遺傳性凝血因子Ⅴ缺乏基因型和表型的關(guān)聯(lián)研究

李可可，陳朝霖，馮 瑩，肖 揚

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科，廣州 510260

遺傳性凝血因子Ⅴ缺乏（inherited factorⅤdeficiency，F(xiàn)ⅤD）是一種罕見的常染色體隱性遺傳性出血性疾病，發(fā)病率約為0.1/10萬［1］。輕型FⅤD［FⅤ活性水平（FⅤ∶C）>10%］，通常無臨床癥狀；中型FⅤD（FⅤ∶C<10%）及重型FⅤD（FⅤ：C<1%），臨床表現(xiàn)為程度不等的出血，如皮膚瘀斑、鼻衄、月經(jīng)過多和術(shù)后出血增多等［2］。血漿FⅤ具有促凝和抗凝的雙重作用，在止血和血栓的形成中均發(fā)揮重要作用［3］。研究［4-6］表明，血小板FⅤ也參與止血，并且與血漿FⅤ相比具有更強的促凝活性。FⅤD患者FⅤ∶C活性明顯降低，但活性和臨床出血程度并不一致，且臨床出血表型也呈現(xiàn)出一定的異質(zhì)性［4］。研究［7］發(fā)現(xiàn)正常血漿中FⅤ和組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）以復(fù)合物的形式存在；FⅤD患者的TFPI水平降低，低TFPI水平可使FⅤD患者血漿中凝血酶生成的FⅤ最低需要量降至1%，可保護FⅤD患者免于嚴(yán)重出血。本研究通過對FⅤD患者進行臨床表型診斷和基因檢測，依照國際血栓與止血學(xué)會（International Society for Thrombosis and Hemostasis，ISTH）推薦的出血評分表對患者的出血風(fēng)險進行評分，結(jié)合凝血酶生成試驗（thrombin generation assay，TGA）綜合評估患者的臨床出血風(fēng)險，以期探索FⅤD患者基因型和表型的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年1月—11月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科門診的5例家系FⅤD患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin，APTT）均延長，且其他凝血相關(guān)指標(biāo)正常。②只有FⅤ活性水平（FⅤ∶C）低于50%。③有出血癥狀，如皮膚瘀斑、牙齦出血、鼻衄等。④無其他出血相關(guān)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①FⅤ和FⅧ活性均低于50%。②消耗性凝血障礙、肝病、FⅤ和FⅧ聯(lián)合缺陷等疾病。③FⅤ抗體陽性。研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2020-YJS-ks-06）。

家系1：先證者，女，25歲。因咽痛就診查凝血功能，發(fā)現(xiàn)PT、APTT延長，凝血因子FⅤ∶C為2.4%，其他因子均正常。皮膚易發(fā)瘀斑，無其他出血癥狀。無外傷及手術(shù)史。無出血家族史，父母非近親婚配。家系圖見圖1A。

家系2：先證者，女，12歲。自幼皮膚易發(fā)瘀斑、鼻衄（>10次/年），填塞止血。頭部外傷引起顱內(nèi)出血，輸血漿治療；換牙出血不止（1～3 d），輸注血漿止血；自發(fā)性右側(cè)大腿肌肉血腫1次。FⅤ∶C<1.0%；無出血家族史，父母非近親婚配。家系圖見圖1B。

家系3：先證者，女，43歲。自幼無異常出血史。子宮肌瘤術(shù)前篩查發(fā)現(xiàn)凝血功能異常，PT、APTT延長，F(xiàn)Ⅴ∶C<1.0%。父母非近期婚配。家系圖見圖1C。

家系4：先證者，女，35歲。自幼鼻衄，皮膚易發(fā)瘀斑，月經(jīng)量增多。自然分娩及剖宮產(chǎn)各產(chǎn)1胎；剖宮產(chǎn)術(shù)前檢查發(fā)現(xiàn)凝血功能異常，預(yù)防性輸注血漿制劑，手術(shù)無異常出血，F(xiàn)Ⅴ∶C為2.5%。父母為非近親婚配。家系圖見圖1D。

家系5：先證者，男，41歲。因視力模糊，排除器質(zhì)性病變后，做凝血相關(guān)檢查發(fā)現(xiàn)APTT、PT均延長，F(xiàn)Ⅴ∶C為1.6%。自幼有鼻衄。無手術(shù)史。父母無異常出血史，非近親婚配。家系圖見圖1E。

