密毛山梗菜內(nèi)生放線菌的分離、鑒定及對香蕉枯萎病的防效

楊李玲+陳宇豐+周登博+高祝芬+黃綿佳+張錫炎

摘要：從我國云南地區(qū)采集藥用植物密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）植株為樣品，采用稀釋涂布平板法進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離，以香蕉枯萎病菌4號小種為靶標(biāo)菌，通過平板對峙試驗(yàn)，篩選出對尖孢鐮刀菌菌絲生長抑制作用最強(qiáng)的生防菌株2株，通過形態(tài)觀察、生理生化特性比對并結(jié)合 16S rDNA 序列分析對這2種菌株進(jìn)行鑒定，采用濾紙片擴(kuò)散法測定其內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物對感病香蕉的抑菌活性。結(jié)果表明：經(jīng)鑒定DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1 菌株為Streptomyces celluloflavus（纖維黃鏈霉菌），這2種菌株對香蕉枯萎病菌菌絲抑制率分別為 5446%、 7012%。所分離的菌株對多種植物病原真菌均有抑制效果，為無環(huán)境公害型微生物資源的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：密毛山梗菜；內(nèi)生放線菌；香蕉枯萎菌；鑒定；次生代謝產(chǎn)物；抗菌活性

中圖分類號： S436.68+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0199-04

密毛山梗菜（Lobelia clavata E.Wimm.）為半邊蓮科半邊蓮屬植物，民間用于治療腮腺炎、跌打損傷、風(fēng)濕痛、疹癥，全草或根、葉（有毒）藥用，分布于云南西南部至南部。其提取物中分離的齊墩果酸存在于許多中草藥中，生理活性較為廣泛，對其結(jié)構(gòu)修飾后合成的齊墩果酸磷酸醋單鈉，經(jīng)體外藥理試驗(yàn)證實(shí)，其抗腫瘤活性比齊墩果酸高5倍[1-2]。

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，簡稱Foc）侵染而引起的危害香蕉生產(chǎn)的毀滅性土傳真菌病害，該病可導(dǎo)致植物莖葉萎蔫，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，是世界上分布最廣、危害最大、造成損失最嚴(yán)重的植物土傳病害之一[3]。為了減少化學(xué)肥料和農(nóng)藥的使用，應(yīng)用生物防治方法對香蕉枯萎病進(jìn)行綜合防控已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[4]。戴青冬等對抗香蕉枯萎病生防菌進(jìn)行了篩選及生防效應(yīng)方面的研究[5]。胡偉等報(bào)道了添加生防菌株解淀粉芽孢桿菌的生物有機(jī)肥在不同耕作模式下對香蕉生長和香蕉枯萎病防治效果的影響，發(fā)現(xiàn)這種菌株有機(jī)肥能降低香蕉枯萎病病情指數(shù)[6]。目前防治香蕉枯萎病的生防菌株主要有以下幾大類：生防細(xì)菌、生防真菌、生防放線菌等[7-9]。本研究以云南密毛山梗菜作為試驗(yàn)材料，分離出2株對香蕉枯萎病菌具有較好拮抗效果的內(nèi)生放線菌DJ15、XLG-1。通過形態(tài)觀察、生理生化特性比對并結(jié)合 16S rDNA 序列分析對該菌株進(jìn)行鑒定，對其進(jìn)行抗菌活性和次級代謝產(chǎn)物活性進(jìn)行研究，為其今后應(yīng)用于香蕉枯萎病的防治提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集密毛山梗菜植株樣品采集于云南省西雙版納植物園（地理位置109°51′17″E、19°47′1″N），樣品分為根、莖、葉3份，采集后混勻，置于無菌封口袋中，封口，放入冰盒中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌DNA 提取試劑盒，北京博邁德生物公司生產(chǎn)的Taq DNA聚合酶，愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的PCR產(chǎn)物純化試劑盒；引物合成、測序由華大基因完成。

