發(fā)酵魚(yú)醬酸產(chǎn)GABA乳酸菌的分離篩選及發(fā)酵特性

劉 璐，吳江麗，楊金桃，唐忠月，曾雪峰*

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種由谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化谷氨酸合成的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1]，普遍分布于動(dòng)植物體內(nèi)。研究表明，GABA不僅具有降低神經(jīng)元性、防止神經(jīng)細(xì)胞過(guò)熱的作用，還具有防止動(dòng)脈硬化、調(diào)節(jié)心律失常、降低血脂、增強(qiáng)肝功能等生理功效[2-4]。隨著年齡的增長(zhǎng)和精神壓力不斷變大會(huì)影響人體內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)化為GBAB，并且當(dāng)人體缺乏GABA時(shí)，會(huì)出現(xiàn)焦躁、失眠、疲勞等癥狀，而通過(guò)日常飲食攝入GABA是補(bǔ)充該功效物質(zhì)的一種有效方式，因此GABA的大規(guī)模生產(chǎn)及其作為生物活性食品成分在現(xiàn)代食品工業(yè)中的應(yīng)用成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來(lái)，一些安全性高的微生物，如乳酸菌[5]、酵母菌[6]、曲霉菌[7]被用于發(fā)酵合成GABA。而利用微生物中GAD脫羧形成GABA，具有成本低、富集含量高、安全性高的優(yōu)點(diǎn)[8]。

乳酸菌是動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，對(duì)人體安全有利[9]，被認(rèn)為是食品和藥品行業(yè)合成GABA的首選對(duì)象。傳統(tǒng)酸性發(fā)酵食品是產(chǎn)GABA乳酸菌重要的分離來(lái)源，許多研究表明乳酸菌具有GAD活性，可以催化谷氨酸脫羧產(chǎn)生GABA。很多研究者從泡菜、酸奶、干酪等發(fā)酵食品中分離出大量產(chǎn)GABA的植物乳桿菌[10-12]、短乳桿菌[13]、副干酪乳桿菌[14]、乳酸乳球菌[15]、布氏乳桿菌[16]等多種乳酸菌。Min等[17]從韓國(guó)泡菜中分離出一株高產(chǎn)GABA的短乳桿菌Lactbacillus brevis，因其較高的GABA產(chǎn)量，較好的環(huán)境適應(yīng)性等特點(diǎn)，可作為發(fā)酵食品的潛在發(fā)酵劑進(jìn)行應(yīng)用。Di等[18]從干酪中分離出一株高產(chǎn)GABA的植物乳桿菌Lactbacillus plantarum，可用于生產(chǎn)功能性飲料或作為護(hù)膚品研發(fā)的新用途。Su等[19]從發(fā)酵水產(chǎn)品中分離出來(lái)的產(chǎn)GABA香腸乳桿菌Lactbacillus farciminis，會(huì)對(duì)發(fā)酵魚(yú)產(chǎn)品中GABA積累有影響，可能有助于提高傳統(tǒng)發(fā)酵漁業(yè)產(chǎn)品的健康效益和商業(yè)價(jià)值。

魚(yú)醬酸是我國(guó)黔東南地區(qū)極具苗族原生態(tài)飲食文化特色的發(fā)酵調(diào)味品[20]，其利用自身攜帶或環(huán)境中的微生物在自然條件下發(fā)酵而成，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、酸香濃郁、色澤鮮亮等特點(diǎn)。魚(yú)醬酸中蘊(yùn)含種類(lèi)繁多、數(shù)量豐富、且具有較好發(fā)酵性能的乳酸菌，而酸性環(huán)境、富含底物谷氨酸為乳酸菌合成GABA提供了有利條件。當(dāng)前關(guān)于魚(yú)醬酸中產(chǎn)GABA的乳酸菌的研究還鮮有報(bào)道，本研究以魚(yú)醬酸作為原料，篩選出發(fā)酵特性和益生效果較好、產(chǎn)GABA量高的乳酸菌用于魚(yú)醬酸接種發(fā)酵，以此改進(jìn)傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，提升產(chǎn)品品質(zhì)，以期為實(shí)現(xiàn)富含GABA的魚(yú)醬酸產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)鱗小泥鰍、二荊條紅辣椒、生姜、食鹽、白酒市購(gòu)。

