不同季節(jié)新鮮鴨蛋表面污染細(xì)菌的多樣性分析

盧昌麗，熊香元，龔慧可，任佑華，陳力力*，劉 焱*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

據(jù)報(bào)道2019年我國(guó)禽蛋產(chǎn)量高達(dá)3 308.98萬(wàn) t，其中鴨蛋約占禽蛋總量的20%，鴨蛋生產(chǎn)已成為我國(guó)禽蛋的重要組成部分[1]。鴨蛋富含蛋白質(zhì)、磷脂、磷脂、VA、VB2、VB1、VD、礦物質(zhì)及人體必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-3]?！夺t(yī)林纂要》記載，鴨蛋補(bǔ)心清肺，止熱嗽，治喉痛。百沸湯沖食，清肺火，解陽(yáng)明結(jié)熱[4]。長(zhǎng)期以來(lái)鴨蛋備受消費(fèi)者的喜愛(ài)，近十年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，人們對(duì)禽蛋的需求量逐年遞增[5]。同時(shí)，鮮鴨蛋的質(zhì)量與衛(wèi)生直接關(guān)系到消費(fèi)者的食用安全，因此也備受關(guān)注[6]。

鴨的生活習(xí)性喜水、好合群，人們常利用江河、湖泊、水塘等天然養(yǎng)殖場(chǎng)，采用放養(yǎng)、散養(yǎng)的飼養(yǎng)方式[7]。鴨的腹大腿短，臀部豐滿(mǎn)且略下垂，羽毛容易受環(huán)境污染[8]；另外鴨下蛋無(wú)固定場(chǎng)所，使蛋殼表面很容易黏有污泥、墊草、糞便，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖；隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，蛋殼表面的細(xì)菌能經(jīng)過(guò)蛋殼上的氣孔水平傳播進(jìn)入蛋內(nèi)，在條件適宜時(shí)會(huì)大量生長(zhǎng)繁殖[9]。前期研究表明鴨蛋殼表面帶菌數(shù)在106以上，其表面菌落總數(shù)與同一環(huán)境中飼料、墊草及空氣的菌落總數(shù)呈正相關(guān)[10]。

由于一年四季的氣溫、濕度、降雨量、光照等氣候條件有所不同，因此，不同季節(jié)生產(chǎn)的鴨蛋衛(wèi)生品質(zhì)也有所差別[11]。高通量測(cè)序技術(shù)作為近十年發(fā)展最迅猛的生物技術(shù)，因其相對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)和國(guó)標(biāo)法具有高覆蓋度、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和低成本等特點(diǎn)，在食品微生物生態(tài)學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，目前已在分析食品微生物多樣性、評(píng)價(jià)食品發(fā)酵和貯藏過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化、監(jiān)測(cè)食源性病原菌動(dòng)態(tài)特征以及控制食品質(zhì)量等方面發(fā)揮出無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[12]。張雅靖等[13]采用Illumina高通量測(cè)序方法，對(duì)撒壩火腿表面和內(nèi)部細(xì)菌的16S rDNA V3-V4區(qū)和真菌ITS2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，分析群落構(gòu)成和多樣性，結(jié)果表明樣品細(xì)菌的豐度及多樣性高于真菌，且內(nèi)部真菌和細(xì)菌微生物多樣性和豐度均高于表面，并且發(fā)現(xiàn)曲霉和葡萄球菌是撒壩火腿表面和內(nèi)部的優(yōu)勢(shì)菌群。Mu Yu等[14]利用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行盤(pán)縣火腿加工過(guò)程中的微生物群落分析時(shí)，同樣得出細(xì)菌群落比真菌群落更為復(fù)雜的結(jié)論。毛俊龍等[15]為了探究茶黃素對(duì)低溫貯藏大黃魚(yú)表面附著微生物組成的影響，對(duì)不同處理大黃魚(yú)表面附著微生物進(jìn)行基因組DNA提取及高通量測(cè)序、多樣性指數(shù)分析比較，證明0.3 mol/L茶黃素對(duì)冷藏和凍藏大黃魚(yú)分別進(jìn)行浸泡處理，相較于空白處理和0.3 mol/L VC溶液浸泡處理而言，具有較好的抗氧化性，對(duì)脂肪含量較高的大黃魚(yú)表面微生物菌落組成有一定的影響，可以抑制部分菌屬生長(zhǎng)，延長(zhǎng)大黃魚(yú)貯藏時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析春夏秋冬不同季節(jié)鴨蛋殼表面細(xì)菌的多樣性，從多樣性指數(shù)、不同分類(lèi)水平物種種群及豐度的差異性和相似性比較季節(jié)因素對(duì)鴨蛋表面細(xì)菌污染的影響，為鴨蛋的潔蛋、保鮮以及加工過(guò)程中相關(guān)措施的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從洞庭湖區(qū)定點(diǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)分別在春、夏、秋、冬季節(jié)（3月、6月、9月、12月），參照國(guó)家“獸藥殘留抽樣檢測(cè)技術(shù)操作要點(diǎn)”的抽樣辦法[16]，定期采集新鮮鴨蛋80 枚，分別裝入無(wú)菌采樣袋，帶回實(shí)驗(yàn)室并在12～20 h內(nèi)處理。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑盒 北京全式金生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌采樣袋（229 mm×140 mm） 北京士博瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1704467 瓊脂糖凝膠電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；ABI GeneAmp9700型PCR儀 愛(ài)普拜斯公司；SP-752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；Quanti Fluor TM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