1.1.3供試病原菌本研究篩選拮抗菌所用病原菌為香蕉枯萎病菌4號小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）。放線菌多抗性測試病原菌有香蕉長形斑病原菌（Curvularia fallax）、香蕉大灰斑病原菌（Curvularia lunata）、香蕉炭疽病原菌（Colletotrichum musae）、草莓炭疽病原菌（C. fragariae）、辣椒炭疽病原菌（C. acutatum）、膠孢炭疽病原菌（C. gloeosporioides）、香蕉樹木潰瘍病原菌（Botoryosphaeria dothidea）、貢蕉煙頭病原菌（Fusarium spp.）、香蕉葉緣枯斑病原菌（Alternaria musae）。此外，還有灰葡萄孢菌病原菌（Botrytis cinerea）等。菌源均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.4供試培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基進(jìn)行分離，滅菌后在1 L培養(yǎng)基中加入3 mL經(jīng)過過濾除菌處理的1%重鉻酸鉀溶液、0.5 mL 5%制霉菌素；采用酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基純化菌株、保藏，同時(shí)進(jìn)行形態(tài)觀察；采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行平板對峙培養(yǎng)；采用酵母膏麥芽膏（YE）液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株發(fā)酵。

1.2內(nèi)生放線菌的分離

具體分離方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.3拮抗放線菌的篩選

具體篩選方法參照文獻(xiàn)[11]。

1.4菌株鑒定

1.4.1形態(tài)與培養(yǎng)特征觀察具體方法參照文獻(xiàn)[12-14]。

1.4.2生理生化特征具體方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.4.3系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取樣品DNA；采用細(xì)菌通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3′）進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增；產(chǎn)物純化后測定基因序列；采用EzTaxon與GenBank搜索序列相似性，選取相似性最高的模式菌序列，用MEGA5.0中的鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）法比較同源性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5菌株抗菌活性評價(jià)

1.5.1平板對峙對病原菌的拮抗作用將拮抗放線菌與香蕉炭疽病菌等11種病原真菌于28 ℃對峙培養(yǎng)7～14 d，以不接拮抗菌的平板為對照，每個(gè)處理3次重復(fù)，以抑菌帶寬度來衡量菌株對病原真菌的抑制作用。

1.5.2混合菌液對病原菌的拮抗作用以及對病原菌菌絲生長、分生孢子萌發(fā)的抑制作用具體方法參照文獻(xiàn)[16-17]。

1.5.3次生代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用具體方法參照文獻(xiàn)[18-19]。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.12軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1放線菌的分離與篩選

根據(jù)分離的菌株在純化培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顏色去重，獲得126株放線菌；經(jīng)過平板對峙培養(yǎng)法篩選后，得到產(chǎn)生抑菌圈最大的2株放線菌，分別編號為DJ15、XLG-1。

2.2菌株DJ15、XLG-1的分類鑒定

2.2.1形態(tài)特征菌株DJ15的基內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)、不斷裂，氣生菌絲多分枝，孢子絲波曲狀，孢子呈橢圓形，表面光滑。

2.2.2培養(yǎng)特征菌株DJ15、XLG-1在供試的7種培養(yǎng)基上生長良好，其菌落形態(tài)特征見表1。

2.2.4系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征將所獲得的DJ15、XLG-1菌株的16SrDNA序列通過EzTaxon與GenBank上登錄的序列進(jìn)行基因序列相似性比對，得到21株分別與菌株DJ15、XLG-1同源性最高、已定名的模式菌的序列信息，MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，可見DJ15菌株與Streptomyces yatensis NBRC 101000T （AB249962）同源性最高，可達(dá)99.96%；XLG-1菌株與Streptomyces kasugaensis M338-M1T （AB024441）、Streptomyces celluloflavus NRRL B-2493T （JOEL01000102）2株菌同源性最高，均為99.09%，且均處于同一分支。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征和生理生化特征比對，鑒定DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1菌株為Streptomyces celluloflavus（纖維黃鏈霉菌）。

2.3菌株抗菌活性評價(jià)

2.3.1菌株抑菌譜測定平板對峙試驗(yàn)結(jié)果（表3） 表明，菌株DJ15、XLG-1抑菌效果較廣，對供試的11種植物病原真菌菌絲的抑制率均超過50%，具有較好的抑制效果。2種菌株對病原真菌抑制作用中，XLG-1對貢蕉煙頭病原菌的抑制率為74.99%，抑菌帶寬度達(dá)到2.16 cm，抑制作用最強(qiáng)。除了DJ15對香蕉長形斑病原菌、灰葡萄孢菌原菌、草莓炭疽病原菌及香蕉炭疽病原菌的抑菌帶寬度小于1.5 cm， 其余的

