基于還原氧化石墨烯/碳納米管-納米金復(fù)合納米材料的阻抗型電化學(xué)適配體傳感器檢測銅綠假單胞菌

賈 飛，閆文杰，戴瑞彤，劉 毅，李興民,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是革蘭氏陰性菌，屬于假單胞菌屬，具有單級(jí)鞭毛[1]。銅綠假單胞菌是條件致病菌，可引起呼吸道以及泌尿系統(tǒng)感染，并且其耐藥力極強(qiáng)，因此該菌引起的感染是最常見的感染之一[2-4]。除了在飲用水中存在之外，銅綠假單胞菌還是肉品和水產(chǎn)品中最常見的腐敗菌，會(huì)造成食品的腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生惡臭氣味，同時(shí)也給食品安全帶來巨大隱患[5]。我國將銅綠假單胞菌列為致病菌，雖然在普通食品中不要求檢測，但是在飲用天然礦泉水中必須檢測[6]。GB 8538—2016《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》規(guī)定銅綠假單胞菌菌群指標(biāo)（同一批次產(chǎn)品采樣5 個(gè)、微生物指標(biāo)可接受水平限量值為0且不允許超出此限量值）[7]。美國、歐洲、加拿大和日本等國對飲用水中銅綠假單胞菌的限量標(biāo)準(zhǔn)為大腸菌群最可能數(shù)（most probable number，MPN）小于3 MPN/L，或每250 mL不得檢出[8]?？紤]到銅綠假單胞菌對食品安全的巨大威脅，建立快速靈敏可靠的檢測方法勢在必行。

目前，已經(jīng)有很多研究者開發(fā)銅綠假單胞菌的快速檢測新方法。Lee[9]和Lavenir[10]等分別建立基于實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）定量檢測水和環(huán)境中的銅綠假單胞菌的方法，二者分別以特征基因gyrB和exfX為目標(biāo)基因，通過設(shè)計(jì)不同引物實(shí)現(xiàn)定量擴(kuò)增并完成檢測。相比傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法，PCR檢測方法極大縮短檢測時(shí)間，并且檢測特異性好；Zhang Shuhong等[11]以銅綠假單胞菌的特征基因exfX為目標(biāo)，采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)進(jìn)行檢測，此方法雖然靈敏度高，但是容易出現(xiàn)假陽性，且操作繁瑣。Das等[12]采用電化學(xué)傳感器檢測水中的銅綠假單胞菌，其用適配體作為捕獲探針，通過引入酶促信號(hào)放大系統(tǒng)催化底物從而提升檢測靈敏度，在60 min的檢測時(shí)間內(nèi)，對目標(biāo)菌的檢出限達(dá)到60 CFU/mL；Yue Huan等[13]建立無標(biāo)記的電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescent，ECL）傳感器檢測銅綠假單胞菌的方法，其用噬菌體作為信號(hào)識(shí)別元件以結(jié)合目標(biāo)菌，用石墨烯修飾電極以提高靈敏度，在優(yōu)化條件中，該ECL傳感器對目標(biāo)菌的檢測線性范圍為1.4×102～1.4×106CFU/mL，檢出限為56 CFU/mL，此方法方便、快速，但是檢測靈敏度需進(jìn)一步優(yōu)化。除此之外，Cámara-Martos等[14]也建立近紅外快速檢測食品中銅綠假單胞菌的方法，該方法操作簡便，但是檢測假陽性高，且易受其他微生物的干擾。Yilmaz等[15]研究拉曼技術(shù)在銅綠假單胞菌檢測中的應(yīng)用，該方法靈敏度高，但也存在檢測特異性不足的問題。因此，建立靈單細(xì)胞水平、敏度高、特異性好、操作簡單的快速檢測銅綠假單胞方法，具有重要意義。