隨機(jī)從每批樣品鴨蛋中抽取20 枚，各加入100 mL無(wú)菌生理鹽水，常溫條件下置于超聲波清洗器中處理50 s，收集洗蛋水混合液作為春夏秋冬四季的樣品（Y1、Y2、Y3、Y4），隨后將4 個(gè)混合液樣品各分為4 份，編號(hào)LY1、DY1、HY1、YY1春季樣品；LY2、DY2、HY2、YY2春季樣品；LY3、DY3、HY3、YY3春季樣品；LY4、DY4、HY4、YY4春季樣品。備用。

1.3.2 細(xì)菌總基因組DNA提取

上述16 個(gè)樣液各取5 mL收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提出總的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA的完整性后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260，得到DNA濃度，并考察OD260/OD280。

1.3.3 PCR序列擴(kuò)增和Illumina MiSeq測(cè)序

過(guò)濾總序列中不合格的DNA模板，對(duì)合格的文庫(kù)根據(jù)Illumina MiSeq測(cè)序區(qū)域（V4+V5），采用合成帶有barcode的特異引物進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增，引物分別為Primer 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和Primer 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，高通量測(cè)序工作上海美吉生物工程有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)barcode序列區(qū)分各個(gè)樣本reads。然后去除嵌合序列，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，即Clean reads。用相應(yīng)的軟件進(jìn)行細(xì)菌操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）（在97%的相似水平下）聚類(lèi)分析和繪制稀釋曲線(xiàn)；α多樣性指數(shù)分析，包括有計(jì)算菌群豐度指數(shù)Chao和ACE，菌群多樣性指數(shù)Shannon和Simpson，測(cè)序深度指數(shù)覆蓋率。基于以上數(shù)據(jù)分析的合理性，用Venn圖統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，再一步進(jìn)行UniFrac的主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA），差異性和相似性；分析門(mén)、科、屬和種各水平上物種組成的豐度和多樣性，將聚類(lèi)后屬水平上的數(shù)據(jù)表示在熱圖上，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色梯度及相似程度反映多個(gè)樣本在各分類(lèi)水平上群落組成的相似性和差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Illumina MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與質(zhì)量分析

樣品總基因組DNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，電泳目的條帶清晰，OD260/OD280比值表明其濃度和純度均符合用于PCR擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)16 個(gè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Illumina MiSeq測(cè)序，共獲得697 244 條優(yōu)化序列，按97%的相似度聚類(lèi)后歸為650 個(gè)OTU，包括35 個(gè)門(mén)，298 個(gè)屬。隨機(jī)抽取樣品基因組中一定數(shù)量的序列個(gè)數(shù)與它們所代表的物種數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線(xiàn)，如圖1所示，稀釋曲線(xiàn)逐漸趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量足夠充分合理，可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)分析。

圖1 相似度為97%條件下各樣品的稀釋曲線(xiàn)Fig.1 Rarefaction curves of each sample at similarity of 97%

