微調(diào)3號方調(diào)控巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對HT－29細(xì)胞侵襲能力的影響*

趙璐，倪依群，尤建良

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無錫市中醫(yī)院，江蘇 無錫 214071

研究發(fā)現(xiàn)，長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)的腫瘤患者，機體會釋放大量腎上腺素（epinephrine，E）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、皮質(zhì)醇等激素至外周血中。其中，NE對機體免疫功能的影響已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，作為一種經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì)，NE可通過β－腎上腺素能（β－adrenergic receptor，β－AR）信號通路改變腫瘤的生物學(xué)行為和腫瘤所處的微環(huán)境，提高腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力［1］。而長期反復(fù)應(yīng)激會促使NE的釋放從而致使機體炎癥和免疫功能發(fā)生改變，甚而影響到個體健康狀態(tài)。無論是交感神經(jīng)釋放的NE，還是自身受到脂多糖刺激后分泌的NE，都使巨噬細(xì)胞處于一個富于NE的微環(huán)境中。而在腫瘤微環(huán)境中存在兩類生物學(xué)特征完全不同的巨噬細(xì)胞，一類為發(fā)生經(jīng)典極化（classical polarization）的M1型，另一類為替代極化（alternative polarization）的M2型，M2型巨噬細(xì)胞可抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)血管生成因子、金屬基質(zhì)蛋白酶、生長因子等的釋放，從而影響腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移［2］。

中藥復(fù)方制劑微調(diào)3號方（WD－3）為微調(diào)平衡理論的基本方［3］，我科前期大量的臨床及實驗研究證實，WD－3具有延長晚期腫瘤患者生存期，改善生存質(zhì)量及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［4－6］，但其作用機制尚不明確。本實驗將觀察NE和WD－3藥物血清對巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及其對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響，從而探討WD－3抗腫瘤轉(zhuǎn)移可能的作用機制。

1 材料

1.1 實驗細(xì)胞與動物人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（human monocyte leukemia cells，THP－1，細(xì)胞目錄號：TCHu 57）、人結(jié)腸癌細(xì)胞株（human colon cancer cell，HT－29，細(xì)胞目錄號：TCHu103），購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

SPF級健康雄性SD大鼠20只，6月齡，體質(zhì)量250～280 g，購自上海斯萊克實驗動物中心，許可證號：SCXK（滬）2012－0002，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。實驗方案經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬無錫市中醫(yī)院倫理委員會審查。

1.2 藥物與試劑微調(diào)3號方（WD－3）由黨參、茯苓、豬苓、薏苡仁、白術(shù)、陳皮、枇杷葉等組成，為無錫市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)液體制劑｛蘇食藥監(jiān)注［2005］401號，蘇藥制字204002111｝。RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Thermo Fisher Scientific公司，批 號：C22400500BT、11965092、R001100、10099141）；佛波酯（phorbol ester，PMA）、NE、青霉素－鏈霉素雙抗（美國Sigma－Aldrich公司，批號：P21120、A7257、V900929）；Anit－CD206抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs－4727RAPC）；Anti－CD64抗體、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）ELISA Kit（英國Abcam公司，批號：ab93500、ab133051）；人白介素10（Human interleukin 10，Human IL－10）ELISA試劑盒、Human IL－12 ELISA試劑盒（美國R＆D公司，批號：S1000B、S1200）；IL－4、戊巴比妥鈉、水合氯醛（德國Merck公司，批號：SRP3093、P11011、47335－U）；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer，PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號：P1020）；基質(zhì)膠（美國BD公司，批號：356234）；甲醇、結(jié)晶紫（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：YC－SJ06009、548－62－9）。

1.3 儀器7000型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Napco公司）；SC2－4A1型二級生物安全柜（新加坡ESCO公司）；5427R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司，離心半徑：8 cm）；CKX41型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；800TS型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；LSRⅡ型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；353097型Transwell培養(yǎng)板、657638型Transwell小室（美國BD Falcon公司）。