電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）技術(shù)是超靈敏的電化學(xué)分析手段，其機(jī)理是在電化學(xué)系統(tǒng)中，通過對界面施加一個(gè)頻率不同的小振幅正弦波進(jìn)行微干擾，然后測得的交流電勢與電流的比值為阻抗[16]。作為一種“準(zhǔn)穩(wěn)態(tài)”方法，EIS研究電極表面的暫時(shí)動(dòng)力學(xué)特征，擾動(dòng)信號(hào)不會(huì)導(dǎo)致電極表面極化現(xiàn)象，因而此方法對檢測樣品無損。相比于安培型傳感器，EIS的靈敏度更高，檢測穩(wěn)定性也更強(qiáng)[17-18]。因此，基于阻抗滴定的生物傳感器檢測法具有快速、超靈敏、無需引入標(biāo)記物、不損傷樣品等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)用于食品安全快速檢測中[19-21]。

本實(shí)驗(yàn)采用高靈敏度EIS技術(shù)結(jié)合納米材料優(yōu)異的導(dǎo)電特性設(shè)計(jì)阻抗型適配體傳感器，并以食品中常見的銅綠假單胞菌為目標(biāo)展開超靈敏檢測。首先自主合成還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）/碳納米管（carbon nano-tube，CNT）-納米金（gold nanoparticles，AuNPs）復(fù)合納米材料并將其固定在電極表面。隨后，通過設(shè)計(jì)一段能夠特異性結(jié)合銅綠假單胞菌的適配體序列，采用金硫鍵將一端巰基化的適配體結(jié)合到電極表面，構(gòu)建能特異性捕獲目標(biāo)菌的工作電極。當(dāng)與目標(biāo)菌孵育之后，細(xì)菌被固定在電極表面，導(dǎo)致電流傳輸被抑制，阻值明顯增大，根據(jù)電阻變化值以實(shí)現(xiàn)對銅綠假單胞菌的定量檢測。由于rGO/CNT-AuNPs復(fù)合納米材料優(yōu)異的電子傳輸性能，本實(shí)驗(yàn)的檢測能力明顯優(yōu)于其他快速檢測方法。相比于常見的電化學(xué)傳感器，本實(shí)驗(yàn)制備的傳感器無需引入標(biāo)記物，操作簡便，檢測模式直接，能檢測銅綠假單胞菌，可通過更換適配體的方式快速、靈敏檢測其他食源性致病菌或有毒有害物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉 市購。

銅綠假單胞菌ATCC 27853、沙門氏菌ATCC 14028、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌ATCC 25922、副溶血性弧菌ATCC 17802 上海復(fù)祥生物科技有限公司。巰基化核酸適配體序列：5’-SH-CCCCCGTTGCTTTCGCT TTTCCTTTCGCTTTTGTTCGTTTCGTCCCTGCTTCCTTT CTTG-3’由生工生物工程（上海）股份有限公司合成[22]。本實(shí)驗(yàn)室保藏于-20 ℃保存以上材料。

氯金酸、牛血清白蛋白（純度均大于等于98%）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、石墨粉 美國Sigma公司；瓊脂、蛋白胨、酵母浸膏、濃硫酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；多壁碳納米管 南京先豐納米材料科技有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純。本實(shí)驗(yàn)所用的水均是電阻率為18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E電化學(xué)工作站 上海辰華儀器有限公司；Tecnai G20透射電子顯微鏡、Super-Nuova加熱磁力攪拌器 美國賽默飛世爾科技公司；Nova Nano SEM掃描電子顯微鏡 美國FEI科技公司；5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國艾本德儀器有限公司；AR2140電子天平美國新澤西奧豪斯儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；THZ-22臺(tái)式恒溫振蕩器 江蘇太倉華大實(shí)驗(yàn)儀器科技有限公司；Direct-Q?3超純水系統(tǒng) 美國Milipore公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；AirT超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；WH-861旋渦混合器 北京華利達(dá)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