2.2 細(xì)菌群落的多樣性分析

2.2.1α多樣性分析

如表1所示，樣本中序列被測(cè)出的概率高達(dá)99%，說(shuō)明該數(shù)據(jù)能有效代表樣本中微生物的真實(shí)情況。冬季樣品Y4組（LY4、DY4、HY4、YY4）的ACE指數(shù)和Chao指數(shù)值最大，平均分別為587.5±17.82和596.5±22.29，菌群豐度明顯高于其他3 組季節(jié)樣品；Shannon指數(shù)最大和Simpson指數(shù)最小，平均分別為3.52±1.02和0.1±0.07，種群復(fù)雜度表現(xiàn)最為突出。不同季節(jié)的菌群多樣性排序?yàn)閅4（冬季樣品）＞Y1（春季樣品）＞Y2（夏季樣品）＞Y3（秋季樣品），其中HY4菌群多樣性最高。

表1 α多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity index

2.2.2 Venn圖分析

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本在相似水平為97%下所共有和獨(dú)有的物種OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)樣本的物種數(shù)目組成相似性及重疊情況。由圖2可知，4 組樣品有35 個(gè)共有OTU，分別占各樣品OTU數(shù)目的0.06%～70%，重疊度較小，說(shuō)明各個(gè)季節(jié)鴨蛋殼表面的菌群種類(lèi)具有較大的差異性。獨(dú)有的OTU數(shù)目分別為Y1 9 個(gè)、Y2 0 個(gè)、Y3 17 個(gè)、Y4 496 個(gè)，在Y1獨(dú)有的OTU中占比最大的為變形桿菌門(mén)（Proteobacteria）的淤泥假單胞菌（Pseudomonas_caeni），有研究表明淤泥假單胞菌是抗生素耐藥基因的主要宿主菌[17]，會(huì)加速耐藥致病菌的產(chǎn)生；Y3中豐度較大是水中最為常見(jiàn)細(xì)菌之一弧菌屬（Vibrio），可引起腸道感染的細(xì)菌，它會(huì)引發(fā)腸胃炎和霍亂等疾病[18]；Y4主要有Candidate_division_SR1門(mén)，變形菌門(mén)的β-變形菌綱脫氯菌屬（Dechloromonas）屬于反硝化細(xì)菌可以抑制植物性致病菌，梭狀芽孢桿菌的小紡錘狀菌屬（Fusibacter）和擬桿菌門(mén)的Bacteroidetes_vadinHA17科等其他微生物共同作用下降解為反硝化過(guò)程提供碳源的物質(zhì)[19]。湖南冬季氣溫較低，陰濕多雨，氣候環(huán)境并不適宜細(xì)菌繁殖，但冬季鴨群喜聚團(tuán)保暖，不?；顒?dòng)，使鴨子抵抗力降低，另由于環(huán)境衛(wèi)生等因素造成鴨蛋表面微生物菌群復(fù)雜。而夏季高溫少雨，暑熱時(shí)期長(zhǎng)，紫外照射時(shí)間長(zhǎng)，鴨子天熱時(shí)經(jīng)常下水，鴨體較為干凈，活動(dòng)較為分散，減少相互之間的細(xì)菌滋生。

圖2 不同季節(jié)樣品共有和獨(dú)有OTU Venn圖Fig.2 Venn diagram of unique and shared OTUs of the bacterial communities in different seasons

2.2.3 基于UniFrac的PCoA

首先結(jié)合樣本OTU的種類(lèi)及其相對(duì)豐度，通過(guò)一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，PCoA可以找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo)，結(jié)果為數(shù)據(jù)矩陣的一個(gè)旋轉(zhuǎn)，它沒(méi)有改變樣本點(diǎn)之間的相互位置關(guān)系，只是改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。UnifracPCoA基于進(jìn)化距離，在進(jìn)化水平上挖掘影響樣品群落組成差異的潛在主成分，繪制PCoA聚類(lèi)圖。PC1的貢獻(xiàn)率為70.14%，PC2的貢獻(xiàn)率為15.12%，當(dāng)PC1和PC2的總解釋度達(dá)40%就可用于后續(xù)的樣品差異性分析。由圖3可知，16 個(gè)樣品中，每個(gè)季節(jié)的樣品組聚類(lèi)效果均較優(yōu)，其中春季（Y1）組和夏季（Y2）組的樣品相互聚類(lèi)到一起，而其他組別均出現(xiàn)明顯差異。整體來(lái)看，組內(nèi)菌群差異不顯著，但組間菌群豐度差異顯著。

