蚯蚓與細(xì)菌協(xié)同作用對土壤中聚丙烯酰胺的降解效果

周東興++王兵++鄧杰++寧玉翠++斯琴畢力格++王廣棟+李勝男

摘要：從含有聚丙烯酰胺（PAM）的污泥中分離得到2株P(guān)AM降解菌PAM1和PAM5，通過16S rDNA序列分析，初步鑒定PAM1為Comamonas kerstersii，PAM5為Comamonas terrigena。通過24 d室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，研究細(xì)菌與蚯蚓協(xié)同作用對土壤中PAM降解的影響。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理，分別為空白試驗(yàn)（CK）、接種細(xì)菌（B）、加入蚯蚓（E）以及同時(shí)接入細(xì)菌和蚯蚓（BE），28 ℃恒溫培養(yǎng)。結(jié)果表明，在同一PAM污染濃度下，各處理PAM降解率均隨時(shí)間的增加而升高，培養(yǎng)24 d后各處理的降解率差異顯著，其降解率的大小順序?yàn)锽E>B>E>CK。說明單獨(dú)加入蚯蚓、細(xì)菌以及同時(shí)接入蚯蚓和細(xì)菌都能顯著促進(jìn)土壤中PAM的降解，且以蚯蚓與細(xì)菌協(xié)同作用對土壤中PAM的降解效果最好；在不同PAM濃度下，處理B、BE、CK對PAM的降解隨著PAM濃度的增加而降低；E處理對PAM的降解率隨PAM濃度的增加僅產(chǎn)生輕微波動。

關(guān)鍵詞：蚯蚓；細(xì)菌；協(xié)同作用；聚丙烯酰胺降解；PAM1；PAM5

中圖分類號： S181文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0259-04

聚丙烯酰胺（PAM）由丙烯酰胺均聚或與其他單體共聚而成，是一種線性水溶性有機(jī)高分子聚合物，能以任何比例溶于水，幾乎不溶于乙醚、苯、酯類、丙酮等一般有機(jī)溶劑，兼具絮凝性、增稠性、耐剪切性、降阻性、分散性等性能[1-2]。由于其良好的絮凝性能，PAM開始在水處理領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，包括原水處理、污水處理、工業(yè)水處理、城市生活污水處理等，目前仍然是國內(nèi)外水處理領(lǐng)域使用量最大的水處理劑[3]。此外PAM也被廣泛應(yīng)用于造紙、石油開采、紡織、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，有“百業(yè)助劑”之稱[4]。但在PAM被廣泛應(yīng)用的同時(shí)，由于受到技術(shù)和工藝等水平的限制，PAM被排放到環(huán)境中，逐漸累積，造成環(huán)境中有大量的PAM殘留，最終進(jìn)入土壤，長此以往會對土壤環(huán)境產(chǎn)生一定的影響[5]。雖然少量的PAM施加到土壤中會對土壤起到一定的改良作用，但是過量的PAM會引起土壤板結(jié)，使土壤透氣性變?nèi)酰瑥亩绊懽魑锏纳L[6]。此外，PAM在環(huán)境中受各種理化及生物因素的影響會發(fā)生緩慢的降解，產(chǎn)生丙烯酰胺單體（AM），AM具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性、致癌性及遺傳性毒性等，對環(huán)境造成污染的同時(shí)也會對人體產(chǎn)生直接或間接的危害[7-8]。

處理PAM最核心的問題便是PAM的降解。相比于利用物理或化學(xué)方法降解PAM，生物降解過程不產(chǎn)生劇毒的AM，無二次污染，具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[9]。然而，在利用微生物修復(fù)受污染土壤的過程中，土壤受污染導(dǎo)致含氧量過低往往會限制土壤污染物的降解[10]。蚯蚓作為土壤生態(tài)環(huán)境中的重要組成部分，在修復(fù)污染土壤方面具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓能通過自身的生命活動，如運(yùn)動、取食、挖掘等行為，改善土壤的通氣，促進(jìn)外源添加到土壤中的微生物傳播[11-13]。但關(guān)于蚯蚓與微生物協(xié)同作用降解土壤中PAM效果的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過蚯蚓和細(xì)菌的單獨(dú)和混合培養(yǎng)，研究蚯蚓和細(xì)菌及其相互作用對土壤中PAM降解效果的影響，旨在探究蚯蚓與微生物聯(lián)合修復(fù)PAM污染土壤的可行性。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

PAM購自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，水解度30%。用于篩選PAM降解菌的污泥，取自黑龍江省哈爾濱市文昌污水處理廠。

