中西藥聯(lián)合對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌體外抗菌作用研究

房華++++++汪瑞忠++++++張曉雪++++++楊柳++++++汪海剛

[摘要] 目的 研究中西藥聯(lián)合對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌（MDR-PA）抗菌作用，為臨床中西藥聯(lián)合治療MDR-PA感染提供依據(jù)。 方法 赤芍、五倍子、野菊花、魚腥草、小檗堿，煎煮法制備提取液，采用兩倍稀釋法觀察中藥對(duì)細(xì)菌的抑菌效果；采用棋盤格稀釋法測(cè)定中西藥的MIC，通過計(jì)算部分聯(lián)合抑菌指數(shù)（FIC）的分布評(píng)價(jià)中西藥聯(lián)合效果。 結(jié)果 五種中藥對(duì)MDR-PA有不同程度抑菌作用，五倍子對(duì)MDR-PA抑菌作用最強(qiáng)；亞胺培南與小檗堿、頭孢他啶與五倍子聯(lián)合有較好的協(xié)同相加作用，協(xié)同相加率超過80%。環(huán)丙沙星與五種中草藥聯(lián)合顯示無關(guān)作用；三種抗生素與五種中草藥聯(lián)合均無拮抗作用。 結(jié)論 赤芍、五倍子、野菊花、魚腥草、小檗堿對(duì)MDR-PA有不同程度抑制作用；亞胺培南與小檗堿、頭孢他啶與五倍子聯(lián)合可以增加各自對(duì)MDR-PA抗菌作用的敏感性。

[關(guān)鍵詞] 中西藥聯(lián)合；多重耐藥銅綠假單胞菌；抗菌活性；協(xié)同作用

[中圖分類號(hào)] R969.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）31-0107-04

[Abstract] Objective To study the antimicrobial effect of integrated Chinese and western medicine on multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）， and provide the clinical basis for the integrated Chinese and western medicine treatment of MDR-PA infection. Methods Extract liquid from Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine was prepared by decocting method. The antibacterial effect of traditional Chinese medicine on bacteria was observed by double dilution method. The MIC of Chinese and western medicine was determined by checkerboard dilution method. The effect of integrated Chinese and western medicine was evaluated by calculating the distribution of partial fractional inhibitory concentration （FIC）. Results Five types of traditional Chinese medicine had different degrees of antibacterial effect on MDR-PA， in which the antibacterial effect of Chinese Gall on MDR-PA was the strongest； imipenem had a favorable synergistic effect with berberine， ceftazidime and Chinese Gall， and the synergistic rate combined was over 80%. Ciprofloxacin combined with the five Chinese herbs showed no effect； three types of antibiotics combined with five types of Chinese herbs had no antagonistic effect. Conclusion Radix Paeoniae Rubra， Chinese Gall， wild chrysanthemum， Houttuynia cordata， berberine have different degrees of inhibitory effect on MDR-PA. The combination of imipenem with berberine， ceftazidime and Chinese Gall can increase their susceptibility to antibacterial effect against MDR-PA.

[Key words] Integrated Chinese and western medicine； Multi-drug resistant pseudomonas aeruginosa（MDR-PA）； Antimicrobial activity； Synergistic effect

銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌，也是院內(nèi)感染重要致病菌之一，常引起呼吸道感染、尿路感染、傷口感染、敗血癥等。隨著廣譜抗菌藥在臨床的廣泛使用，近年來多重耐藥銅綠假單胞菌分離率不斷上升，已成為臨床感染治療的難題。我國(guó)中醫(yī)中藥治療疾病已有千年歷史，不少中藥具有抗菌、抑菌活性、逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性。為了研究中西藥聯(lián)合對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa MDR-PA，）抗菌作用，本文選取五種抗菌作用較好的中草藥分別與臨床常用抗生素進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，旨在為臨床中西藥聯(lián)合治療MDR-PA感染提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法endprint

1.1 菌株來源

2015年5月～2016年12月臨床分離鑒定的30株MDR-PA（剔除重復(fù)分離菌株），30株臨床菌株通過法國(guó)梅里埃VITEK2-Compact鑒定與藥敏檢測(cè)。標(biāo)本構(gòu)成：痰液17株、尿液6株、傷口分泌物4株、血液3株（MDR菌株參照相關(guān)文獻(xiàn)[1] 的判斷標(biāo)準(zhǔn)）。質(zhì)控菌株：ATCC27853，購(gòu)自上海市臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 中藥水煎劑

赤芍、五倍子、野菊花、魚腥草（購(gòu)自養(yǎng)和堂藥房），小檗堿（粉劑，中國(guó)藥品生物檢定所），M-H肉湯（購(gòu)自上海伊華公司）、常用抗生素均由本院藥劑科提供。

1.3 方法

1.3.1 中藥原液的制備 分別稱取上述中藥50 g，按5倍量加入蒸餾水浸泡，4℃冰箱內(nèi)放置24 h后，加熱100 ℃ 30 min，過濾，將濾渣再加5倍水加熱100 ℃ 30 min。將兩次濾液混合加熱濃縮至50 mL，生藥含量為1 g/mL，調(diào)節(jié)pH為7.6，離心后留取上清，進(jìn)行高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，參考穆廷杰[2]的中藥原液制備方法。