MRS液體培養(yǎng)基 青島海博生物公司；L-谷氨酸、L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、GABA標(biāo)準(zhǔn)品、豬膽鹽、賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸、RNA酶、溶菌酶 北京索萊寶科技有限公司；茚三酮 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四硼酸鈉 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；次氯酸鈉、溴甲酚紫 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖 美國(guó)Biowest公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XSS-2電子顯微鏡 奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物技術(shù)有限公司；SW-CJ-10超凈工作臺(tái) 蘇州凈化有限公司；PHS-3E pH計(jì)、L5S紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；A300梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；GIS-630凝膠成像儀 杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備工藝流程

樣品制備工藝流程如下：

1.3.2 魚(yú)醬酸中優(yōu)勢(shì)乳酸菌初步鑒定

從發(fā)酵的魚(yú)醬酸中取第1、3、5、9、15、21、30天樣品，制成樣液；依次進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)坎己笥?7 ℃培養(yǎng)48 h。每個(gè)平板隨機(jī)挑取5 個(gè)單菌落，進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，至菌株純化[21-22]。觀察分離純化后的菌株菌落形態(tài)，進(jìn)行革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)完成對(duì)疑似乳酸菌菌株的初步鑒定。

1.3.3 產(chǎn)GABA菌株定性定量分析

L-谷氨酸液體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入10 g/L的L-谷氨酸，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)液：取活化兩代后的菌株菌液，接3%（V/V）于L-谷氨酸液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，備用。

薄層色譜法：取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，離心（16 000×g、15 min），取上清液。用毛細(xì)管取適量發(fā)酵上清液點(diǎn)于G型硅膠薄層板上。以正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶3，V/V）配制展開(kāi)劑，添加0.4%茚三酮，做密閉上行展開(kāi)，經(jīng)90 ℃顯色15 min。同時(shí)以L(fǎng)-谷氨酸液體培養(yǎng)基、1 g/L GABA標(biāo)準(zhǔn)液、1 g/LL-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液作為對(duì)照。

Berthelot比色法：參考肖君榮[23]的方法，取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL，離心（16 000×g、15 min），取上清液600 μL，加入0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖液2 mL，6%苯酚溶液800 μL（V/V），混勻，再加入10%次氯酸鈉溶液900 μL，振蕩混勻，沸水浴10 min后，冰浴20 min，待出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入60%乙醇溶液4 mL，振蕩均勻，靜置后于645 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

1.3.4 產(chǎn)GABA菌株鑒定

生理生化指標(biāo)：進(jìn)行產(chǎn)黏性、葡萄糖產(chǎn)氣、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解、產(chǎn)硫化氫等實(shí)驗(yàn)。

16S rDNA擴(kuò)增：將明顯具有產(chǎn)GABA能力的試驗(yàn)菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，活化至兩代，對(duì)其進(jìn)行基因鑒定。按照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株的DNA，采用細(xì)菌通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×T5 Direct PCR Mix 12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 1.5 μL，ddH2O 9 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖電泳分析，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.3.5 耐酸性實(shí)驗(yàn)

參考Zeng Xuefeng等[24]的方法稍作修改。吸取0.5 mL活化菌液轉(zhuǎn)至裝有10 mL磷酸鹽緩沖液的試管中，滴加5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，以平板活菌數(shù)計(jì)數(shù)法測(cè)定存活菌數(shù)，按照下式計(jì)算菌株存活率：

1.3.6 耐膽鹽性實(shí)驗(yàn)

分別向MRS液體培養(yǎng)基中加入0.1%、0.2%、0.3%的豬膽鹽，再分別接入1%（V/V）的活化菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD值，以不加豬膽鹽的組作為對(duì)照。

1.3.7 氨基酸脫羧酶活性實(shí)驗(yàn)

吸取100 μL活化的菌液接至加入1%過(guò)濾滅菌后的酪氨酸、精氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸溶液的MRS液體培養(yǎng)基中（含0.6 g/L溴甲酚紫作為指示劑），未加菌液的作為對(duì)照組，37 ℃培養(yǎng)3～7 d，觀察其顏色，培養(yǎng)基由黃色變?yōu)樽仙?，則為氨基酸脫羧酶陽(yáng)性。

