環(huán)絲氨酸與其他二線抗結(jié)核藥物體外相互作用的研究

屈世林 張宇 徐立民 曾瑋 劉珂?zhèn)? 張立群

【摘要】目的：探討環(huán)絲氨酸（CS）與其他二線抗結(jié)核藥物的體外相互作用。方法：分別選擇敏感菌株及同時(shí)耐異煙肼利福平的臨床分離菌株各 10 株，濃度梯度法測定 CS、莫西沙星（MFX）、卷曲霉素（CM）、對氨基水楊酸（PAS）和丙硫異煙胺（PTO）的最低抑菌濃度（MIC）值，通過計(jì)算分級抑菌濃度指數(shù)，觀察環(huán)絲氨酸與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用時(shí)是否存在相互作用。結(jié)果：CS 聯(lián)合 CM、CS 聯(lián)合 PAS 能檢測到協(xié)同作用；CS 聯(lián)合 MFX、CS 聯(lián)合 PTO 未檢測到相互作用。CS 與 4 種抗結(jié)核藥的分級抑菌濃度指數(shù)在敏感和耐多藥（MDR）菌株間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>O.05）。結(jié)論：敏感及MDR結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的體外研究結(jié)果顯示 CS 與 CM 和 PAS 有協(xié)同效應(yīng)，與 MFX 和 PTO 無相互作用。

【關(guān)鍵詞】環(huán)絲氨酸；微量稀釋棋盤法；協(xié)同作用；體外研究

【中圖分類號】R52 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號】2096-5249（2021）06-0251-02

基金項(xiàng)目：2017北京結(jié)核病診療技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟CTCTC科研項(xiàng)目基金支持項(xiàng)目（2017KYJJ005）

結(jié)核病是嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題，耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)是造成結(jié)核病疫情居高不下的重要原因之一。WHO多次發(fā)布耐藥結(jié)核病的診治指南，其中CS因其口服吸收良好、體內(nèi)分布廣泛、不易產(chǎn)生耐藥且與其他抗結(jié)核藥物無交叉耐藥性，在2018年指南更新中將CS作為耐藥結(jié)核病治療方案的B組藥物，常與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合應(yīng)用。本研究通過測定CS對敏感及MTB臨床分離株的體外抑菌作用，探討CS與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用時(shí)的體外相互作用，為臨床合理使用CS提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)用菌株：選擇荊州市胸科醫(yī)院細(xì)菌室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv菌株1株，經(jīng)絕對濃度法藥敏試驗(yàn)確定為敏感的臨床分離菌株10株、同時(shí)耐異煙肼（H）和利福平（R）的臨床分離菌株10株。敏感菌株10株均為臨床初治結(jié)核病患者菌株，耐藥菌株10株，其中初始耐藥患者2例，其余8例均為臨床復(fù)治患者，其中使用左氧氟沙星大于1月者3例，使用阿米卡星大于1月者2例，均未使用莫西沙星（MFX）、丙硫異煙胺（PTO）、對氨基水楊酸鈉（PAS）及卷曲霉素（CM）。

主要藥物和試劑：CS、MFX、CM、PTO、PAS均購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 濃度梯度法測定幾種抗結(jié)核藥物的MIC

配制CS，MFX，CM，PAS， PTO， 使藥物的儲(chǔ)存濃度為320 μg/mL。將藥物稀釋于10 %OADC 7H9培養(yǎng)基，使其終濃度分別為0.015 μg/mL、0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.125 μg/ mL、0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/ mL、8 μg/mL、16 μg/mL。將20 μL的含藥培養(yǎng)基加入96孔板中并在無菌安全柜中風(fēng)干后待用。