1.3.2 菌懸液制備 MDR-PA菌株復(fù)蘇后，從18～24 h 35℃培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上挑選幾個(gè)菌落于生理鹽水中，調(diào)到0.5麥?zhǔn)蠞舛龋?.5×108 CFU/mL），稀釋30倍，向兩倍稀釋好的藥液的1～11支試管加100 μL菌懸液，最終接種量為5×105 CFU/mL。

1.3.3 藥液的倍比稀釋 中草藥抗菌實(shí)驗(yàn)采用中草藥抗菌實(shí)驗(yàn)試管法，參照相關(guān)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。藥液采用2倍稀釋法，即取72支無菌試管，每組12支編號(hào)，每管加1 mL肉湯；取上述中藥原液，先在第一管加1 mL，混勻后加入第二管中，以此類推，至第10管吸出1 mL棄去，使1～10管含有倍比稀釋的藥液為1：2，1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512，1：1024。

1.3.4 加菌 MDR-PA菌株復(fù)蘇后，從18～24 h 35℃培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上挑選幾個(gè)菌落于生理鹽水中，調(diào)到0.5麥?zhǔn)蠞舛龋?.5×108 CFU/mL），稀釋30倍，向兩倍稀釋好的藥液的1～11支試管加100 μL菌懸液，最終接種量為5×105 CFU/mL，第11管為陽(yáng)性對(duì)照管，第12管不加菌為陰性對(duì)照管。

1.3.5 中草藥抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀 35℃孵育18～24 h后觀察，陽(yáng)性對(duì)照管長(zhǎng)菌需呈渾濁狀，而肉湯空白對(duì)照管不長(zhǎng)菌呈透明清亮狀，在此前提下觀察實(shí)驗(yàn)組的渾濁情況，MIC 是用肉眼在試管中所見能完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低抗菌藥物濃度。

1.3.6 中西藥聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)采用棋盤格微量稀釋法檢測(cè)藥物的聯(lián)合作用，采用9個(gè)稀釋度，藥物最高濃度為其MIC的4倍，依次倍比稀釋為1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256倍濃度，兩種藥物分別在96孔培養(yǎng)板上按縱列和橫列進(jìn)行聯(lián)合。接種菌量為5×105 CFU/mL，35℃孵育18～24 h后觀察結(jié)果。

1.3.7 聯(lián)合抑菌效應(yīng)判斷 根據(jù)部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）分布判斷聯(lián)合用藥效果。FIC的計(jì)算：FIC=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用，其中MIC為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。結(jié)果判斷：（1）FIC指數(shù)≤0.5判定甲乙兩藥為協(xié)同作用；（2）0.52判定甲乙兩藥為拮抗作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，中西藥聯(lián)合與單獨(dú)使用時(shí)MIC數(shù)據(jù)為呈正態(tài)分布的計(jì)量資料，采用（x±s）表示，比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中藥單藥抗菌作用

五種中藥對(duì)MDR-PA均有不同程度抑菌作用，抑菌效價(jià)為五倍子512～1024，魚腥草32～64，野菊花8～16，赤芍4～8，小檗堿2～4，抑菌作用強(qiáng)弱順序?yàn)槲灞蹲?gt;魚腥草>野菊花>赤芍>小檗堿。

2.2 中西藥聯(lián)合用藥時(shí)FIC指數(shù)分布

通過計(jì)算FIC值評(píng)價(jià)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)效果，得出30株MDR-PA對(duì)不同中西藥物組合時(shí)FIC指數(shù)分布。亞胺培南與小檗堿聯(lián)合效果最佳，60%菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，40%菌株呈現(xiàn)相加作用，頭孢他啶與五倍子聯(lián)合有30%菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，50%菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，協(xié)同相加率超過80%。環(huán)丙沙星與五種中草藥聯(lián)合顯示無關(guān)作用；三種抗生素與五種中草藥聯(lián)合均無拮抗作用。見表1。

2.3 不同中西藥組合單獨(dú)與聯(lián)合使用情況下MIC值比較

頭孢他啶與五倍子組、亞胺培南與小檗堿組單獨(dú)與聯(lián)合使用情況下MIC值的比較，中西藥聯(lián)合時(shí)用藥量低于單獨(dú)使用時(shí)用藥量。采用配對(duì)t檢驗(yàn)，兩者存在顯著性差異（P<0.05）。見表2。