1.3.8 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.3.8.1 菌液及發(fā)酵上清液的抑菌實(shí)驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定每株菌的抑菌性，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，將0.1 mL活化的指示菌菌液接入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，使用無(wú)菌鑷子在培養(yǎng)基上放置無(wú)菌的濾紙片（6 mm），吸取15 μL活化后的菌液點(diǎn)于無(wú)菌濾紙片上，平板置于4 ℃冰箱2 h，再經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并測(cè)量抑菌圈大小。參考胡彥新等[25]的方法并稍加改動(dòng)，對(duì)經(jīng)紙片瓊脂擴(kuò)散法已經(jīng)顯現(xiàn)出抑菌活性的菌株，其發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，同樣進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.3.8.2 排除過(guò)氧化氫抑菌作用實(shí)驗(yàn)

用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液至過(guò)氧化氫酶的最適作用pH 7.0；將發(fā)酵上清液用1 mol/L過(guò)氧化氫酶處理于37 ℃水浴1 h，最后調(diào)節(jié)回對(duì)照pH值，以未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小[25]。

1.3.8.3 排除有機(jī)酸抑菌作用實(shí)驗(yàn)

取發(fā)酵上清液，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH 6.0，進(jìn)行排除有機(jī)酸抑菌作用實(shí)驗(yàn)[25]。

1.3.8.4 蛋白酶敏感實(shí)驗(yàn)

將胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶分別加入發(fā)酵上清液中至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，利用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至各蛋白酶最適宜范圍：胰蛋白酶pH 7，胃蛋白酶pH 2，中性蛋白酶pH 7，37 ℃水浴2 h，調(diào)回上清液初始pH值，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小[25]。

1.3.9 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)、pH值及菌株產(chǎn)酸速率實(shí)驗(yàn)

分別以2%（V/V）的接種量將活化后的待測(cè)菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定其OD600nm和pH值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)和pH值變化曲線(xiàn)。將篩選出的產(chǎn)GABA菌株分別接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，以無(wú)菌MRS液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，測(cè)定其pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)醬酸中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的分離純化及初步鑒定結(jié)果

從發(fā)酵魚(yú)醬酸中分離純化得到387 株疑似乳酸菌，菌株的菌落形態(tài)呈現(xiàn)出透明、不透明、白色、乳白色，表面光滑較圓，表面較圓微隆起。鏡檢結(jié)果為短棒狀、桿狀、長(zhǎng)桿狀、球狀、鏈狀，符合乳桿菌、乳球菌的形態(tài)學(xué)特征。對(duì)分離出的387 株菌進(jìn)行革蘭氏染色、葡萄糖產(chǎn)酸、接觸酶實(shí)驗(yàn)。根據(jù)革蘭氏染色陽(yáng)性、可利用葡萄糖產(chǎn)酸、接觸酶陰性的結(jié)果，有117 株符合乳酸菌的生理生化特點(diǎn)，可初步判斷為乳酸菌。

2.2 產(chǎn)GABA菌株定性定量實(shí)驗(yàn)

將初篩得到的117 株菌接入L-谷氨酸液體培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵48 h，獲得105 株渾濁度高、生長(zhǎng)速率快的菌株，經(jīng)薄層色譜定性得到15 株具有明顯產(chǎn)GABA能力的菌株。如圖1所示，分別為Y113、Y123、Y133、Y64、Y271、Y273、Y63、Y278、Y272、Y274、Y61、Y341、Y343、Y346、Y279，將這15 株菌作為實(shí)驗(yàn)菌株。

圖1 部分菌株的發(fā)酵上清液薄層色譜圖Fig.1 TLC profiles of fermentation supernatants of selected bacterial strains

利用Berthelot比色法對(duì)篩選出的15 株產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行定量分析，由圖2可知：Y113、Y279及Y64產(chǎn)GABA的量較高，其質(zhì)量濃度分別為0.239、0.209、0.192 mg/mL，說(shuō)明魚(yú)醬酸中蘊(yùn)含具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌，其酸性環(huán)境及富含底物谷氨酸可以為合成GABA提供較好的條件。

圖2 15 株菌發(fā)酵48 h后GABA質(zhì)量濃度Fig.2 GABA production by 15 strains after fermentation for 48 h

2.3 產(chǎn)GABA菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1 生理生化鑒定

對(duì)15 株實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，菌株均不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，明膠液化實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，符合乳酸菌生理生化特征。