阻抗型電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)建流程和檢測銅綠假單胞菌的機(jī)理如圖1所示。首先采用電化學(xué)沉積的方法將GO/CNT復(fù)合納米材料修飾到電極表面，用電化學(xué)還原的方法將GO還原為rGO。相比于包含大量含氧雜環(huán)官能團(tuán)的GO，rGO有更優(yōu)異的電子傳輸性能，可提升檢測靈敏度[23]；隨后，再次用電化學(xué)沉積的方法將一層AuNPs材料修飾在電極表面，形成最終的rGO/CNT-AuNPs復(fù)合納米材料，AuNPs能提升電流傳輸速度，進(jìn)而提高系統(tǒng)中電流的信號(hào)響應(yīng)速度，因此信號(hào)強(qiáng)度增大，檢測靈敏度更理想，且AuNPs較大的比表面積為適配體的結(jié)合提供位點(diǎn)，可負(fù)載更多捕獲探針[24-26]；此外，本實(shí)驗(yàn)將能特異性捕獲銅綠假單胞菌的適配體一端修飾巰基，這樣適配體可通過金硫鍵共價(jià)結(jié)合到電極表面，得到適配體修飾的rGO/CNT-AuNPs工作電極。當(dāng)與目標(biāo)菌孵育后，適配體會(huì)特異性將細(xì)胞捕獲到電極表面，細(xì)菌阻礙電流傳輸，引起阻值增大。細(xì)菌濃度升高，被捕獲到電極表面的細(xì)菌數(shù)量也變大，阻值的變化幅度會(huì)增大，根據(jù)EIS法測得電阻變化值以實(shí)現(xiàn)對銅綠假單胞菌的定量檢測。

圖1 電化學(xué)適配體傳感器檢測銅綠假單胞菌的設(shè)計(jì)原理圖Fig.1 Schematic illustration of the electrochemical aptasensor for detecting P.aeruginosa

1.3.2 菌種的活化與處理

配制pH值為7.4的LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉質(zhì)量濃度分別為10、5、10 g/L）并高壓滅菌處理，將銅綠假單胞菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，副溶血性弧菌則接種于pH 8.5且含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%氯化鈉的堿性蛋白胨溶液（蛋白胨、氯化鈉質(zhì)量濃度分別為10、30 g/L）中培養(yǎng)。置于37 ℃振蕩培養(yǎng)活化增菌，隨后將菌液置于4 ℃、3 000 r/min離心5 min，留沉淀去除上清液后，用0.1 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）清洗3 遍以去除殘余的培養(yǎng)基，用生理鹽水溶解，得到初始菌液。

在無菌條件用10 倍濃度梯度稀釋的方法將原始菌液制成1∶10的樣品，每次稀釋之后均充分振蕩混合。隨后吸取100 μL菌液注入LB固體平板培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉質(zhì)量濃度分別為10、5、10、15 g/L）上培養(yǎng)，副溶血性弧菌則接種于含3%氯化鈉的營養(yǎng)瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度做3 個(gè)平行。置于37 ℃培養(yǎng)并觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)選取菌落數(shù)在30～300之間的平板，并用菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示菌落總數(shù)。根據(jù)稀釋倍數(shù)和菌落個(gè)數(shù)即可計(jì)算初始菌液的濃度。

1.3.3 GO/CNT復(fù)合納米材料的制備

參考Hummers等[27]的方法并稍作修改。在冰水浴中加入33.5 mL濃硫酸，加入1.0 g的石墨粉和0.8 g硝酸鈉，再緩慢加入4.5 g高錳酸鉀并小心攪拌，控制反應(yīng)溫度10 ℃，攪拌反應(yīng)30 min。隨后升溫到35 ℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h。隨后加入50 mL超純水，以約5 ℃/min升溫至90 ℃并加入5 mL雙氧水以還原殘余的氧化劑，待溶液變?yōu)榱咙S色后用孔徑為0.22 μm的尼龍微孔濾膜濾去除溶劑。依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%鹽酸和去離子水洗滌3 遍，烘干后得到GO，并制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液，室溫存儲(chǔ)備用。

采用差速離心方法制備GO-CNT復(fù)合材料[28]。將1 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL GO溶液與1 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL的碳納米管（carbon nanotube，CNT）溶液混合，超聲處理2 h。先于4 ℃、8 000 r/min離心30 min，漏斗過濾以去除沉淀。再將上清液置于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，過濾留沉淀。將沉淀重溶于水中，后置于4 ℃、14 000 r/min離心30 min并重復(fù)3 次。待充分洗滌后，得到GO/CNT溶液，用于電沉積合成復(fù)合納米材料。

1.3.4 還原rGO/CNT-AuNPs工作電極的組裝

1.3.4.1 電極清洗

電極需用物理打磨和化學(xué)清洗的方式去除表面的雜質(zhì)，以保持電極之間的一致性。用鐵氰化鉀電解液驗(yàn)證電極被打磨干凈的程度，觀察循環(huán)伏安曲線相鄰2 段還原峰的電位差值，至65 mV附近時(shí)說明電極已經(jīng)充分清洗干凈，最后將電極氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