選擇性液體培養(yǎng)基的組成：蔗糖0.50 g/L，PAM0.30 g/L，KH2PO4·3H2O 0.50 g/L，K2HPO4 0.50 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，CaCl2 0.01 g/L，NaCl 0.50 g/L，pH值自然[14]。選擇性固體培養(yǎng)基：向上述培養(yǎng)基中加入15～20 g/L 的瓊脂粉，制成平板。富集培養(yǎng)基的組成：牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L。

供試土壤為黑土，采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城試驗(yàn)基地。釆集0～20 cm表層土，去除碎石、枯葉等雜物，自然風(fēng)干，過 2 mm 篩備用。供試土樣未檢出PAM，可認(rèn)為不含PAM，其基本理化性質(zhì)為pH值6.64，速效磷含量25.60 mg/kg，速效鉀含量164.20 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量28.10 g/kg。

供試蚯蚓為赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），采自黑龍江省雙城市良順生物科技有限公司。試驗(yàn)選擇形態(tài)大小均勻、有明顯環(huán)帶的成蚓。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌種的篩選目前PAM是國內(nèi)外水處理領(lǐng)域使用量最大的水處理劑，主要用于水和污水的預(yù)沉淀及污泥的增稠和脫水[15]。所以本試驗(yàn)采用污泥作為分離PAM降解菌的來源。將采集的10 g污泥溶于90 mL無菌蒸餾水中，30 ℃、140 r/min 于搖床中振蕩培養(yǎng)3 h后，將其稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5的懸濁液。將每個(gè)稀釋度的懸濁液分別抽取 0.2 mL 于以PAM作為唯一氮源的選擇性固體培養(yǎng)基中，每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行試驗(yàn)，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

待平板長出菌落，選擇生長狀況良好且有明顯性狀差異的菌落，于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中劃線純化。對純化后的菌株進(jìn)行平板脅迫馴化[16]，使選擇性培養(yǎng)基中的PAM濃度提高為500 mg/L，將分離出的菌株接種到平板上馴化，3次平行試驗(yàn)，于30 ℃培養(yǎng)5 d后將各個(gè)菌株重新接到PAM濃度為700 mg/L的選擇培養(yǎng)基中繼續(xù)馴化，以此類推逐級增加PAM濃度，依次為 1 000、1 500、2 000 mg/L。最后挑選生長速度快、長勢好的菌株，接入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

將篩選出的菌株單獨(dú)及復(fù)合接種到新鮮的選擇性液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)10 d，觀察PAM降解情況。

1.2.2PAM優(yōu)勢降解菌的鑒定降解菌16S rDNA序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。采用16S rDNA序列測定法對菌株DNA進(jìn)行提取、擴(kuò)增及序列測定。所得結(jié)果通過BLAST在線工具與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行序列搜索比對，初步鑒定菌株。

1.2.3處理方法PAM作為一種常用的水處理劑，在污泥脫水前的投加量一般為3～5 mg/g干污泥，對于一些沉降性能差的污泥則需要更高的投加量[17]。污泥脫水過程中大量的絮凝劑被轉(zhuǎn)移到泥餅中，與此同時(shí)污泥中含有的大量PAM也會隨著污泥農(nóng)用被轉(zhuǎn)移到土壤中。試驗(yàn)設(shè)計(jì)中PAM的初始污染濃度為2、4、6 mg/g。

稱取300 g土壤樣品于500 mL廣口瓶中，用紗布封口。為了消除土著微生物的影響，將裝有土樣的廣口瓶于121 ℃濕熱滅菌20 min。將溶于無菌水的PAM與土樣充分?jǐn)嚢杌靹颍雇寥莱跏糚AM污染濃度分別為2、4、6 mg/g，每個(gè)污染濃度水平下設(shè)4個(gè)處理，CK表示空白對照，E表示只加入蚯蚓，B表示只接種細(xì)菌，BE表示接入蚯蚓和細(xì)菌，每個(gè)處理3次重復(fù)。加入蚯蚓的各處理分別加入10條成蚓，接種細(xì)菌的各處理分別加入10 mL菌懸液（PAM1、PAM5 2種菌比例 1 ∶1），其他處理接入同劑量的無菌水。試驗(yàn)中土壤水分維持在田間最大持水量的60%，并定期補(bǔ)充水分。于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 d。培養(yǎng)期間進(jìn)行動態(tài)采樣，每隔4 d進(jìn)行1次破壞性采樣。

1.2.4土壤中PAM的提取與測定PAM是一種水溶性高分子材料，易吸附和保留水分，可以以任意比例溶于水，一般不溶于有機(jī)溶劑，因此本試驗(yàn)采用水洗提取法從土樣中分離PAM。先把樣品溶于蒸餾水中，用搖床振蕩2 h，使其均勻分散在水中，再用磁力攪拌器攪拌10 min，然后以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液待測。為了徹底地提取樣品中的PAM，須對樣品中的PAM進(jìn)行3次提取[17]。并將所得上清液按一定比例稀釋，然后采用淀粉-碘化鎘分光光度法[18]測定PAM的濃度。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel和SPSS 19.0等統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Duncans方法對不同處理間的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（α=0.05）。采用Origin 8.5軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1PAM降解菌的分離及鑒定