圖1 5例FⅤD患者家系圖Fig 1 Pedigreediagram of 5 patients with inherited FⅤD

1.2 評分辦法

所有先證者的臨床出血表現(xiàn)依照ISTH推薦的出血評分問卷進行問診和記錄［8］。該評分系統(tǒng)通過問卷形式對患者出血部位和出血程度進行細(xì)致的等級劃分，評分較為直觀地評估了患者的出血傾向。兒童>2分，成年男性>4分，成年女性>5分，即為有較高的出血風(fēng)險［9］。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本采集 采集先證者的外周靜脈血標(biāo)本，用0.109 mol/L枸櫞酸鈉1∶9抗凝。一部分血液經(jīng)室溫、100×g低速離心10 min后，取上層血漿即富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）后，于全血細(xì)胞計數(shù)儀（Beckman Coulter，Inc，美國）上進行血小板計數(shù)，用自身乏血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）將血小板數(shù)量調(diào)至150×109/L，靜置數(shù)分鐘后于2 h內(nèi)進行TGA。另一部分經(jīng)2次3 000×g、15min離心后取PPP及血細(xì)胞于-80℃凍存待用。血漿用于凝血系統(tǒng)、FⅤ抗原（FⅤ∶Ag）、TFPI檢測及凝血酶生成試驗，血細(xì)胞用于基因提取。

1.3.2 實驗室凝血篩查 常規(guī)凝血法查PT、APTT。一期凝固法檢測FⅤ∶C、FⅧ∶C。儀器及所需試劑購自美國Instrumentation Laboratory公司。

1.3.3 FⅤ∶Ag含量檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）對患者血漿中的FⅤ∶Ag進行檢測，儀器及所需試劑購自美國Enzyme Research Laboratories公司。

1.3.4 TFPI抗原檢測 生理條件下血漿中存在2種形式的TFPI，即游離型TFPI和脂蛋白結(jié)合型TFPI（總TFPI）。其中游離型TFPI僅占總TFPI的20%左右，但主要由游離型TFPI發(fā)揮抗凝功能［10］。采用法國Stago公司Assserachrom Total TFPI和Free TFPI試劑盒用ELISA法測定FⅤD患者血漿中總TFPI及游離TFPI水平。

1.3.5 TGA 用自動校正凝血酶曲線法（calibrated automated thrombography，CAT）檢測TGA。于96孔板中加入80μL血漿和20μL試劑（樣品孔：PPPreagant low/PRPreagant；校準(zhǔn)孔：thrombin calibrator）后，放入熒光讀數(shù)儀內(nèi)，儀器自動于37℃溫育10 min。由儀器自動加入37℃預(yù)熱的熒光底物，20μL/孔，在激發(fā)光390 nm、發(fā)射光460 nm的條件下通過檢測熒光信號反映待測樣本中凝血酶的生成量。96孔板每20 s振蕩混勻1次，連續(xù)記錄1 h內(nèi)的熒光信號，最后用Thrombinoscope軟件處理數(shù)據(jù)。每份標(biāo)本分別做2個樣本孔及2個校準(zhǔn)孔。凝血酶生成曲線主要有4個參數(shù)：延遲時間（lagtime，LT）即從反應(yīng)開始到凝血酶開始生成所經(jīng)歷的時間（min）；峰值（peak height）即生成的凝血酶的最大量（nmol/L）；達(dá)峰時間（time to peak，ttpeak）即從反應(yīng)開始到凝血酶到達(dá)最大量所經(jīng)歷的時間（min）；凝血酶生成潛力（endogenous thrombin potential，ETP）即凝血酶生成曲線下的微積分面積，整體反映凝血酶生成的量。其中，指標(biāo)項峰（peak）和ETP的升高較為特異地反映了促凝功能的增強。TGA反應(yīng)所需試劑和耗材均購自法國Diagnostica Stago公司。

1.3.6 FⅤ基因（F5）測序和拷貝數(shù)變異檢測 采用DNA抽提試劑盒（QIAGEN，德國）并嚴(yán)格按照試劑盒說明書所述流程進行操作，抽提先證者及其家系成員外周血基因組DNA。根據(jù)F5序列（GenBank NG_011806.1），設(shè)計擴增25個外顯子及其側(cè)翼序列引物，引物序列及PCR條件參照文獻(xiàn)［11］。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。在Thermo Fisher ProFlex?PCR儀上擴增F5的相應(yīng)片段DNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%～2%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶亮度，并送北京六合華大基因科技有限公司測序。用Chromas軟件將測序結(jié)果與美國NCBI基因文庫中的F5序列進行比對（blast），找尋相關(guān)致病突變，發(fā)現(xiàn)突變位點則通過反向測序予以證實。采用基于競爭性熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的AccuCopy多重基因拷貝數(shù)檢測技術(shù)［12］（上海天昊生物科技有限公司）對FⅤD患者F5進行拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）檢測。