1.3.4.2 rGO/CNT-AuNPs工作電極制備

本實(shí)驗(yàn)選用玻碳電極為工作電極，銀/飽和氯化銀電極為參比電極，鉑絲電極為對電極的三電極體系。取5 mL按1.3.3節(jié)制備的GO/CNT溶液，在電化學(xué)工作站中，用電化學(xué)沉積的方法將其沉積在工作電極表面。沉積電位為1.6 V，沉積時(shí)間為15 min，得到表面修飾GO/CNT復(fù)合納米材料的工作電極。隨后將電極在5 mL濃度為0.1 mol/L的磷酸二氫鉀電化學(xué)還原液中用循環(huán)伏安法將GO還原，去除GO含氧雜官能團(tuán)，得rGO，還原參數(shù)為掃描速率0.1 V/s，掃描圈數(shù)為180 圈，得到rGO/CNT修飾的工作電極。

用電化學(xué)沉積的方法將納米金進(jìn)一步修飾在電極表面。取5 mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%氯化鉀的氯金酸溶液，在0.2 V恒電位沉積30 s，得到rGO/CNT-AuNPs復(fù)合納米材料修飾的工作電極。待電極晾干之后，取10 μL巰基化銅綠假單胞菌適配體小心滴加在電極表面，適配體依靠“金硫鍵”共價(jià)結(jié)合在電極表面，通風(fēng)晾干。為了避免納米金材料的非特異性吸附，用巰基乙醇封閉電極1 h，得到表面修飾適配體的rGO/CNT-AuNPs工作電極，并放置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4.3 電極表征

對制備電極的每一步用循環(huán)伏安法進(jìn)行表征，取5 mL含0.1 mol/L氯化鉀的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]（1∶1，m/m）電解液，在三電極體系中進(jìn)行循環(huán)伏安測量。參數(shù)設(shè)置：電壓范圍為-0.4～0.8 V，掃描速率100 mV/s。

1.3.5 銅綠假單胞菌檢測

用構(gòu)建的電化學(xué)傳感器檢測不同濃度的銅綠假單胞菌。首先將電極浸入1 mL濃度依次為10、102、103、104、105、106、107、108CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液中，在37 ℃振蕩孵育40 min。用超純水清洗后，用交流阻抗法測量響應(yīng)信號(hào)。EIS工作條件如下：電解液為0.1 mol/L KCl溶液的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]（1∶1，m/m）溶液，外加電壓為0.26 V，振幅為5 mV，電壓頻率變化范圍10-1～105Hz。

1.3.6 實(shí)際樣品的測定

1.3.6.1 雞肉樣品中的回收率測定

選用市售雞肉中銅綠假單胞菌為樣本，用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。在無菌環(huán)境中取25 g雞肉樣品，在滅菌乳缽內(nèi)用滅菌剪刀剪碎，隨后加入滅菌水225 mL，混合均質(zhì)10 min，過濾去除大分子顆粒和懸浮物，制得1∶10稀釋液。隨后加入不同濃度的銅綠假單胞菌，混勻后用1.3.5節(jié)方法進(jìn)行檢測。將快速檢測結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果比較，計(jì)算回收率，對構(gòu)建的銅綠假單胞菌電化學(xué)適配體傳感器進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)估。

1.3.6.2 飲用水中的回收率測定

飲用水取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，首先將1 mL水樣靜置30 min，過濾去除水中大分子顆粒。隨后4 ℃、14 000 r/min離心30 min，去除小分子懸浮顆粒，留上清液。隨后在上清液中加入不同濃度的銅綠假單胞菌，混勻后用進(jìn)行檢測。將快速檢測結(jié)果與平板計(jì)數(shù)的結(jié)果比較，計(jì)算回收率，對構(gòu)建的銅綠假單胞菌電化學(xué)適配體傳感器進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)估。

1.3.7 電阻變化值的計(jì)算

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集自CHI660E電化學(xué)工作站，以加入銅綠假單胞菌前后測得的電阻變化值ΔR展開數(shù)據(jù)分析，阻值由等效電路擬合得到，ΔR按下式計(jì)算：