圖3 基于UniFrac的PCoA聚類(lèi)分析Fig.3 PCoA clustering analysis based on UniFrac

2.3 樣品物種組成分析

2.3.1 門(mén)和科水平物種組成分析

本研究共注釋得到35 個(gè)門(mén)，其中絕大多數(shù)是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），分別占比59%和38%，其余的33 個(gè)門(mén)水平物種不到3%。在科分類(lèi)水平上，共得到200 個(gè)科，圖4為各樣品相對(duì)豐度大于1%的科水平物種的多樣本柱狀圖（相對(duì)豐度低于1%的部分合并為other）。在4 組樣品中占比較大的有5 個(gè)科，分別為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）占比28.22%（18.53%～33.34%），桿菌科（Bacillaceae）占比17.77%（10.20%～25.42%），腸球菌科（Enterococcaceae）占比17.18%（12.41%～23.63%），梭菌科_1（Clostridiaceae_1）占比9.21%（4.20%～15.45%），扁球菌科（Planococcaceae）占比6.41%（3.19%～8.85%）。

圖4 不同季節(jié)多樣品科水平菌種群組成圖Fig.4 Phylum-level composition of microflora in different seasons

2.3.2 屬水平物種相對(duì)豐度及熱圖分析

物種組成分析顯示，大部分OTUs都可以注釋到屬水平。為了解菌群的分布情況，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)在屬分類(lèi)水平上每個(gè)樣品的菌群組成，共得到298 個(gè)屬，其中Y1擁有49 個(gè)屬，Y2擁有32 個(gè)屬，Y3有85 個(gè)屬，Y4有285 個(gè)屬。由表2可知，各樣品的優(yōu)勢(shì)菌屬，其中Y1埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）相對(duì)豐度最大（25.61±10.42）%；Y2腸球菌屬（Enterococcus）相對(duì)豐度最大（19.74±9.31）%；Y3和Y4的芽孢桿菌屬（Bacillus）相對(duì)豐度最大，分別為（25.42±18.16）%和（18.27±14.09）%。這說(shuō)明氣溫對(duì)芽孢桿菌屬無(wú)明顯影響，在蛋殼表面普遍存在，但氣溫對(duì)志賀菌影響顯著，過(guò)高（Y2）或過(guò)低（Y4）都能抑制其生長(zhǎng)。Y4的others（即相對(duì)豐度低于1%）物種占比為（22.53±20.01）%，說(shuō)明其物種多樣性明顯高于其他3 組樣品。此外在屬水平上發(fā)現(xiàn)有腸桿菌（Enterobacter）、溶菌桿菌（Lysinibacillus）、梭菌（Clostridium_sensu_stricto_1）、厭氧桿菌（Aneurinibacillus）等普通方法難以分離鑒定的細(xì)菌序列。

表2 不同季節(jié)屬水平樣品相對(duì)豐度分布統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of relative abundance distribution at genus level in different seasons

熱圖可以用顏色變化反映樣品物種豐度的數(shù)據(jù)信息，直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示，如圖5所示，顏色由藍(lán)色到紅色分別代表相對(duì)豐度為0%～50.53%。通過(guò)顏色的梯度及相似程度，能更清晰地反映各樣品屬水平上群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異性。圖5中冬季（DY4、HY4、LY4、YY4）樣品中的顏色明顯比其他3 組偏綠，說(shuō)明其菌群的相對(duì)豐度高于其他3 個(gè)季節(jié)的菌群豐度，且物種多樣性也明顯比其他3 組高。從橫向看樣品中有不同深淺顏色的深綠色、亮黃色到紅色，表示這些菌群在樣品之間有較高的相似度，雖然存在顏色差異，豐度有些許不同，但也說(shuō)明它們是樣品中普遍存在的群落，都含有梭狀芽孢桿菌1型屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、消化鏈球菌屬（Peptoclostridium）、賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）[20]。在其他某些藍(lán)色的區(qū)域出現(xiàn)，則說(shuō)明只是一部分的菌屬或樣品具有相似度，例如，酸性氨基桿菌屬（Acidaminobacter）、未分類(lèi)禽桿菌（Rhodocyclaceae_unclassified）和擬桿菌（Marinilabiaceae）僅Y4中有存在草綠色區(qū)域，其他均為藍(lán)色；禽桿菌科（Rhodocyclaceae）的陶厄氏菌屬（Thauera）和Parcubacteria_norank在Y3和Y4為黃綠色區(qū)域，其他均為藍(lán)色，說(shuō)明兩兩菌屬之間具有較高的豐度相似度，但樣品間的差異極大。