2.3.2次生代謝產(chǎn)物對分生孢子萌發(fā)的抑制作用菌株DJ15、XLG-1不同濃度的發(fā)酵液對香蕉枯萎病菌4號小種分生孢子的萌發(fā)具有不同程度的抑制作用，發(fā)酵液原液的抑制率最高，10%發(fā)酵液抑制率則最低，發(fā)酵濾液濃度增加至50%時(shí)，病原菌孢子的裂解增加（表4），說明隨著拮抗菌發(fā)酵濾液濃度增加，濾液對病原菌孢子的生長抑制作用也增強(qiáng)。

2.3.3次生代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用菌株DJ15、XLG-1的發(fā)酵產(chǎn)物對11種供試植物病原真菌都有較好的抑制效果（表5）。其中DJ15對香蕉樹木潰瘍病原菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)到2.11 cm；XLG-1對貢蕉煙頭病原菌的抑制作用作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)到2.62 cm；2種菌株對香蕉枯萎病4號小種均有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌帶寬無明顯差異性，分別為1.99、2.40 cm。

3討論和結(jié)論

隨著人們對生態(tài)環(huán)境的日益重視，目前利用生防菌防治香蕉枯萎病病害已是國內(nèi)外學(xué)者研究的重要內(nèi)容，但是由于微生物定殖能力不強(qiáng)，容易受濕度、溫度、化學(xué)農(nóng)藥和其他環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致生物防治的效果不穩(wěn)定，從而限制了微生

戴青冬等通過對香蕉進(jìn)行施用BLG01、BDF11與有機(jī)液肥的試驗(yàn)，篩選出高效生防枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis BLG01和BDF11，這2種菌株對香蕉枯萎病病原菌的抑制率最高可達(dá)77%[5]。然而從植株內(nèi)尤其是藥用植物內(nèi)分離篩選出的微生物用于香蕉枯萎病的防治卻鮮有報(bào)道。本研究中，從藥用植物密毛山梗菜中分離篩選鑒定出的菌株，對香蕉枯萎病菌在內(nèi)的11種病原菌具有廣譜抗性，特別是對香蕉枯萎病菌菌絲生長抑制率分別達(dá)54.46%、70.12%，抑制效果良好。原因可能是這些生防菌能抑制病原菌，降低土壤中的尖孢鐮刀菌數(shù)量，使病害得到了有效控制[5]。由于內(nèi)生菌生長于植株內(nèi)，不易受外界環(huán)境影響，具有可以在植物體內(nèi)定殖和運(yùn)轉(zhuǎn)的特殊性質(zhì)[25]，按照內(nèi)共生理論，內(nèi)生菌可能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物，因此從藥用植物中分離具有抗菌活性放線菌，成為病害生物防治中具有潛力的微生物農(nóng)藥。

譚力等通過對銀杏內(nèi)生放線菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)由分離、篩選得到具有抑菌作用的菌株KLBMP 5501為淺紫鏈霉菌Streptomyces violascens[20]。本研究從密毛山梗菜體內(nèi)分離到2株對香蕉枯萎病菌4號小種拮抗作用較強(qiáng)的菌株DJ15、XLG-1，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA 序列分析，鑒定出DJ15菌株為Streptomyces yatensis，XLG-1菌株為纖維黃鏈霉菌（Streptomyces celluloflavus），目前還未發(fā)現(xiàn)2株菌應(yīng)用于土傳病害防治方面的報(bào)道。同時(shí)該菌株發(fā)酵濾液對香蕉枯萎病菌4號小種的孢子萌發(fā)抑制率隨著稀釋濃度變化而變化，其中原液對香蕉枯萎病菌4號小種的孢子萌發(fā)抑制率最大，分別為84.44%、89.10%，表明該菌株的次生代謝產(chǎn)物含有抑菌物質(zhì)，值得對DJ15、XLG-1菌株在植物病害的防治、抗生素的分離純化及其抑菌機(jī)理等方面進(jìn)行深入研究。目前，從密毛山梗菜中分離得到的內(nèi)生放線菌應(yīng)用于防治植物病害的研究尚未見報(bào)道，因此開展對DJ15、XLG-1菌株在植株體內(nèi)定殖、田間應(yīng)用、次生代謝產(chǎn)物的分離、生防菌劑的研制等方面作深入研究具有一定的實(shí)踐意義，為進(jìn)一步優(yōu)化提高抑菌活性以及后期大田生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

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