式中：R0為制備工作電極在空白對照組中測得的適配體阻值/Ω；R1為工作電極和菌液充分孵育之后測得的銅綠假單胞菌適配體阻值/Ω。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 8.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。運(yùn)用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合納米材料的表征

采用透射電鏡和掃描電鏡對制備的材料、修飾后的電極進(jìn)行表征。圖2A中褶皺狀的薄層為GO的典型結(jié)構(gòu)，能看到GO底層很薄，證明GO層數(shù)很少，在水中分散性好、結(jié)構(gòu)完整，沒有過多的折疊結(jié)構(gòu)。其中互相折疊纏繞的管裝結(jié)構(gòu)為直徑約15 nm的碳納米管。電化學(xué)沉積納米金操作后的掃描電鏡圖如圖2B所示，電極表面覆蓋一層較厚的金層，電極明顯存在小范圍團(tuán)聚現(xiàn)象，粒徑約100 nm，尺寸較為統(tǒng)一，且分布均勻，這種表面結(jié)構(gòu)也為固定適配體提供良好且充足的負(fù)載位點(diǎn)。

圖2 復(fù)合納米材料的表征Fig.2 Characterization of the prepared nanomaterial

2.2 電極制備過程的電化學(xué)表征

用循環(huán)伏安法對電極制備的每一個(gè)步驟進(jìn)行表征。由圖3a線可知，典型循環(huán)伏安圖的一對可逆還原氧化峰，峰電流值為112 μA。將GO/CNT材料電化學(xué)沉積到電極表面之后，由于GO表面含有大量的羥基、羧基和環(huán)氧基等含氧基團(tuán)，其破壞石墨烯的共軛結(jié)構(gòu)，影響電子傳輸效率，同時(shí)GO占據(jù)電極表面的活性位點(diǎn)，會(huì)影響電解液中[Fe(CN)6]3-/4-向電極表面擴(kuò)散，因此造成峰電流值下降至95 μA；當(dāng)將材料電化學(xué)還原為rGO/CNT時(shí)，GO上的酚羥基環(huán)氧基團(tuán)被還原，并使石墨烯平面內(nèi)的碳原子重新排列，形成穩(wěn)定、重復(fù)的連續(xù)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致rGO的導(dǎo)電能力遠(yuǎn)強(qiáng)于GO[29]，因此峰電流值明顯上升至123 μA，比較b、c線也能證明GO被成功還原；d線峰電流值為150 μA，遠(yuǎn)高于裸電極和修飾rGO/CNT電極，這是AuNPs材料可增大電極表面的電活性面積，同時(shí)也能提升電流傳輸能力，起電化學(xué)信號(hào)放大的作用。最后在電極表面固定適配體，由于帶負(fù)電荷的堿基與[Fe(CN)6]3-/4-間存在的靜電排斥引起峰電流值略微下降。e線峰電流值為140 μA，相比d線下降10 μA，其表明銅綠假單胞菌適配體被成功固定到電極表面。

圖3 復(fù)合電極材料的循環(huán)伏安表征Fig.3 Cyclic voltammograms of different modified electrodes

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

對實(shí)驗(yàn)中加入的適配體濃度進(jìn)行優(yōu)化。首先制備好rGO/CNT-AuNPs復(fù)合納米材料修飾的工作電極，隨后將濃度分別為20、40、60、80、100 μmol/L巰基適配體溶液滴加在電極表面，晾干后封閉電極。隨后將電極置于濃度為106CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液中孵育40 min，并用空白組作對照。取出電極進(jìn)行ΔR測量，結(jié)果如圖4所示。隨適配體濃度的增大，ΔR呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢。當(dāng)適配體濃度從20 μmol/L上升至40 μmol/L時(shí)，ΔR從328 Ω上升至514 Ω，其原因?yàn)檫m配體濃度的增大，固定在電極表面的適配體總量隨之增多，能夠捕獲更多的目標(biāo)菌，從而引起阻值的上升。當(dāng)適配體濃度繼續(xù)增大至100 μmol/L時(shí)，ΔR的變化并不明顯，在60、80、100 μmol/L分別為526、528、534 Ω，其原因?yàn)?0 μmol/L濃度適配體與目標(biāo)菌的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和，在電極表面沒有剩余的結(jié)合位點(diǎn)供適配體結(jié)合，捕獲的目標(biāo)菌數(shù)量也達(dá)到穩(wěn)定，ΔR并未顯著變化。這也與電極表面納米金的修飾量有關(guān)。適配體通過金硫鍵固定在納米金修飾的工作電極表面，因此納米金的表面積決定修飾到電極表面的適配體的量，也間接決定電極表面銅綠假單胞菌的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量。因此，本實(shí)驗(yàn)中最適的適配體濃度為40 μmol/L。