2.3.2 16 S rDNA擴(kuò)增和序列結(jié)果分析

對(duì)上述15 株產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。將16S rDNA基因序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，15 株實(shí)驗(yàn)菌與參考菌株同源性均在99%以上。如表1所示，共鑒定出4 個(gè)菌種。其中，11 株為植物乳桿菌，2 株為食竇魏斯氏菌，1 株為熊蜂魏斯氏菌，1 株為戊糖乳桿菌。同其他發(fā)酵產(chǎn)品類(lèi)似，魚(yú)醬酸發(fā)酵過(guò)程中除了存在能產(chǎn)GABA的植物乳桿菌，還存在能產(chǎn)GABA的魏斯氏菌，包括2 株食竇魏斯氏菌和1 株熊蜂魏斯氏菌。其中食竇魏斯氏菌Y113產(chǎn)GABA量較高于其他菌株，為0.239 mg/mL。Bao等[26]發(fā)現(xiàn)，接種食竇魏斯氏菌，同時(shí)添加低聚木糖作為益生元進(jìn)行豆?jié){發(fā)酵，能提高GABA的含量，但并未明確是否是食竇魏斯氏菌的作用使其含量增加。魏斯氏菌多存在于醬油、豆豉、泡菜、酸奶、奶酪、香腸等發(fā)酵產(chǎn)品中，目前多被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、微生物等領(lǐng)域，迄今為止有關(guān)食竇魏斯氏菌合成GABA的研究鮮有報(bào)道。

圖3 15 株菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA genes from 15 strains

表1 15 株菌的16S rDNA鑒定結(jié)果Table 1 Results of 16S rDNA identification of 15 strains

2.4 耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

魚(yú)醬酸發(fā)酵過(guò)程中由于各種微生物產(chǎn)生有機(jī)酸，使其體系的pH值逐漸降低。用于接菌發(fā)酵的菌株應(yīng)具備較好的耐酸性，既能在酸性體系內(nèi)展現(xiàn)其發(fā)酵特性，又能承受人體胃部的低酸性環(huán)境發(fā)揮其益生性。由表2可以看出，具有產(chǎn)GABA能力的15 株乳酸菌，耐酸性各不同，但均能在pH 2.5條件下存活，這表明在低酸性環(huán)境下也有較好的生長(zhǎng)活力。其中Y113、Y123、Y133這3 株魏斯氏乳酸菌的耐酸能力低于其他菌株，這可能與其適宜在pH 3.0～9.5范圍內(nèi)生長(zhǎng)有關(guān)[27]。此外，植物乳桿菌在魚(yú)醬酸發(fā)酵后期逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種，快速產(chǎn)酸縮短發(fā)酵周期，其較強(qiáng)的耐酸能力可能是多種耐酸機(jī)制共同作用的結(jié)果，如中和過(guò)程、生物膜和細(xì)胞密度、質(zhì)子泵、保護(hù)和修復(fù)細(xì)胞大分子、前期適應(yīng)和交叉保護(hù)使用保護(hù)物質(zhì)等[28]。

表2 15 株菌在pH 2.5培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h后的存活情況Table 2 Survival of 15 strains after cultured pH 2.5 medium for 3 h

2.5 耐膽鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

小腸內(nèi)膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.3%左右，一般食物通過(guò)需要1～4 h，因此作為接種發(fā)酵的菌株應(yīng)具備一定的耐膽鹽性，能在通過(guò)小腸時(shí)仍然保持活力發(fā)揮益生作用。有學(xué)者對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中的乳酸菌進(jìn)行膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大部分乳酸菌能夠耐受0.2%～0.4%的膽鹽，有些菌的膽鹽耐受性更高[29-30]。由圖4可以看出，15 株具有產(chǎn)GABA能力的乳酸菌在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后仍顯示出較好的耐膽鹽能力。其中，Y113、Y64、Y271、Y272、Y279顯示出較強(qiáng)的耐受能力。高濃度的膽汁可溶解磷脂，破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，引起裂解、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)丟失、葡萄糖攝取喪失和細(xì)胞死亡，除此之外，還會(huì)引起蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、DNA和RNA氧化損傷以及細(xì)胞內(nèi)酸化。由于膽汁和膽鹽產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)的復(fù)雜性，微生物膽鹽耐受性就需要不同的耐受機(jī)制，包括外排泵的存在、膽鹽水解酶的數(shù)量、細(xì)胞維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的內(nèi)在能力以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和組成的改變[31]。乳酸菌較強(qiáng)的耐膽鹽性可能與其菌體中脂肪酸的構(gòu)成相關(guān)，飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比例高有利于菌株在含膽鹽的環(huán)境中維持細(xì)胞的完整性[32]。同時(shí)，乳酸菌在膽鹽存在環(huán)境中可以分泌膽鹽水解酶來(lái)降低膽鹽對(duì)自身細(xì)胞的危害。