圖5 不同季節(jié)的樣品屬水平熱圖Fig.5 Heatmap showing bacterial community structure at genus level in different seasons

2.3.3 種水平物種組成分析

在種水平上，16 個(gè)樣品能鑒定出447 個(gè)種，其中Y1擁有62 個(gè)種，Y2擁有39 個(gè)種，Y3有109 個(gè)種，Y4有427 個(gè)種，但各個(gè)種的豐度都較小，而且大部分為沒(méi)有得到明確種的分類(lèi)（unclassified）。如表3所示，列出各組樣品在種水平上總序列數(shù)大于700的物種，其主要為未分類(lèi)芽孢桿菌（Bacillus_unclassified）、未分類(lèi)埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella_unclassified）、未分類(lèi)腸球菌（Enterococcus_unclassified）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium_perfringens_NCTC_8239）和未分類(lèi)腸桿菌（Enterobacter_unclassified），與在屬水平分析的物種組成結(jié)果差異不大。結(jié)果表明，從種水平上看，不同季節(jié)的樣品各相同物種序列數(shù)差異大且多樣性更為復(fù)雜，在表中樣品細(xì)菌種類(lèi)多但豐度小難以進(jìn)行明確的分類(lèi)。

表3 不同季節(jié)樣品種水平物種組成Table 3 Bacterial community composition at genus level in different seasons

3 討 論

目前對(duì)于禽蛋類(lèi)殼表面細(xì)菌的菌群結(jié)構(gòu)研究大部分以雞蛋為主[21]，而鴨蛋表面的細(xì)菌菌群多樣性分析較少。這是因?yàn)椋M管資料表明，從蛋白質(zhì)方面看鮮鴨蛋及其制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與鮮雞蛋相當(dāng)，甚至在脂肪和礦物質(zhì)含量上優(yōu)于雞蛋，可作為雞蛋的有益補(bǔ)充，完善膳食結(jié)構(gòu)[22]，但消費(fèi)者對(duì)雞蛋的認(rèn)知度高、需求量大，雞蛋的產(chǎn)銷(xiāo)量高于鴨蛋，雞蛋更容易成為人們研究的熱點(diǎn)；另外，長(zhǎng)期以來(lái)，鴨蛋多被生產(chǎn)加工成皮蛋和咸蛋等蛋制品；鴨蛋的污染菌種類(lèi)多而復(fù)雜，普通的菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基無(wú)法觀察到，比如硝化螺旋菌門(mén)[23]（Nitrospirae）、米氏硫胺素芽孢桿菌（Aneurinibacillus）等有著嚴(yán)格的培養(yǎng)要求，其深入研究有一定難度[24]。由于鴨的生活習(xí)性與雞有差別，2 種禽蛋殼被污染的菌群有一定區(qū)別，石一等[25]從3 個(gè)不同養(yǎng)殖場(chǎng)取樣分析雞蛋殼表面多樣性結(jié)果得出其表面細(xì)菌以厚壁菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)為主。從本實(shí)驗(yàn)不同季節(jié)鴨蛋殼表面的細(xì)菌菌群多樣性分析結(jié)果表明，鴨蛋殼表面菌群35 個(gè)門(mén)，其中最主要的是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），比雞蛋殼物種豐度高些。