通過平板脅迫馴化法分離篩選出2株P(guān)AM優(yōu)勢降解菌，分別命名為PAM1和PAM5。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在以PAM為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d時(shí)各處理中PAM的降解率達(dá)到穩(wěn)定，PAM1、PAM5菌株對PAM的降解率分別為28.1%、30.8%，PAM1和PAM5進(jìn)行1 ∶1復(fù)配對PAM的降解率能夠達(dá)到37.7%，所以采用PAM1與PAM5菌株 1 ∶1 復(fù)配進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。經(jīng)測序后獲得PAM1菌株 1 450 bp 的16S rDNA序列，序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對后發(fā)現(xiàn)，與Comamonas kerstersii相似度達(dá)到99%；PAM5菌株 1 437 bp 的16S rDNA序列通過BLAST與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行序列搜索比對發(fā)現(xiàn)，它與Comamonas terrigena的相似度達(dá)到98%。

2.2同一濃度下蚯蚓與細(xì)菌對土壤中PAM降解的動態(tài)影響

本試驗(yàn)研究土壤中3種不同PAM初始污染濃度下各處理（CK、B、BE和E）對PAM降解的動態(tài)影響。從圖2可以看出，土壤中PAM的初始污染濃度為2 mg/g時(shí)，各處理中PAM的降解率均隨時(shí)間的增加而升高；BE處理在培養(yǎng)12 d時(shí)，PAM降解率提升得很快，之后PAM的降解率緩慢升高；B處理和E處理的PAM降解率變化較為緩和；CK處理24 d后，土壤中PAM降解率僅為2.94%，顯著低于其他處理；BE處理中同時(shí)段PAM的降解率始終高于其他處理，B處理次之。結(jié)果表明，篩選出的降解菌在去除土壤中PAM的過程中起主要作用，同時(shí)蚯蚓可以進(jìn)一步促進(jìn)PAM降解菌對土壤中PAM的降解。這是由于微生物本身的移動性小，蚯蚓可以成為散布微生物的工具，蚯蚓體壁可附著微生物，伴隨蚯蚓的取食、排泄和挖掘活動，給微生物的傳播提供了條件。此外微生物降解有機(jī)污染物的過程實(shí)質(zhì)上是還原物質(zhì)失去電子的氧化過程，而微生物利用分子氧作為末端電子受體時(shí)，污染物被降解得最徹底（分解產(chǎn)物為CO2和H2O），蚯蚓的挖掘和活動能很好地改善土壤通氣，為微生物降解有機(jī)污染物提供良好的通氣條件。

當(dāng)土壤中PAM的初始污染濃度為4 mg/g時(shí)，各處理降解率比較規(guī)律地提升；培養(yǎng)后期（12～24 d），E處理中PAM降解率顯著高于CK處理，這表明蚯蚓自身可能有促進(jìn)土壤中PAM降解的能力；培養(yǎng)24 d后，各處理間PAM降解率差異顯著且排序?yàn)锽E>B>E>CK（圖3）。

在土壤中PAM的初始污染濃度為6 mg/g時(shí)，培養(yǎng)24 d后BE和B處理的降解率要比其他處理高（P<0.05）；BE和B處理在培養(yǎng)12 d時(shí)，降解率都有顯著的提高，PAM的減少主要發(fā)生在培養(yǎng)0～12 d時(shí)段，之后PAM的降解速率減緩；此外，對于未接種PAM降解菌的CK和E處理中，PAM降解速度較為緩和（圖4）。

2.3不同PAM污染濃度下蚯蚓與細(xì)菌對PAM降解的影響

培養(yǎng)24 d后，不同污染濃度下土壤中PAM的降解率見表1，可見在3種污染濃度（2、4、6 mg/g）下，CK處理PAM的降解率均為最低，其他處理PAM降解率均顯著高于對照組，其中BE處理對PAM的降解率最高，分別為38.24%、3650%、32.28%，與CK處理相比，分別提高了35.30、3397、29.90百分點(diǎn)；B、BE處理與E處理相比也都存在顯著差異（P<0.05）；各處理對土壤中PAM的降解效果排序依次為BE>B>E>CK。研究表明，單獨(dú)加入蚯蚓、細(xì)菌以及同時(shí)接入蚯蚓和細(xì)菌都能顯著促進(jìn)土壤中PAM的降解。接種細(xì)菌以及同時(shí)接入細(xì)菌和蚯蚓的處理比單獨(dú)接入蚯蚓處理的促進(jìn)作用更加顯著。處理BE和B中，隨著土壤中PAM初始污染濃度的增加，對PAM的降解率均有下降。可能是因?yàn)镻AM濃度過高影響了土壤的透氣性，也易引起土壤板結(jié)，不利于蚯蚓的活動與呼吸，同時(shí)影響了降解菌的繁殖及擴(kuò)散。處理E中，隨污染濃度的增加，對PAM的降解率產(chǎn)生波動。