2 方法

2.1 WD－3含藥血清制備20只SD大鼠按隨機數(shù)字表分為對照組和藥物組，每組10只。藥物組大鼠每天灌胃給予WD－3溶液2 mL，每日2次，對照組大鼠給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥5天，且第5日晨間給予當(dāng)日一天劑量。末次給藥前禁食12 h，給藥2 h后，按2 mL·kg－1的劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，大鼠麻醉后腹主動脈采血。采血后，根據(jù)《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》，對大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉過量致死。血清靜置2 h后，5 000 rpm·min－1離心10 min分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22μm濾器過濾除菌并分裝，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實驗分組及M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化將THP－1細(xì)胞置于含10%FBS、2 g·L－1碳酸氫鈉、100 U·mL－1青霉素－鏈霉素雙抗的RPMI－1640培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105mL－1，接種于6孔板中，每孔加入含200 nmol·L－1PMA的培養(yǎng)液4 mL，培養(yǎng)48 h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。待巨噬細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)，將巨噬細(xì)胞分為A、B、C、D四組，A、B組分別采用10%空白血清培養(yǎng)基和10%WD－3藥物血清培養(yǎng)基處理48 h，C、D組預(yù)先采用含10μmol·L－1NE的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，再分別使用10%空白血清培養(yǎng)基和10%WD－3藥物血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。之后A、B、C、D每組分別加入含10μg·L－1IL－4的培養(yǎng)液4 mL處理24 h，將巨噬細(xì)胞進(jìn)一步誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞［7］。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞表面CD64、CD206的表達(dá)上述分組培養(yǎng)誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后PBS洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105mL－1，加入CD64－PE或CD206－PE抗體3μL，4℃避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型及比例。

2.4 ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL－10、IL－12及cAMP的含量嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組細(xì)胞上清液中IL－10、IL－12、cAMP的水平。

2.5 共培養(yǎng)體系的建立及Transwell侵襲實驗

取1 g·L－1基質(zhì)膠20μL鋪于Transwell小室底部，37℃培養(yǎng)箱靜置1 h，待基質(zhì)膠凝固。在12孔板中放入Transwell細(xì)胞共培養(yǎng)小室，0.41μm PVDF膜分隔上下室。下室分別加入5×104個M2型巨噬細(xì)胞（上述2.2項下方法所得），上室加入2×104個HT－29細(xì)胞，建立非接觸式共培養(yǎng)體系。培養(yǎng)48 h后取出上室，將上室沒有穿膜的細(xì)胞擦去，將Transwell小室置于甲醇溶液中固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色，置于倒置顯微鏡下統(tǒng)計未穿膜的細(xì)胞，每組隨機選擇5個視野進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較，符合正態(tài)分布和方差齊性時，采用單因素方差分析；方差不齊進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，方差齊后進(jìn)行單因素方差分析；若轉(zhuǎn)換后方差仍不齊，則采用Kruskal－Wallis非參數(shù)檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 WD－3含藥血清對巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD64及CD206的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與A組比較，C組表達(dá)CD64及CD206的細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05），提示NE可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化；與C組比較，WD－3藥物血清干預(yù)后的D組表達(dá)CD64及CD206的細(xì)胞百分比顯著下降（P＜0.05）。提示W(wǎng)D－3藥物血清可減弱NE促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型表型轉(zhuǎn)化的能力。見圖1、圖2。

圖1 不同藥物處理組CD64的表達(dá)情況

圖2 不同藥物處理組CD206的表達(dá)情況

3.2 WD－3含藥血清對M2型巨噬細(xì)胞分泌IL－10、IL－12的影響與A組比較，C組細(xì)胞上清液中IL－10水平顯著增加（P＜0.05），而B組細(xì)胞上清液中IL－12含量顯著升高（P＜0.05），提示NE能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，而WD－3可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型發(fā)生轉(zhuǎn)化。與C組比較，WD－3藥物血清對M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理后，D組細(xì)胞上清液中IL－10的水平明顯下降（P＜0.05），提示W(wǎng)D－3藥物血清可減弱NE促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞分泌IL－10、IL－12的情況

3.3 WD－3含藥血清對M2型巨噬細(xì)胞調(diào)控HT－29細(xì)胞侵襲能力的影響通過共培養(yǎng)體系的Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，與A組比較，C組HT－29細(xì)胞的侵襲能力顯著升高（P＜0.05）；與C組比較，D組HT－29細(xì)胞的侵襲能力則顯著減弱（P＜0.05）。提示M2型巨噬細(xì)胞能提高HT－29細(xì)胞的侵襲能力，而WD－3藥物血清能夠拮抗M2型巨噬細(xì)胞的這一作用。見圖4。