取適量對數(shù)生長期的菌株，磨菌后用生理鹽水比濁至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬s107 cfu/mL），用7H9培養(yǎng)液1∶100稀釋，使菌液濃度為105 cfu/mL。取稀釋后的菌液200 μg/mL孔加入96孔板中，同時(shí)設(shè)置100 %、10 %、1 %菌量生長陽性對照孔，封板裝入自封塑料袋后置 37 ℃溫箱培養(yǎng)。以接種當(dāng)天為第0天，前3天觀察培養(yǎng)板狀態(tài)是否有肉眼可見菌落生長。如果出現(xiàn)渾濁或沉淀需要進(jìn)行鑒定，以確認(rèn)是否發(fā)生污染。從第7天、10天、14天分別觀察培養(yǎng)板上菌落生長情況并記錄結(jié)果。以孔底出現(xiàn)肉眼可見的白色菌體沉淀為陽性。 MIC定義為孔底可見菌體沉淀小于10%對照孔的最低藥物濃度。

1.2.2 觀察CS與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用的體外相互作用

選取標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv 1株、敏感臨床分離菌株10株、同時(shí)耐HR的臨床分離菌株10株，微量棋盤稀釋法測定CS與其他二線抗結(jié)核藥物的體外相互作用。將CS的1/4倍、1/2倍、1.0倍、2.0倍MIC濃度分別與MFX、PAS、CM、PTO 的1/4倍、1/2倍、1.0倍、2.0倍MIC濃度聯(lián)合應(yīng)用，檢測方法同上，觀察各種聯(lián)合用藥作用下細(xì)菌的生長情況。

計(jì)算分級抑菌濃度指數(shù)（Fraction inhibition concentration index，F(xiàn)ICI）計(jì)算公式為：濃度指數(shù)（FICI）=聯(lián)合藥敏時(shí)甲藥MIC/單獨(dú)藥敏時(shí)甲藥MlC+聯(lián)合藥敏時(shí)乙藥MIC/單獨(dú)藥敏時(shí)乙藥MlC，F(xiàn)ICI≤0.5為協(xié)同；0.54為拮抗。

1.2.3 MIC測定的質(zhì)量控制

每株菌重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，最終取3次一致性最好的數(shù)值；每次進(jìn)行操作時(shí)，均設(shè)H37Rv 標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控株。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件分析，CS對H37Rv、敏感和耐多藥菌株的MIC比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濃度梯度法分別測定

標(biāo)準(zhǔn)菌株（H37Rv）、10株敏感菌株及10株耐HR菌株的CS、MFX、PAS、PTO、CM的MIC值，得到3組細(xì)菌的MIC值基本一致，分別為CS 2.0 μg/mL、MFX 0.03 μg/mL、CM 1.0μg/mL、PTO 0.125 μg/mL、PAS 0.06 μg/mL。

2.2 CS與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用對敏感和耐多藥菌株的體外相互作用

在耐多藥菌株中，1/4倍MIC濃度的CS與MIC濃度的MFX、PTO聯(lián)合時(shí)可達(dá)到90 %以上的抑菌效果；而與1/2倍MIC濃度的CM、PAS聯(lián)合時(shí)亦可達(dá)到90%以上的抑菌效果；而1/2倍MIC濃度的CS與1/2倍濃度的MFX聯(lián)合時(shí)可達(dá)到90 %以上的抑菌效果，與其他三種藥物均在1/4倍MIC濃度聯(lián)合時(shí)可達(dá)到90 %以上的抑菌效果（見圖1～4）。FICI（Cs+Mfx）=1.25、FICI（Cs+Cm）=0.75、FICI（Cs+PAS）=0.75、FICI（Cs+Pto）=1.25，提示CS與CM、PAS有協(xié)同效應(yīng)，與MFX、PTO無相互作用。敏感菌株與耐藥菌株的結(jié)果一致。