圖4 15 株菌在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的OD600 nm值Fig.4 OD600 nm measured for 15 strains cultured in medium with different concentrations of bile salts for 24 h

2.6 氨基酸脫羧酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

生物胺廣泛存在于人體、動(dòng)物、植物、微生物體內(nèi)以及人類(lèi)日常食品中，但是生物胺總量超過(guò)危害值時(shí)會(huì)引起中毒現(xiàn)象。發(fā)酵魚(yú)制品的加工滿(mǎn)足生物胺形成的幾個(gè)條件[33]：大量游離氨基酸、具有氨基酸脫羧酶活性的微生物、適合具有脫羧酶活性及脫羧酶合成的微生物的生長(zhǎng)環(huán)境。游離氨基酸在發(fā)酵過(guò)程中易被微生物產(chǎn)生的特定脫羧酶脫羧形成生物胺，而氨基酸脫羧酶呈陰性的菌株則能夠很大程度降低發(fā)酵制品中生物胺的含量，提高產(chǎn)品的安全性。15 株產(chǎn)GABA乳酸菌中，均未出現(xiàn)培養(yǎng)基變?yōu)樽仙默F(xiàn)象，說(shuō)明菌株不具備氨基酸脫羧酶活性，無(wú)法促進(jìn)生物胺的形成。將其用于接菌發(fā)酵，既能改進(jìn)魚(yú)醬酸發(fā)酵工藝，又可保障魚(yú)醬酸的安全性。

2.7 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

存在于傳統(tǒng)發(fā)酵制品的乳酸菌可以產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)，如細(xì)菌素。細(xì)菌素是一類(lèi)新型天然防腐劑，它是由某些細(xì)菌在代謝過(guò)程通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的分泌在胞外的一類(lèi)具有抑菌活性的多肽或前體多肽[34-35]。乳酸菌作為細(xì)菌素的主要產(chǎn)生菌株，可應(yīng)用于接菌發(fā)酵或作為抑菌劑加入到食品中產(chǎn)生作用。如表3所示，15 株菌的菌液顯示出明顯的抑菌作用，很有可能是由于菌液中存在微生物競(jìng)爭(zhēng)、過(guò)氧化氫或有機(jī)酸。為排除菌體或其代謝產(chǎn)物引起的抑菌作用，將離心所得上清液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，排除有機(jī)酸、過(guò)氧化氫的抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示Y113、Y123、Y133未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，而其他菌株仍然具有抑菌性，這說(shuō)明具有抑菌性的菌株可能是在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生了其他的抑菌物質(zhì)。為進(jìn)一步確定產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是否具有蛋白質(zhì)性質(zhì)，使用胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行處理。結(jié)果顯示其余12 株具有抑菌性的菌株，對(duì)蛋白酶較敏感，其發(fā)酵上清液基本無(wú)抑菌效果。這表明12 株菌可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)類(lèi)的抑菌物質(zhì)，若用于接菌發(fā)酵，可提升產(chǎn)品的安全性，但仍需對(duì)這些蛋白質(zhì)類(lèi)的抑菌物質(zhì)作進(jìn)一步的研究。

表3 15 株菌的抑菌性Table 3 Antibacterial activity of 15 strains

2.8 基于PCA的多變量分析

采用基于PCA的多變量分析對(duì)不同分離菌株的數(shù)據(jù)進(jìn)行技術(shù)表征，以合成GABA的量、耐酸性、耐膽鹽性、氨基酸脫羧酶活性、抑菌性為指標(biāo)。如圖5所示，不同菌株在GABA含量及發(fā)酵特性上存在顯著差異。菌株Y64和菌株Y279在耐膽鹽性、耐酸性、抑菌性上表現(xiàn)較佳，同時(shí)有較高的GABA合成能力，又兼具較好的發(fā)酵性能。3 株魏斯氏菌中Y113在GABA合成能力上表現(xiàn)更佳，但在發(fā)酵性能上稍欠缺。因此，選擇菌株Y279、Y64和Y113進(jìn)行菌株生長(zhǎng)特性的研究。