圖4 各組HT－29細(xì)胞侵襲能力

3.4 WD－3含藥血清對M2型巨噬細(xì)胞cAMP的影響與A組比較，C組細(xì)胞中cAMP含量顯著升高（P＜0.05）；與C組比較，D組細(xì)胞上清液中cAMP含量顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞cAMP表達(dá)情況 （±s）

表1 各組細(xì)胞cAMP表達(dá)情況 （±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05

組別 cAMP（ρ／ng·L－1） 組別 cAMP（ρ／ng·L－1）A *198.42±1.52 C 461.97±2.07 B △182.73±1.96 D 208.75±1.57

4 討論

在腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中，巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用。巨噬細(xì)胞廣泛分布于人體各個器官，是機體重要的一類表型可變、功能多樣的免疫細(xì)胞，易受不同微環(huán)境的影響被極化成功能不同的亞型。在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞占腫瘤間質(zhì)免疫細(xì)胞總數(shù)的50%以上，被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor－associated macrophage，TAM）。TAM是實體腫瘤間質(zhì)的主要組成部分，在腫瘤間質(zhì)中聚集，與腫瘤細(xì)胞分泌的大量趨化因子，如：巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M－CSF）、單核細(xì)胞趨化蛋白－1（monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1）、趨化因子CC基序配體3［chemokine（C－Cmotif）ligand 3，CCL3］、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素－2（angiopoietin－2，Ang－2）等相關(guān)［8－10］。TAM至少包括2種不同活化表型和功能特征的亞群，即M1型和M2型。其中M1型TAM主要由干擾素γ（interferon gamma，IFN－γ）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)，呈遞Ⅰ型免疫應(yīng)答，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成成員，通過分泌促炎性細(xì)胞因子，發(fā)揮殺菌和抗腫瘤作用。而M2型TAM則受腫瘤細(xì)胞或T細(xì)胞來源的IL－4、IL－13或糖皮質(zhì)激素以及其他免疫復(fù)合物誘導(dǎo)而成，表達(dá)CD64、CD206等特征性蛋白分子，產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子，促進(jìn)白細(xì)胞介素－10（interleukin－10、IL－10）的分泌，進(jìn)而降低機體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性。同時，M2型TAM能促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，從而有助于腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移［11－12］。由此可見，腫瘤微環(huán)境中不同類型的巨噬細(xì)胞從多方面廣泛參與腫瘤進(jìn)程，而M2型巨噬細(xì)胞主要具有抑制殺傷性T淋巴細(xì)胞的作用，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸以及對當(dāng)前治療的抵抗。在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，TAM均扮演重要的角色，因此，進(jìn)一步闡明腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互關(guān)系，找到其促癌及抑癌作用的平衡點，對提高腫瘤的臨床療效具有重要的意義［13－16］。

研究表明，慢性應(yīng)激可提高腫瘤組織和外周血交感神經(jīng)遞質(zhì)NE、E的水平，促進(jìn)模型動物腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［17－19］。腫瘤組織包括結(jié)腸癌組織有交感神經(jīng)分布，有β腎上腺素能受體表達(dá)，交感神經(jīng)末梢釋放的兒茶酚胺局部可達(dá)到微摩爾水平，滲入及腎上腺髓質(zhì)分泌入血的兒茶酚胺可達(dá)到納摩爾濃度［20－22］。

應(yīng)激相關(guān)激素NE對機體免疫功能的影響已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，長期反復(fù)應(yīng)激導(dǎo)致NE釋放從而致使機體炎癥和免疫功能發(fā)生改變，甚而影響到個體健康狀態(tài)，提示交感神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)間相互作用的緊密性和直接性。無論是交感神經(jīng)釋放NE，還是自身受到LPS刺激后分泌NE，巨噬細(xì)胞均處于一個富于NE的微環(huán)境［22］。

腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程也是腫瘤細(xì)胞與機體細(xì)胞相互作用的過程，當(dāng)人體中原位癌基因被激活或抑癌基因被抑制時，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在此過程中病人始終處于變動的不平衡狀態(tài)，表現(xiàn)為臟腑功能失調(diào)，氣血陰陽紊亂，津液運化失常，日久而成腫瘤。三焦為氣血津液運行通路，因中焦主化生氣血津液，所以位居三焦樞紐。中焦脾胃失調(diào)，則氣血運行不暢而生痰濕瘀血，氣血生化無源而正氣不足。因此，中焦脾胃在腫瘤的形成發(fā)展中具有重要的作用?；谝陨险J(rèn)識，趙景芳教授提出“微調(diào)平衡理論”，認(rèn)為腫瘤的治療應(yīng)立足中焦脾胃，顧護(hù)后天之本。不斷追蹤某一時期機體所處的不平衡狀態(tài)，找到內(nèi)在“失衡的關(guān)鍵點”，通過不斷調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)腫瘤與機體免疫，使其逐漸達(dá)到一個相對的平衡狀態(tài)。WD－3由黨參、茯苓、豬苓、薏苡仁、白術(shù)、陳皮、枇杷葉等組成，其中黨參、豬苓為君，健脾益氣；白術(shù)、茯苓健脾除濕，以助運化；薏苡仁助白術(shù)、茯苓健脾滲濕，益以半夏化痰濕、補脾氣；陳皮芳香健脾醒胃；佐以枇杷葉降逆和胃。全方重在微調(diào)中焦脾胃之氣，調(diào)氣以化瘀，改善機體高凝狀態(tài)而無腫瘤脫落擴散之虞；健脾以化濕，使痰濕生成無源而達(dá)正本源清之目的；健脾以扶正，發(fā)揮正氣固攝作用而抑制腫瘤擴散轉(zhuǎn)移。通過平衡陰陽氣血而調(diào)動機體自身的免疫功能，達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。我科前期研究發(fā)現(xiàn)，WD－3可顯著提高晚期腫瘤患者的生活質(zhì)量、延長生存期，目前已作為院內(nèi)制劑廣泛應(yīng)用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)，WD－3具有抑制小鼠S－180肉瘤生長的作用，抑瘤率達(dá)29%，與對照組比較有顯著性差異，并且能顯著提高細(xì)胞因子IL－2、IL－4、IFN－γ的水平，提示W(wǎng)D－3抗腫瘤轉(zhuǎn)移的可能機制在于調(diào)整機體的免疫狀態(tài)［23－25］。

M2型巨噬細(xì)胞可表達(dá)CD64、CD206等特征性蛋白分子，本實驗結(jié)果提示，將THP－1細(xì)胞進(jìn)行NE預(yù)處理后，再進(jìn)一步誘導(dǎo)分化，能顯著提高細(xì)胞CD64及CD206的表達(dá)，提示NE能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化［26－27］。而經(jīng)過WD－3藥物血清同時干預(yù)后，細(xì)胞CD64及CD206的表達(dá)均減少，提示W(wǎng)D－3能夠減弱NE調(diào)控巨噬細(xì)胞向M2型發(fā)生轉(zhuǎn)化的作用。本實驗同時發(fā)現(xiàn)，NE能夠促進(jìn)細(xì)胞分泌IL－10，但并未對IL－12產(chǎn)生影響，同樣說明NE能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型發(fā)生轉(zhuǎn)化，而WD－3能夠減弱NE的作用。進(jìn)一步建立結(jié)腸癌—巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，觀察M2型巨噬細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果顯示，在富集更多M2型巨噬細(xì)胞的條件下，HT－29侵襲能力得到進(jìn)一步提高，而WD－3藥物血清可以顯著減弱NE促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型發(fā)生轉(zhuǎn)化的作用，從而減弱HT－29細(xì)胞的侵襲能力。相關(guān)研究證明，NE通過激活β－AR，引起Ga蛋白介導(dǎo)的腺苷酸環(huán)化酶的活化，在該酶的作用下，ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，cAMP進(jìn)一步通過下游效應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動。本實驗同樣證實，NE可顯著提高細(xì)胞cAMP含量，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，WD－3能夠降低cAMP的生成。因此，WD－3是否通過β－AR信號通路發(fā)揮效應(yīng)值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，WD－3可抑制巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化，從而減弱結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29的侵襲能力。本結(jié)果將為進(jìn)一步研究WD－3抗腫瘤轉(zhuǎn)移機制提供基礎(chǔ)，為腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。