圖4 適配體濃度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of aptamer concentration

孵育時(shí)間是影響檢測靈敏度和可靠性的條件之一。為優(yōu)化適配體捕獲探針與目標(biāo)菌孵育的時(shí)間，取濃度為105CFU/mL的銅綠假單胞菌菌液，與適配體修飾的工作電極孵育，置于在37 ℃恒溫振蕩，分別孵育10、20、30、40、50、60 min，隨后進(jìn)行電化學(xué)測量，結(jié)果如圖5所示。0～40 min范圍內(nèi)時(shí)，隨孵育時(shí)間的延長，ΔR明顯變大，從初始的80 Ω增大到351 Ω；而當(dāng)孵育時(shí)間在40～60 min范圍內(nèi)時(shí)，ΔR在360～363 Ω范圍內(nèi)變化不明顯，僅增大10 Ω，到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。孵育時(shí)間低于40 min時(shí)，隨孵育時(shí)間的延長，適配體慢慢依靠空間構(gòu)象和化學(xué)鍵與目標(biāo)菌結(jié)合，并將目標(biāo)菌固定在電極表面，并逐漸達(dá)到適配體-靶標(biāo)特異性結(jié)合的飽和狀態(tài)[30]。而孵育時(shí)間多于40 min時(shí)，幾乎沒有可供結(jié)合的位點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)最佳的孵育條件為37 ℃孵育40 min。

圖5 孵育時(shí)間優(yōu)化Fig.5 Optimization of incubation time

2.4 電化學(xué)檢測方法的建立

將制備電極與不同濃度的銅綠假單胞菌菌液在37 ℃孵育40 min后，將電極置于三電極體系中進(jìn)行電化學(xué)測量，結(jié)果如圖6所示，半圓的半徑長度與測得的阻值相關(guān)，其表示高頻段電子傳遞限制過程，而直線部分則為低頻溶液擴(kuò)散限制過程[31]。隨菌液濃度的增加，半圓部分的半徑越大，電極界面的阻值越高。

圖6 構(gòu)建的傳感器檢測不同濃度銅綠假單胞菌的阻抗響應(yīng)圖Fig.6 Nyquist plots obtained when detecting P.aeruginosa at different concentrations

用圖7等效電路進(jìn)行擬合，電極溶液接觸面形成雙層電容，Zw是由溶液中的電解質(zhì)離子向電極表面擴(kuò)散引起的Warburg阻抗，電極表面的電子傳遞電阻為需測定的阻值[32]。在最佳實(shí)驗(yàn)條件中，銅綠假單胞菌的濃度在10～106CFU/mL時(shí)，銅綠假單胞菌濃度和ΔR呈明顯線性關(guān)系，線性方程為Y=80.976 5X-39.141（自變量為lgC），相關(guān)系數(shù)為0.978 3，檢出限為4 CFU/mL（信噪比為3）。在制備好電極的情況中，只需40 min孵育時(shí)間和5 min電化學(xué)測量即可完成整個(gè)檢測，所需時(shí)間遠(yuǎn)小于常規(guī)檢測方法和基于分子生物學(xué)的檢測方法。

圖7 等效電路圖Fig.7 Equivalent circuit

如表1所示，GB 4789.2—2016《菌落總數(shù)測定》[33]中規(guī)定的平板計(jì)數(shù)法仍為微生物檢測普遍適用標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞檢測，但是該方法需繁瑣的增菌培養(yǎng)，且耗時(shí)很長（2～5 d）?；赑CR反應(yīng)的LAMP檢出限也達(dá)到15.7 CFU/mL，但是所需檢測時(shí)間仍超過10 h。其他生物傳感器檢測方法分別基于ECL、低場核磁共振以及EIS等不同原理，雖然檢測時(shí)間可縮短至5 h以內(nèi)，但是檢出限均大于50 CFU/mL。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的電化學(xué)傳感器在檢測時(shí)間（45 min）、檢出限（4 CFU/mL）上均具有明顯的優(yōu)勢。