3結(jié)論與討論

微生物在降解PAM過程中起著舉足輕重的作用，主要是依靠它們產(chǎn)生特定酶，以PAM為營養(yǎng)源，在菌株生長及代謝過程中，將PAM降解為小分子有機(jī)物和無機(jī)物。目前有關(guān)PAM降解的研究主要針對液相如污水、采油廢水。魏利等從油田采出液中分離出硫酸鹽還原性PAM降解菌，20 d時(shí)對液相中的PAM降解率為61.2%[19-21]。包木太等從活性污泥中分離出的海球菌屬PAM降解菌，在最佳條件下5 d對溶液相中的PAM降解達(dá)到45.23%[20]。本研究表明，篩選出的2株降解菌1 ∶1復(fù)合培養(yǎng)7 d對PAM的降解率為37.7%，而僅向土壤中外源添加PAM降解菌（處理B）對土壤中不同PAM初始濃度的降解率分別為28.68%、2722%、 24.87%，低于溶液相中PAM的降解率。這是由于土壤中通氣條件不佳、含氧量低、微生物在土壤中擴(kuò)散相對不充分等原因所致[21-22]。

蚯蚓作為土壤動物最大的常見類群之一，是土壤可持續(xù)利用的關(guān)鍵生物種，是生態(tài)系統(tǒng)的重要物質(zhì)分解者，在促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)和改善土壤性狀方面發(fā)揮著巨大作用。目前，利用蚯蚓等土壤動物輔助微生物修復(fù)土壤有機(jī)污染物技術(shù)是一種新型原位生態(tài)修復(fù)技術(shù)[23-24]。本試驗(yàn)表明，當(dāng)土壤中PAM濃度為2、4、6 mg/g時(shí)，BE處理對PAM的降解率分別為38.24%、36.50%、32.28%，與B處理相比，分別提高了 9.56、9.28、7.41百分點(diǎn)，說明蚯蚓可以顯著提高微生物對土壤中PAM的降解率。與此類似，Asgharnia等研究表明，蚯蚓可以顯著促進(jìn)菲降解菌對土壤中菲的降解[25]。Li等研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓能夠使土壤中五氯酚（PCP）降解菌的數(shù)量增加，從而促進(jìn)對PCP的降解[26]。蚯蚓在土壤中的運(yùn)動、取食及穿孔作用可以改善土壤物理結(jié)構(gòu)，增加土壤的透氣性和透水性，使更多的氧進(jìn)入土壤中，這就為提供更多降解過程所必需的終端電子受體提供了可能[27]。從土壤的結(jié)構(gòu)和形狀方面分析，通過蚯蚓在土壤中的生物擾動作用，可以使土壤不斷混合，有助于微生物的傳播和擴(kuò)散，還能增加微生物與污染物接觸的機(jī)會[28-29]。有研究表明，蚯蚓能通過取食行為，將有機(jī)污染物從土壤表面轉(zhuǎn)移[10]。除此之外，蚯蚓在土壤中活動的同時(shí)會排出富含營養(yǎng)成分的蚯蚓糞，還會以黏蛋白、氨和尿素等形式分泌一些黏性物質(zhì)，這些排泄物和分泌物不僅可以增強(qiáng)微生物的活性，還可增加它們的生物量[24]。

篩選出2株P(guān)AM降解菌，通過16S rDNA序列分析，初步鑒定PAM1為Comamonas kerstersii，PAM5為Comamonas terrigena。同一PAM初始濃度，各處理中PAM的降解率均隨時(shí)間的增加而升高，培養(yǎng)24 d后對PAM的降解率差異顯著，降解效果依次為BE>B>E>CK。表明單獨(dú)加入蚯蚓、接種細(xì)菌以及同時(shí)接入蚯蚓和細(xì)菌都能顯著促進(jìn)土壤中PAM的降解。接種細(xì)菌及同時(shí)接入蚯蚓和細(xì)菌的處理比單獨(dú)加入蚯蚓處理的促進(jìn)作用更顯著。蚯蚓與細(xì)菌的協(xié)同作用能進(jìn)一步促進(jìn)土壤中PAM的降解。不同PAM初始濃度下，CK、BE和B處理對PAM的降解隨著初始污染濃度的增加而降低，E處理對PAM的降解率隨污染濃度的增加僅產(chǎn)生波動。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.068