3 討論

銅綠假單胞菌是革蘭陰性非發(fā)酵菌，是一種條件致病菌。隨著廣譜抗生素碳青霉烯類藥物在臨床廣泛及不合理應(yīng)用，多重耐藥菌不斷增加甚至出現(xiàn)泛耐藥菌株[4]，MDR-PA存在金屬酶、外排泵、膜孔蛋白改變等復(fù)雜的耐藥機(jī)制，單一抗菌藥物治療往往失敗，尤其是泛耐藥銅綠假單胞菌需要多種藥物聯(lián)合治療[5，6]。新藥的研發(fā)速度遠(yuǎn)跟不上細(xì)菌耐藥的速度，加之很多抗生素有很大的毒副作用，給臨床抗感染治療帶來極大困難[7]。中藥抗菌作用有著悠久的歷史，近年來的研究已經(jīng)表明，中藥的確有抗菌、延緩、消除細(xì)菌耐藥性的作用[8-10]。中藥的抗菌機(jī)制可以分為兩類，一類是通過各種途徑直接對(duì)細(xì)菌進(jìn)行抑制；第二類是通過提高人體的免疫力來抗菌。對(duì)中藥提高人體免疫力抗菌的這種間接方式研究較少；目前專注于中藥藥物直接抗菌作用研究較多，也取得了許多成果。許多抗菌抑菌的中藥材，一種藥材中可能含有多種抑菌抗菌的活性成分，有多種抑菌抗菌的作用靶點(diǎn)，細(xì)菌不易對(duì)這樣的單一中藥材產(chǎn)生抗藥性突變[11]。某些中藥的抑菌成分，可能通過多條抑菌殺菌途徑起作用，也具有多種作用靶點(diǎn)，如金建玲等[12]發(fā)現(xiàn)小檗堿能與細(xì)菌核酸結(jié)合而具有抑制細(xì)菌DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等多項(xiàng)功能，能與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合并因此干擾多種酶的活性[13]，還能增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性[14]。近幾年，中藥逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制作為中藥抗菌研究的一個(gè)新的鄰域悄然興起，也有了一定的成果，這就給醫(yī)療帶來巨大的想象空間，中藥聯(lián)合可否改變即將面臨無藥可用的尷尬局面？為了發(fā)揮中西藥在抗菌治療方面的各自優(yōu)勢(shì)，本課題從中西藥聯(lián)合使用角度來探索治療多重耐藥銅綠假單胞菌方法。

從本研究結(jié)果上看，五種中藥提取物對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌具有一定抗菌作用，與相關(guān)文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，五倍子抗菌效果最好，抑菌效價(jià)達(dá)到215～1024，抑菌作用由強(qiáng)至弱為：五倍子>魚腥草>野菊花>赤芍>小檗堿。對(duì)30株MDR-PA的中西藥聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，亞胺培南與小檗堿聯(lián)合效果最佳，協(xié)同相加率為100%，亞胺培南的藥物濃度平均降低至原來2/3，小檗堿的藥物濃度從275 mg/mL降至20.80 mg/mL（P<0.01）；頭孢他啶與五倍子聯(lián)合協(xié)同相加率為80%，頭孢他啶與五倍子藥物濃度平均降低至原來濃度1/2（P<0.05）；環(huán)丙沙星與五種中草藥聯(lián)合顯示無關(guān)作用；三種抗生素與五種中草藥聯(lián)合均無拮抗作用。中草藥蒸煮提取物成分復(fù)雜，使用劑量也比較大[16]，恰當(dāng)?shù)闹形魉幝?lián)合將大幅提高中藥與西藥的抗菌抑菌能力。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，中藥活性成分的提取物也得到迅速發(fā)展。提高中草藥活性成分的抗菌效價(jià)，必將使中藥在抗菌治療方面得到長(zhǎng)足發(fā)展。發(fā)揮中西藥聯(lián)合使用在對(duì)抗細(xì)菌抗藥性方面的優(yōu)勢(shì)是目前抗菌治療的新的方向，中西藥配伍對(duì)臨床常見菌株有良好的體外抗菌作用[17]。中藥的水煎液與含藥血清與抗生素聯(lián)合使用均有較好的效果，石慶新等[18]發(fā)現(xiàn)中藥聯(lián)用可以大大提高亞胺培南對(duì)耐藥菌的抑菌和殺菌作用，這與本研究結(jié)果基本一致。中藥的成分復(fù)雜，在體內(nèi)可能通過各種代謝途徑發(fā)揮其抗菌作用，如促進(jìn)細(xì)胞的抗原遞呈作用，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力；或發(fā)揮中藥的免疫調(diào)理作用，影響機(jī)體的健康狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體微生態(tài)造成影響。雖然本文利用中西藥對(duì)細(xì)菌的體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，反映中西藥對(duì)細(xì)菌的直接抗菌作用，但也可說明中藥的某些成分與西藥有協(xié)同抗菌作用。臨床實(shí)踐中，中西藥聯(lián)合治療疾病的例子有許多，如腸炎[19]、胃炎[20]、腎盂腎炎[21]、盆腔炎[22]等的治療。這也間接證明本研究中西藥聯(lián)合治療多重耐藥銅綠假單胞菌感染的可行性。

總之，中藥研究已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，中藥的現(xiàn)代化也已列入國(guó)家中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃。中西藥聯(lián)合使用成為緩解和控制細(xì)菌耐藥性難題的一條可行途徑。中西藥聯(lián)合在治療多重耐藥菌或泛耐藥菌感染方面也應(yīng)該得到發(fā)展，這方面的研究應(yīng)該得到關(guān)注。

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（收稿日期：2017-08-12）endprint