表1 銅綠假單胞菌不同檢測方法比較Table 1 Comparison between the current method and other reported methods for P.aeruginosa detection

2.5 特異性和重復(fù)性分析

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建檢測方法的特異性取決于所用適配體對銅綠假單胞菌的特異性結(jié)合能力?？疾煸摲椒▽ΤＲ姷钠渌? 種食源性致病菌（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌）及混合樣品1（以上5 種菌的混合液）、混合樣品2（不含銅綠假單胞菌的以上4 種菌的混合液）的檢測結(jié)果的同時(shí)，用生理鹽水作為空白對照組。在最佳實(shí)驗(yàn)條件中，將制備表面修飾適配體的rGO/CNT-AuNPs工作電極與以上各組菌液孵育40 min后，測量ΔR。如圖8所示，在銅綠假單胞菌菌液和含有銅綠假單胞菌的混合菌液中，測得的ΔR約為350 Ω，而在其余不含有銅綠假單胞菌的陰性處理組中，該方法測得的ΔR均約為20 Ω或者更低，表明本方法能夠有效地特異性檢測銅綠假單胞菌。

圖8 構(gòu)建的電化學(xué)適配體傳感器的選擇性Fig.8 Selectivity of the developed electrochemical aptasensor

制備5 支相同的工作電極，并對濃度為105CFU/mL的銅綠假單胞菌溶液展開測量，計(jì)算5 組測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.2%，說明該方法制備的電極重復(fù)性良好。

2.6 實(shí)際樣品中銅綠假單胞菌的測定

將雞肉和飲用水樣品進(jìn)行前處理，隨后加入3 種不同濃度的銅綠假單胞菌。在最佳條件與電極孵育40 min后，進(jìn)行電化學(xué)測量，并用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算銅綠假單胞菌的濃度，同時(shí)用經(jīng)典的平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)并做比較。如表2所示，6 組實(shí)際樣品中回收率在92.9%～109.6%之間，表明本方法與平板計(jì)數(shù)法的檢測結(jié)果不存在顯著差異，證明本方法在實(shí)際樣品中可準(zhǔn)確、快速完成檢測。

表2 構(gòu)建阻抗型電化學(xué)傳感器在水樣和肉樣中的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（n=5）Table 2 Recoveries of P.aeruginosa in spiked water and chicken samples using the developed impedance biosensor (n = 5)

3 結(jié) 論

本研究合成rGO/CNT-AuNPs復(fù)合納米材料，并制備電化學(xué)傳感器檢測食品中銅綠假單胞菌。復(fù)合納米材料有理想的電化學(xué)性能，能大幅提高電子傳輸效率，提升檢測靈敏度和重復(fù)性。適配體與銅綠假單胞菌間結(jié)合的高親和力確保檢測的強(qiáng)特異性，通過適配體-靶標(biāo)特異性識(shí)別的結(jié)合方式，本方法對銅綠假單胞菌的檢測線性范圍為10～106CFU/mL，檢出限可達(dá)4 CFU/mL，為目前已知靈敏度最高的銅綠假單胞菌的快速檢測方法。本實(shí)驗(yàn)建立的方法快速、簡便，只需40 min孵育和5 min電化學(xué)測量即可完成整個(gè)檢測流程，非專業(yè)檢測人員也可通過簡單培訓(xùn)后完成檢測，為致病菌快速檢測提供靈敏、可靠的新手段。但電化學(xué)測試對環(huán)境要求較高，需在安靜的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，無法勝任現(xiàn)場快速檢測的要求。同時(shí)，本方法也存在無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測的弊端。本實(shí)驗(yàn)為開發(fā)性能更加優(yōu)良，且適用于現(xiàn)場檢測的快速、靈敏、高通量在線檢測方法提供參考，以及時(shí)應(yīng)對突發(fā)性食品安全事件，保障消費(fèi)者的食品安全。