圖5 利用PCA篩選15 株菌中潛能菌株Fig.5 PCA plot for discrimination of 15 strains

2.9 生長(zhǎng)曲線(xiàn)、pH值及產(chǎn)酸速率實(shí)驗(yàn)

經(jīng)以上發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)，從15 株實(shí)驗(yàn)菌中得到一株耐酸、耐膽鹽、無(wú)氨基酸脫羧酶活性，產(chǎn)GABA量最高的食竇魏斯氏菌Y113及2 株耐酸、耐膽鹽、無(wú)氨基酸脫羧酶活性，具有較好的抑菌性、產(chǎn)GABA能力較好的植物乳桿菌Y64及Y279。對(duì)3 株產(chǎn)GABA乳酸菌進(jìn)行生長(zhǎng)曲線(xiàn)及pH值的測(cè)定，結(jié)果如圖6所示，3 株菌培養(yǎng)至第2小時(shí)后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，當(dāng)培養(yǎng)至第10小時(shí)后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，說(shuō)明3 株菌都能迅速達(dá)到適宜的活力，其中Y113在進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榇藭r(shí)的生長(zhǎng)條件、滲透環(huán)境或pH值不適宜菌株生長(zhǎng)，促使菌體發(fā)生自溶。pH值變化趨勢(shì)同生長(zhǎng)曲線(xiàn)的趨勢(shì)基本吻合，3 株菌在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后pH值迅速降低，其中2 株植物乳桿菌Y64和Y279呈現(xiàn)出快速產(chǎn)酸的能力。

圖6 3 株菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（A）和pH值（B）Fig.6 Growth curves (A) and acid production curves (B) of three selected strains

用于接種發(fā)酵的菌株應(yīng)具有較好的產(chǎn)酸能力，乳酸菌利用碳水化合物快速發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸和抑菌物質(zhì)，這樣既可在發(fā)酵過(guò)程中抑制其他有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，又可縮短發(fā)酵周期，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及色澤風(fēng)味的形成。以菌株培養(yǎng)36 h內(nèi)的產(chǎn)酸情況作為評(píng)價(jià)菌株產(chǎn)酸速率的指標(biāo)，3 株菌株在37 ℃、36 h內(nèi)的產(chǎn)酸速率如圖7所示，Y113、Y64及Y279快速產(chǎn)酸，使所在體系pH值迅速下降。植物乳桿菌具有更高的產(chǎn)酸速率，3 株菌比較，Y113、Y64、Y279在第36小時(shí)的pH值分別為4.23、3.84和3.79。從pH值下降的趨勢(shì)也可以看出，植物乳桿菌產(chǎn)酸速率快于食竇魏斯氏菌，顯示出更快的產(chǎn)酸速率。因此，選用植物乳桿菌Y279或Y64進(jìn)行接種發(fā)酵，可以縮短發(fā)酵周期，保障產(chǎn)品的安全性。

圖7 3 株菌在36 h內(nèi)的產(chǎn)酸速率Fig.7 Acid-producing activity of three strains

3 結(jié) 論

魚(yú)醬酸蘊(yùn)含產(chǎn)GABA乳酸菌與它優(yōu)良品質(zhì)的形成之間有密切聯(lián)系，但此前并未對(duì)其產(chǎn)GABA乳酸菌進(jìn)行研究。本研究從發(fā)酵魚(yú)醬酸中篩選出117 株革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶陰性、可利用葡萄糖產(chǎn)酸的疑似乳酸菌。利用薄層色譜法及比色法對(duì)117 株疑似乳酸菌進(jìn)行定性定量，得到15 株具有明顯產(chǎn)GABA能力的菌株，經(jīng)過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)得出15 株產(chǎn)GABA菌株均不產(chǎn)黏性、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)H2S，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。對(duì)這15 株產(chǎn)GABA菌株進(jìn)行一系列發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)，得到一株產(chǎn)GABA量最高的食竇魏斯氏菌Y113及2 株發(fā)酵性能和益生效果優(yōu)良，產(chǎn)GABA量較高的植物乳桿菌Y279和Y64?；诰闥279在發(fā)酵性能、益生效果和產(chǎn)GABA能力上的表現(xiàn)較為優(yōu)秀，可將其用于魚(yú)醬酸進(jìn)行接種發(fā)酵。本研究為改善魚(yú)醬酸發(fā)酵工藝，篩選出可應(yīng)用于接種發(fā)酵的產(chǎn)GABA乳酸菌，對(duì)提升產(chǎn)品風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。