻讓φ战MA549/DDP細胞形態(tài)呈長梭形、細胞松散、有絲狀偽足的間質(zhì)樣細胞形態(tài)。MT干預處理后,A549/DDP細胞形態(tài)呈現(xiàn)卵圓形、排列緊密、絲狀偽足消失的上皮樣細胞形態(tài)。Transwell 小室實驗顯示,經(jīng) MT 作用后顯微鏡下每個視野細胞侵襲數(shù)目為(33±9),與空白對照組(55±19)比較,A549/DDP 細胞侵襲能力下降,差異有統(tǒng)計學意義(F=1.257,P<0.05)。

    A.空白對照組;B.MT 組。

    2.3MT對A549/DDP細胞EMT相關表型標記物的影響 細胞免疫熒光顯微鏡下觀察MT對A549/DDP細胞EMT上皮表型標記物E-cadherin及間質(zhì)表型標記物vimentin 的影響,結果見圖3??瞻讓φ战MA549/DDP細胞免疫熒光 E-cadherin(綠色熒光)減弱,vimentin(紅色熒光)增強,呈現(xiàn)EMT 表型。經(jīng)MT作用24 h 后,E-cadherin增強,vimentin 減弱,抑制 EMT 相關表型。

    A.E-cadherin;B.Vimentin;C.DAPI;D.Merge.

    2.4MT與DDP聯(lián)合作用對A549/DDP細胞E-cadherin、Vimentin、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Slug、NF-κB p-p65蛋白表達的影響 Western blotting實驗結果見圖 4。與空白對照組比較,MT組和MT+DDP組中E-cadherin蛋白表達明顯升高,而Vimentin、Slug及p-p65蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與MT組比較,MT+DDP組中E-cadherin蛋白表達明顯升高,而vimentin、Slug及p-p65蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而DDP組與空白對照組比較,E-cadherin、vimentin、Slug及p-p65蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    A.空白對照組;B.DDP 組;C.MT 組;D.MT+DDP 組;①與空白對照組比較,P<0.05;②與MT組比較,P<0.05。

    2.5MT與DDP聯(lián)合作用對A549/DDP細胞凋亡的影響 結果見圖 5。流式細胞實驗顯示,與空白對照組比較,MT 單獨作用于A549/DDP 24 h后誘導細胞凋亡,凋亡率明顯升高(F=3.77,P<0.05)。與空白對照組比較,MT聯(lián)合DDP作用于 A549/DDP細胞24 h后,凋亡率明顯升高(F=7.664,P<0.05)。與MT組比較,MT+DDP組細胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學意義(F=0.398,P<0.05)。而DDP組與空白對照組比較,細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    A.空白對照組;B.DDP 組;C.MT 組;D.MT+DDP組;①與空白對照組比較,P<0.05;②與MT組比較,P<0.05。

    3 討論

    肺癌是全球發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤,手術及化療是臨床治療肺癌的主要手段,而腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是化療失敗的主要原因。因此,低毒有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑具有重要臨床意義。MT是一種傳統(tǒng)中藥苦參提取物,可促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[6-7]。研究證實 MT 是有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑,然而其作用機制目前仍未完全闡明。目前有關MT 對肺癌A549/DDP耐藥性的影響,筆者尚未見報道。本研究旨在探討 MT 逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞耐藥性的作用及其可能機制。

    筆者先前研究結果發(fā)現(xiàn)苦參堿可以抑制結腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4],最近REN等[8]在乳腺癌細胞研究中也得到證實。EMT是指上皮細胞失去極性及基膜連接等上皮表型轉(zhuǎn)化成具有間質(zhì)表型的生物學過程。EMT發(fā)生后,排列緊密的上皮細胞失去極性,變成長梭形、排列分散的間質(zhì)細胞。上皮表型標志物E-鈣粘蛋白表達下調(diào),而間質(zhì)表型標志物N-cadherin、vimentin及轉(zhuǎn)錄因子slug、twist等表達上調(diào)[9]。腫瘤細胞在獲得性耐藥過程中產(chǎn)生間質(zhì)化的特征,而本身具有間質(zhì)化特征的腫瘤細胞也常具有原發(fā)性耐藥特征。在耐藥腫瘤細胞中可觀察到EMT 現(xiàn)象[10]。因此,對于化療耐藥的肺癌患者,EMT可能成為一種新的標記物和有效的治療靶點。

    本實驗發(fā)現(xiàn)MT可呈濃度依賴性提高細胞增殖抑制率,證實MT可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞的耐藥性。MT抑制細胞侵襲能力,并上調(diào)A549/DDP細胞上皮細胞表型標志物E-cadherin蛋白表達,及下調(diào)間質(zhì)表型標志物vimentin和slug表達,這表明MT可逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞的EMT。進一步研究發(fā)現(xiàn),MT單藥或與DDP聯(lián)用可明顯提高A549/DDP細胞凋亡率,證明MT

    可逆轉(zhuǎn)A549/DDP耐藥性且協(xié)同增強DDP的化療敏感性。哺乳動物的NF-κB信號通路是由 p65、p50/p105、p52/p100、c-Rel 及 RelB 5個成員組成的蛋白家族。NF-κB在靜息狀態(tài)下以非活化的二聚體形式(主要為p65/p50)與抑制蛋白-κB(inhibitor protein-κB,IκB)結合于胞質(zhì)中。當受到細胞外信號刺激時,IκB 被 Iκκ復合體磷酸化、泛素化,最后迅速降解,使 NF-κB二聚體中的 p65 亞基釋放并進入胞核磷酸化,從而發(fā)揮各種生物學功能[11-12]。因此,p65是否磷酸化是NF-κB信號通路是否活化的關鍵分子。激活NF-κB信號通路對于調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、存活、遷移、侵襲和EMT過程非常重要[13]。該信號通路參與轉(zhuǎn)化生長因子β誘導的 EMT和癌細胞的化療抵抗[14]。目前研究中,筆者還發(fā)現(xiàn) MT顯著抑制p-p65蛋白表達,逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞對 DDP的抵抗。通過本研究,不僅有助于進一步理解肺癌細胞對DDP耐藥的分子機制,而且為臨床提高DDP耐藥的肺癌患者療效,提供新的治療策略和理論依據(jù)。

    綜上所述,MT可以抑制肺癌耐順鉑細胞株A549/DDP的活性,其機制可能與抑制 EMT 及抑制NF-κB信號通路相關。但是,MT是否與其他EMT相關蛋白或耐藥相關分子之間存在直接的相互作用,還有待進一步研究。

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