百里香精油和多抗霉素對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌病原菌的抑制作用研究

張阿強(qiáng)+田永強(qiáng)+劉震飛+潘彥彪

摘要：為了研究百里香精油和多抗霉素對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌的抑制效果，采用菌絲生長(zhǎng)速率抑制法，測(cè)試了百里香精油和多抗霉素對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌菌絲的抑制效果，并研究了兩者的協(xié)同抑菌作用。結(jié)果表明：百里香精油和多抗霉素均可有效抑制馬鈴薯立枯絲核菌，兩者最小抑菌濃度MIC分別為0.6422微升/毫升、0.9393微升/毫升，且兩者表現(xiàn)出明顯的協(xié)同抑菌效果，為生物制劑的開發(fā)提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：百里香精油；多抗霉素；協(xié)同作用；抗真菌活性；立枯絲核菌

中圖分類號(hào)： TS201.3 獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.08.030

傳統(tǒng)農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)作物病蟲害預(yù)防與防治、保證農(nóng)作物穩(wěn)定高產(chǎn)方面發(fā)揮了重要作用。但是，隨著人們長(zhǎng)期大量使用抗生素類農(nóng)藥，病原菌產(chǎn)生抗藥性問(wèn)題日益受到廣泛關(guān)注[1，2]。因而針對(duì)植物病害的植物源農(nóng)藥的研究與開發(fā)成為當(dāng)今農(nóng)藥研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)[3-5]。百里香精油作為其中一種高效的植物源抑菌藥物，受到廣大科研工作者的青睞。百里香精油已被證明具有廣譜的抑菌性能，可以有效抑制食品上的曲霉與李斯特菌，傷口上包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在內(nèi)的細(xì)菌[6-8]。

馬鈴薯立枯絲核菌病，又稱黑痣病、莖潰瘍病、莖基腐病、黑色粗皮病，是通過(guò)帶病種薯和土壤傳播的。隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，該病的發(fā)病率逐年升高，目前已成為阻礙馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要病害之一。該病害的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），可以侵染不同器官，引起多種癥狀，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的商品性和貯藏性[9-11]。

本文以馬鈴薯立枯絲核菌菌為供試菌株，測(cè)試了在體外條件下百里香精油及多抗霉素對(duì)馬鈴薯立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，并研究了百里香精油與多抗霉素的協(xié)同抑菌作用。

1 材料與方法

1.1材料儀器

供試菌株：馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani）菌種，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：無(wú)水乙醇、葡萄糖、Tween-80均為國(guó)產(chǎn)分析純，百里香精油購(gòu)自江西華美香料。

儀器設(shè)備：電子天秤（YP102N 上海精科儀器）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2D 蘇州凈化）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50F 上海申安）、培養(yǎng)箱（MJ-250-I 上海一恒）、分析天平（FA1204B 上海精科儀器）。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基與藥品準(zhǔn)備 PDA培養(yǎng)基：200克土豆去皮、切塊煮爛后，紗布過(guò)濾，加入20克葡萄糖、16克瓊脂，1000毫升蒸餾水，pH值自然。

100倍百里香精油配制：以無(wú)水乙醇為溶劑，將百里香精油分別稀釋為10μL/mL、20μL/mL、30μL/mL，同時(shí)向其中添加20μL/mL的吐溫-80，經(jīng)20μm膜過(guò)濾除菌后備用。

100倍多抗霉素配制：用蒸餾水將多抗霉素分別配制成10mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL的溶液，經(jīng)20μm膜過(guò)濾除菌后備用。

1.2.2菌種活化 在無(wú)菌條件下，從保藏的斜面菌種中挑取馬鈴薯立枯絲核菌菌塊，接入PDA培養(yǎng)基平板上。28℃培養(yǎng)120小時(shí)，備用。

1.2.3百里香精油抑菌活力測(cè)定 經(jīng)121℃高溫蒸汽滅菌20分鐘的PDA培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)上冷卻至55℃左右時(shí)，按100毫升培養(yǎng)基添加1毫升100倍百里香精油的量，分別添加不同濃度的百里香精油。輕輕搖勻后倒入90毫米的培養(yǎng)皿中，制成含不同濃度百里香精油的平板。再用滅菌的5毫米打孔器在上述活化的馬鈴薯立枯絲核菌平板上打取菌餅，用鑷子將菌柄分別倒貼于含不同濃度百里香精油的平板上，對(duì)照組使用等體積的無(wú)水乙醇代替精油。置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，并分別在72小時(shí)、96小時(shí)和120小時(shí)按十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.4多抗霉素抑菌活力測(cè)定 經(jīng)121℃高溫蒸汽滅菌20分鐘的PDA培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)上冷卻至55℃左右時(shí)，按100毫升培養(yǎng)基添加1毫升100多抗霉素的量，分別添加不同濃度的多抗霉素。輕輕搖勻后倒入90毫米的培養(yǎng)皿中，制成含不同多抗霉素的平板。用滅菌的5毫米打孔器在馬鈴薯立枯絲核菌平板上打取菌餅，然后用鑷子將菌餅分別倒貼于含不同濃度多抗霉素的平板上，對(duì)照組使用等體積的無(wú)菌水代替多抗霉素。置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，并分別在72小時(shí)、96小時(shí)和120小時(shí)按十字交叉法測(cè)量菌落直徑[12]。