1.3.7 異位轉(zhuǎn)錄水平研究 酚-氯仿法抽提外周血白細(xì)胞中的mRNA，使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在檢測到的大片段缺失和內(nèi)含子突變的序列前后分別設(shè)計PCR引物，對先證者cDNA分別進行擴增。擴增時用正常人外周血cDNA標(biāo)本作為陽性對照。將2輪擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，純化后與T載連接（TaKaRa，中國），進行TA克隆，分布挑取50個單個菌落測序，分析可能存在的不同的轉(zhuǎn)錄本。引物序列見表1。

表1 引物序列信息（5′→3′）Tab1 Primer sequence（5′→3′）

2 結(jié)果

2.1 凝血系統(tǒng)檢測結(jié)果、FⅤ∶Ag及TFPI水平

5例先證者均表現(xiàn)為APTT和PT明顯延長，F(xiàn)Ⅷ∶C均正常；FⅤ∶C和FⅤ∶Ag含量均明顯降低，屬于Ⅰ型FⅤD，其中有2例先證者的FⅤ∶C和FⅤ∶Ag均<1%，屬于重型FⅤD。5例先證者的游離TFPI［（3.54±1.00）ng/mL］和總TFPI［（46.38±12.45）ng/mL］水平有不同程度的降低（表2）。

表2 FVD患者凝血系統(tǒng)、FV∶Ag及TFPI水平檢測結(jié)果Tab2 Result of coagulation system test，F(xiàn)Ⅴ∶Ag antigen and TFPIlevel in patients with FⅤD

2.2 TGA結(jié)果和出血評分

由于PRP標(biāo)本需即刻檢測，因此只收集到先證者1和2的PRP標(biāo)本。對其進行檢測發(fā)現(xiàn)先證者1的TGA-PRP結(jié)果和正常對照相比，除了LT和ttpeak稍延長外，凝血酶生成曲線與正常無異。但先證者2的TGA-PRP無法形成凝血酶生成曲線。5例先證者的TGA-PPP結(jié)果：LT［（10.43±1.79）min］和ttpeak［（14.33±2.25）min］均明顯延長；除1例先證者（先證者2）的peak height極其低和ETP為零且無法形成曲線外，其余4例先證者的peak height［ （184.57±129.36） nmol/L］ 和 ETP［（1 200.29±790.03）nmol/（L·min）］均明顯高于正常對照。結(jié)合先證者2的嚴(yán)重出血表現(xiàn)和TGA-PRP/PPP結(jié)果可大致得出患者有較高的出血風(fēng)險。PRP與PPP結(jié)果具有平行性（表3，圖2）。4例先證者的出血評分在1～7之間，1例出血評分為16分（表4）。

表3 TGA檢測結(jié)果Tab 3 Results of thrombin generation assay

圖2 FⅤD患者凝血酶生成試驗Fig 2 Thrombin generation assay in patients with FⅤD

2.3 F5、CNV及mRNA水平結(jié)果

通過Chromas軟件將5例先證者F5測序結(jié)果與NCBI基因文庫NG_011806.1進行比對（blast），發(fā)現(xiàn)8種突變，突變類型有錯義突變、無義突變、移碼突變、CNV，其中錯義突變占75%；p.Cys603Ser、p.Leu949Trpfs*、p.Leu1262_Gln1657del為新突變（表4）。CNV檢測發(fā)現(xiàn)先證者2的外顯子13～14的大片段缺失（c.3784_4971del，p.Leu1262_Gln1657del）；mRNA水平進一步分析提示缺失導(dǎo)致患者mRNA剪接異常，產(chǎn)生新的剪切位點，進而表達(dá)3種異常轉(zhuǎn)錄本——c.3577_4971del、c.3577_4456del、c.3331_4456del（圖3）。

表4 5例遺傳性FⅤ缺乏患者表型和基因型Tab 4 Phenotypesand genotypesof patientswith hereditary FⅤdeficiency