在生產(chǎn)過(guò)程中，蛋鴨自身感染是鴨蛋殼表面污染菌的影響因素之一，養(yǎng)殖場(chǎng)會(huì)在秋季人工強(qiáng)制的方法讓母鴨換羽[26]，使鴨短期內(nèi)還能繼續(xù)產(chǎn)蛋，這會(huì)導(dǎo)致鴨子身體虛弱，入冬時(shí)天氣濕冷，導(dǎo)致病鴨增多，因此產(chǎn)蛋少且質(zhì)量不好。本實(shí)驗(yàn)的菌群多樣性分析出有部分腸道致病菌：芽孢桿菌是導(dǎo)致食品腐敗的主要因素之一[27]；腸球菌是一類(lèi)存在于人和動(dòng)物消化道內(nèi)的致病菌，其中糞腸球菌能破壞腸道內(nèi)DNA，同時(shí)產(chǎn)生一定的有害化學(xué)物質(zhì)，誘發(fā)直腸癌[28]；埃希氏菌屬-志賀菌屬也是一種腸道致病菌，引起細(xì)菌性痢疾[29]。測(cè)序結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)：梭菌是嚴(yán)格厭氧菌屬，很難分離培養(yǎng)，與長(zhǎng)期使用抗生素有關(guān)[30]，易引發(fā)炎癥；假單胞菌致腐敗能力強(qiáng)，存在于糞便和肉類(lèi)產(chǎn)品中[31]；產(chǎn)堿菌屬存在于水和土壤以及脊椎動(dòng)物腸道中，是常見(jiàn)的專(zhuān)性好氧型寄生菌，易受感染；還有一部分沒(méi)能明確屬水平的腸桿菌科等。

禽蛋殼表面細(xì)菌的微生態(tài)系統(tǒng)是受多個(gè)因素影響的結(jié)果，楊伊磊等[32]采用細(xì)菌菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定，得出結(jié)果認(rèn)為造成禽蛋表面細(xì)菌污染的主要原因均受飼養(yǎng)場(chǎng)的空氣、飼料、墊草的細(xì)菌污染。Shi Yi等[33]對(duì)不同面積，不同貯藏時(shí)間的雞蛋蛋殼微生物群研究，認(rèn)為蛋殼上微生物群的結(jié)構(gòu)、豐度和組成因不同環(huán)境和不同時(shí)期而異。姜慧繪等[34]研究不同天氣對(duì)新鮮鴨蛋蛋殼的細(xì)菌污染情況，實(shí)驗(yàn)表明在陰冷潮濕天氣條件下，新鮮鴨蛋蛋殼細(xì)菌群落總數(shù)、大腸菌群數(shù)不同程度高于晴朗高溫天氣。與本實(shí)驗(yàn)聚類(lèi)熱圖分析的冬季（Y4）菌群相對(duì)豐度高于其他3 個(gè)季節(jié)的結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

以不同季節(jié)鴨蛋蛋殼洗液樣品為研究對(duì)象，通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品殼表面中細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，從稀釋性曲線(xiàn)證明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序結(jié)果具有代表性和真實(shí)性。結(jié)果表明，16 個(gè)樣品均具有較高的菌群多樣性，且各個(gè)時(shí)期都有相似的優(yōu)勢(shì)菌屬：厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌屬和腸球菌屬，分別占比17.78%和17.16%；變形菌門(mén)的埃希氏菌屬-志賀菌屬占比17.14%。季節(jié)變化對(duì)鴨蛋表殼的菌群結(jié)構(gòu)有一定影響。芽孢桿菌和腸球菌在秋季相對(duì)于春季的豐度高些，而大腸桿菌屬-志賀菌屬受季節(jié)氣溫影響最為明顯，在冬季減少，來(lái)年春季氣溫上升并生長(zhǎng)迅速，夏季氣溫繼續(xù)升高而豐度降低，秋季時(shí)豐度增高。夏季和秋季樣品的多樣性較低，但其優(yōu)勢(shì)菌種的相對(duì)豐度較高，占比可達(dá)80%。冬季樣品的蛋殼表面細(xì)菌菌群多樣性和相對(duì)豐度最高，也最為復(fù)雜，更有研究表明蛋殼的污染菌會(huì)侵入蛋內(nèi)容物，冬季產(chǎn)蛋加大造成污染的風(fēng)險(xiǎn)，要在冬季時(shí)加強(qiáng)產(chǎn)蛋鴨的營(yíng)養(yǎng)需求和生產(chǎn)管理。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在門(mén)、科、屬和種水平上全面地分析鴨蛋表面細(xì)菌的多樣性以及其季節(jié)性變化，分析表面細(xì)菌對(duì)鴨蛋腐敗變質(zhì)的潛在影響，強(qiáng)調(diào)了養(yǎng)殖場(chǎng)按季節(jié)變化分期管理和定期衛(wèi)生管理的重要性，為進(jìn)一步禽蛋污染研究提供一定參考。