1.2.5百里香精油與多抗霉素協(xié)同作用測(cè)定 經(jīng)121℃高溫蒸汽滅菌20分鐘的PDA培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)上冷卻至55℃左右時(shí)，按100毫升培養(yǎng)基添加1毫升濃度為20 mg/mL的多抗霉素。然后再分別加入1毫升濃度為10μL/mL、20μL/mL、30μL/mL的百里香精油。輕輕搖勻后倒入90毫米的培養(yǎng)皿中，制成含0.2mg/mL多抗霉素的平板及不同濃度的百里香精油的平板。用滅菌的5毫米打孔器在馬鈴薯立枯絲核菌平板上打取菌餅，然后用鑷子將菌餅分別倒貼于平板上，對(duì)照組用等體積的無(wú)菌水和無(wú)水乙醇代替多抗霉素和百里香精油。置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，并分別在72小時(shí)、96時(shí)小時(shí)和120小時(shí)按十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.6數(shù)據(jù)分析 菌絲生長(zhǎng)抑菌率按如下公式計(jì)算：

菌落增長(zhǎng)直徑=菌落直徑-接種菌餅直徑

測(cè)量結(jié)果利用origin8.5軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出毒力方程、相關(guān)系數(shù)、MIC、EC50[12]。

2結(jié)果與分析

2.1百里香精油對(duì)馬鈴薯立枯絲核病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性

由圖1可以看出，百里香精油隨著濃度的增大其抑菌效果逐漸增加，在濃度為0.4 μL/mL時(shí)，抑菌率達(dá)到100%。在百里香精油濃度大于0.2 μL/mL時(shí)，對(duì)馬鈴薯立枯絲核病原菌有顯著的抑制作用。在濃度為0.1 μL/mL至0.3 μL/mL時(shí)，抑菌效果由快變緩，在濃度大于0.3 μL/mL時(shí)，抑菌效果由緩變快。抑菌效果隨著時(shí)間呈延長(zhǎng)下降趨勢(shì)，在百里香精油的濃度為0.4 μL/mL時(shí)，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抑菌濃度為100%，無(wú)變化。利用試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在72小時(shí)的毒力方程為：Y=1.2775x+0.1796，r=0.9649，得出百里香精油對(duì)馬鈴薯立枯絲核病原菌的EC50為0.2509 μL/mL，MIC為0.6422 μL/mL。

2.2多抗霉素對(duì)馬鈴薯立枯絲核病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性

由圖2可以看出，在濃度為1.0 mg/mL時(shí)，抑菌率達(dá)到最大值，為100%。在濃度大于0.5 mg/mL時(shí)抑菌效果由快變緩。抑菌效果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯的下降趨勢(shì)，在百里香精油的濃度為1.0 mg/mL時(shí)，三個(gè)時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)的抑菌濃度接近100%，沒(méi)有明顯的變化。利用試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在72小時(shí)時(shí)的曲線毒力方程為Y=0.9177x+0.1380，r=0.9416，計(jì)算結(jié)果表明多抗霉素對(duì)馬鈴薯立枯絲核病原菌的EC50為0.3944 mg/mL，MIC為0.9393 mg/mL。

2.3百里香精油和多抗霉素對(duì)馬鈴薯立枯絲核病原菌菌絲生長(zhǎng)的協(xié)同抑制活性

馬鈴薯立枯絲核在百里香精油濃度為0.05 μL/mL時(shí)培養(yǎng)觀察120小時(shí)的抑菌率為20.76%，多抗霉素濃度為0.1 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)120小時(shí)時(shí)的抑菌率為7.27%，兩者的抑菌率均小于10%，但是百里香精油和多抗霉素在此濃度下的協(xié)同抑菌效果到了93.22%，表現(xiàn)出顯著的協(xié)同抑菌效果。

3結(jié)論

本試驗(yàn)表明，在體外條件下百里香精油可以有效地抑制馬鈴薯立枯絲核菌病原菌菌絲的生長(zhǎng)，在較低濃度下（0.4μL/mL）即可完全抑制其菌絲的生長(zhǎng)。研究顯示，百里香精油還擁有廣譜的抑菌作用，因此百里香精油具有開發(fā)為高效抑菌的植物源農(nóng)藥的潛力。試驗(yàn)還表明，百里香精油與抗真菌類抗生素多抗霉素之間具有協(xié)同作用，二者配合使用可以顯著地提高抑菌效率，降低藥物使用量，為生物農(nóng)藥的開發(fā)提供依據(jù)。

另外，從試驗(yàn)中可以看出，百里香精油的抑菌效果隨時(shí)間的推移而下降，這與精油易揮發(fā)的性質(zhì)有關(guān)。所以，要想高效利用百里香精油作為抑菌農(nóng)藥，還需探索其使用方式，以避免其揮發(fā)浪費(fèi)。

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作者簡(jiǎn)介：張阿強(qiáng)，在讀碩士研究生，研究方向：資源與環(huán)境微生物。