圖3 異位轉(zhuǎn)錄分析Fig 3 Ectopic transcriptional analysis

3 討論

FⅤ是調(diào)控并參與凝血初始反應(yīng)的必需因子，其活化形式FⅤa與Ca2+、磷脂和FⅩa形成凝血酶原復(fù)合物，是體內(nèi)凝血酶原最主要的激活物。因而FⅤ缺乏往往導(dǎo)致二期止血功能不全［13］，表現(xiàn)為APTT和PT的同時延長。FⅤ為單鏈糖蛋白，相對分子質(zhì)量為330 000。成熟FⅤ蛋白結(jié)構(gòu)為A1-A2-B-A3-C1-C2，B結(jié)構(gòu)域在活化過程中被剪切除去。目前報道的FⅤD相關(guān)的F5突變約有180種，包括同義突變、錯義突變、無義突變、剪切位點突變、插入和缺失等［14］。

本文5例FⅤD患者的APTT和PT均明顯延長，F(xiàn)Ⅴ∶C和FⅤ∶Ag同時降低，屬于Ⅰ型FⅤD；有2例先證者的FⅤ活性和抗原水平均<1%，屬于重型FⅤD。FⅤD的臨床出血表型呈現(xiàn)一定的異質(zhì)性，輕者無異常出血癥狀，重者可危及生命，而APTT、PT及凝血因子活性都不能有效地監(jiān)測患者的臨床出血癥狀。TGA是一個系統(tǒng)監(jiān)測待測標(biāo)本中凝血酶生成總潛力的試驗［15］。凝血酶在血栓與止血過程中發(fā)揮核心作用，運用TGA實時監(jiān)測凝血酶的含量可以有效地評價出血或血栓形成的風(fēng)險［16］。本研究中，4例FVD患者的峰值和ETP（TGA-PPP）均高于正常對照（表3和圖2），其出血癥狀也沒有預(yù)期嚴(yán)重。原因可能為微量的FⅤ已足夠產(chǎn)生維持體內(nèi)最低需量凝血酶。Duckers等［7］研究發(fā)現(xiàn)在PPP中，10%FⅤ即可產(chǎn)生正常量的凝血酶。雖然這4例FⅤD患者血漿FⅤ含量均低于10%，但我們推測其血小板中仍含有一定量的FⅤ可以代償血漿中減少的FⅤ發(fā)揮促凝功能。FⅤD患者血漿FⅤ水平和血小板FⅤ水平同步降低，但因為血小板來源的FⅤ比血漿FⅤ具有更強的促凝活性［4］，而且血小板在受損部位可以快速釋放形成局部高濃度［6］，所以血小板FⅤ比血漿FⅤ促凝活性更高，極大地降低了FⅤD患者的出血風(fēng)險。原因也可能為患者體內(nèi)低水平的TFPI導(dǎo)致血漿的抗凝功能減弱而產(chǎn)生促凝作用。FⅤ和TFPI在血漿中形成復(fù)合物［17］，兩者水平高度相關(guān)，從正常人到單一雜合突變的FⅤD患者和純合或雙雜合突變的FⅤD患者中，血漿中TFPI水平逐漸降低［7］。低水平的TFPI減弱了血漿的抗凝功能，可使FⅤD患者血漿中凝血酶生成的FⅤ最低需量降至1%［18］。

2例FⅤ∶C<1%的重型FⅤD患者（先證者2和3），出血表型和出血評分差異顯著。先證者2的出血評分為16分（表4），TGA-PPP和TGA-PRP結(jié)果顯示均無凝血酶的產(chǎn)生（圖2）；先證者3的出血評分為4分，TGA-PPP結(jié)果的peak height和ETP均明顯高于正常對照（圖2）。重型FⅤD患者的出血嚴(yán)重程度或與FⅤ∶C水平無關(guān)，而與F5突變類型有關(guān)。先證者2的F5突變?yōu)橐拼a突變p.Leu949Trpfs*10和CNV導(dǎo)致的大片段缺失（表4）。p.Leu949位于FⅤ蛋白的B區(qū)，移碼突變導(dǎo)致翻譯的提前終止，產(chǎn)生FⅤ截短蛋白；FⅤ截短蛋白部分B區(qū)缺失，輕鏈則完全消失，分子鏈變短。FⅤ結(jié)構(gòu)完整性受到影響，加上氨基酸序列的改變以及催化活性區(qū)的部分缺失影響蛋白質(zhì)的功能，使其表達(dá)發(fā)生障礙。CNV導(dǎo)致的大片段缺失（c.3784_4971del，p.Leu1262_Gln1657del），在斷裂點的上游產(chǎn)生了新的“GT”供位剪接識別位點，進而表達(dá)3種異常轉(zhuǎn)錄本（c.3577_4971del、c.3577_4456del、c.3331_4456del），c.3577_4971del缺失導(dǎo)致FⅤ蛋白從Val1193至Gln1657缺失465個氨基酸，對B區(qū)功能造成一定影響；c.3577_4456del、c.3331_4456del缺失堿基后發(fā)生移碼突變導(dǎo)致翻譯的提前終止，產(chǎn)生FⅤ截短蛋白［19］（圖3）。產(chǎn)生的截短蛋白或可被體內(nèi)無義介導(dǎo)的mRNA降解機制（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）降解。該患者無凝血酶產(chǎn)生或許與其F5突變類型有關(guān)。這2種復(fù)合雜合突變是該先證者血漿中幾乎沒有FⅤ蛋白表達(dá)和臨床出血表現(xiàn)嚴(yán)重甚至危及生命的原因（表4）。