3 討論

WHO于2018年推薦環(huán)絲氨酸作為治療MDR-TB的二線核心口服抗結(jié)核藥之一[1]。其抗菌作用機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁粘肽的合成，從而使細(xì)胞壁缺損導(dǎo)致細(xì)菌耐酸能力減弱，起到殺菌和抑菌作用[2-3]，且與其他藥物無交叉耐藥。近年來，國內(nèi)外含環(huán)絲氨酸治療方案對MDR-TB患者的治愈率為66 %～77 %，死亡率和復(fù)發(fā)率較低[4-5]。

CS最低抑菌濃度為25 mg/L。Deshpande[6]等學(xué)者通過結(jié)核中空纖維系統(tǒng)模型（the hollow fibersystem model of tuberculosis，HFS-TB）研究CS的藥物動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)高濃度CS的殺菌作用與一線抗結(jié)核藥物及氟喹諾酮類藥物相當(dāng)，提示CS并不是傳統(tǒng)意義上的抑菌藥物，高濃度環(huán)絲氨酸具有殺菌效果，但由于CS的神經(jīng)精神副反應(yīng)嚴(yán)重[7]，限制了該藥的使用劑量。雖然WHO推薦CS血藥濃度為25μg/ ml～30μg/ml是有效安全的，但臨床研究發(fā)現(xiàn)CS低血清濃度使用率達(dá)到44%[8]，大多數(shù)患者環(huán)絲氨酸的血藥濃度只能達(dá)到15μg/ml～20μg/ml。Seung等報(bào)道中低濃度CS使用率為71.2 %，且與對照組相比，CS低血清濃度使用并不影響患者2月末痰菌轉(zhuǎn)陰率，提示CS與其他抗結(jié)核藥物可能存在相互作用，從而加強(qiáng)了聯(lián)合用藥的效果。環(huán)絲氨酸與異煙肼合并用藥有輕度協(xié)同作用，但是針對目前異煙肼、利福平等一線抗結(jié)核藥物的耐藥日益嚴(yán)重的情況，急需尋找其他適合與環(huán)絲氨酸聯(lián)合使用且能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的抗結(jié)核藥物。2018年WHO耐多藥結(jié)核病指南將注射劑及PAS由于不良反應(yīng)被推薦停止使用。但在我國，由于抗結(jié)核新藥尚不能廣泛應(yīng)用，而其他藥物高昂的價(jià)格亦限制了患者能夠全療程的應(yīng)用，因此，從我國國情出發(fā)，現(xiàn)階段完全剔除注射劑及PAS可能是不明智的。所以，從二線藥物中尋找與環(huán)絲氨酸有協(xié)同作用的抗結(jié)核藥，并摸索合適的聯(lián)合用藥劑量顯得尤為重要。本課題對CS，CM，PAS，PTO之間的相互作用進(jìn)行了研究，期望能夠指導(dǎo)臨床，在密切監(jiān)測不良反應(yīng)的同時(shí)合理用藥，明確藥物之間相互作用，這對于提高M(jìn)DR患者的治愈率有重要意義。

有研究表示，環(huán)絲氨酸與異煙肼合并用藥有輕度協(xié)同作用，但是針對耐藥率日益嚴(yán)重的情況，急需尋找適合與環(huán)絲氨酸聯(lián)合使用且能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的抗結(jié)核藥物。本次研究結(jié)果顯示，CS與CM及PAS聯(lián)合使用的FICI值均為0.75，提示CS與CM及PAS存在協(xié)同作用，這或許能夠解釋在CS中低濃度使用的MDR患者臨床治療方案中，仍然能夠取得較滿意的療效的原因，可能是因?yàn)榉桨钢型瑫r(shí)存在注射劑CM和PAS。但是MDR患者中CS聯(lián)合CM及PAS的治療方案與不含CM及PAS的治療方案的療效是否存在差異還有待進(jìn)一步研究。

此外，環(huán)絲氨酸作為核心抗結(jié)核口服藥物，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，治療耐藥結(jié)核病的前景廣闊，但其耐藥現(xiàn)象不容忽視，應(yīng)深入研究其耐藥機(jī)制以減少耐藥的發(fā)生。

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