既往研究［20］發(fā)現(xiàn)Asp96His突變（成熟蛋白質(zhì)為Asp68His）可能是亞洲人的熱點突變。研究［21-22］認(rèn)為Asp68His突變發(fā)生后，維持A1區(qū)β片層結(jié)構(gòu)的氫鍵及分子表面范德瓦耳斯力發(fā)生偏移，降低了分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而影響FⅤ-Asp68His突變蛋白的折疊、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌。在FⅤ蛋白結(jié)構(gòu)中，603Cys與684Cys形成二硫鍵，這樣在A2區(qū)就含有一個82個氨基酸組成的β環(huán)狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)對于維持FⅤ的結(jié)構(gòu)及其功能都是極其重要的。雜合錯義突變Cys603Ser中，Ser603不能與684Cys形成二硫鍵，從而導(dǎo)致A2區(qū)β環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成障礙，影響FⅤ的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、合成、分泌障礙，進而導(dǎo)致血漿中FⅤ含量下降［13，23］。雜合錯義突變Ile445Thr（成熟蛋白質(zhì)為Ile417Thr），Kling等［24］將其命名為FⅤOgden；FⅤOgden突變導(dǎo)致FⅤ重鏈A2區(qū)氨基端附近的Ile417被Thr替換，用極性親水氨基酸Thr取代非極性疏水氨基酸Ile417可能足以改變FⅤ蛋白的二級結(jié)構(gòu)，從而對活性產(chǎn)生負(fù)面影響，因為表面親水性氨基酸位置的變化可能會影響FⅤ重鏈與FXa或凝血酶原的結(jié)合，從而影響凝血酶原復(fù)合物的形成，進而導(dǎo)致出血癥狀的發(fā)生。雜合錯義突變Arg2102His［25］（成熟蛋白質(zhì)為Arg2074His）位于C2區(qū)域，F(xiàn)Ⅴ的晶體結(jié)構(gòu)和H2074的分子C2結(jié)構(gòu)域建模研究表明，F(xiàn)Ⅴ蛋白的正確折疊需要R2074；Arg2074His影響FⅤC2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和輔因子活性。雜合無義突變p.Gln1010*，基因的無義突變在閱讀框中產(chǎn)生提前終止密碼子，在細(xì)胞中翻譯出截短蛋白，可能會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用［26］，亦有可能被NMD機制識別并降解。

通過對這5例先證者的基因分析并結(jié)合其TGA結(jié)果以及出血評分情況發(fā)現(xiàn)FⅤD患者的出血嚴(yán)重程度或與F5突變類型有關(guān)。輕至中度出血的FVD患者，比如出血評分在1～7之間的4例FⅤD患者，F(xiàn)5突變類型多為錯義突變、無義突變［20，27-28］；而危及生命的出血，比如出血評分為16分的先證者2，F(xiàn)5突變類型多為剪切位點突變、大片段缺失的重型FⅤD患者［29-32］。這可能是因為無義突變、錯義突變等突變類型只影響FⅤ蛋白的局部功能，比如FⅤ蛋白的折疊、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、分泌等，對其促凝結(jié)構(gòu)域的影響不大。但大片段缺失、剪切位點突變這些突變類型會導(dǎo)致FⅤ蛋白的嚴(yán)重缺失，進而導(dǎo)致嚴(yán)重的出血。

由于FⅤ在凝血過程中發(fā)揮重要作用，對其分子機制及其功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究具有重要意義。尤其在臨床上，對FⅤD患者進行常規(guī)基因檢測，根據(jù)其基因突變類型對出血嚴(yán)重程度的判斷具有一定意義。

參·考·文·獻(xiàn)

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