蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5在肺癌中的表達(dá)及其促進(jìn)肺癌的作用機(jī)制

周冰倩，韓 麗，陳哲逸，陳詩宇，鄭英霞

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200082

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤［1］。在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居各類癌癥之首，且呈逐年上升趨勢［2］。近年來，隨著手術(shù)治療、化學(xué)治療、靶向和個體化治療的全面開展，肺癌患者短期生存率有了明顯改善，但其5年生存率仍不容樂觀，即從早期的73%降至晚期的13%［3］；且相關(guān)研究［4］顯示，局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是晚期肺癌患者最主要的致死原因。因此，深入探究參與肺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）是一種Ⅱ型甲基化轉(zhuǎn)移酶，能夠催化組蛋白3和組蛋白4的不同精氨酸發(fā)生對稱性二甲基化修飾，如組蛋白4精氨酸3的對稱性二甲基化（symmetric di-methylation of histone4 arginine3，H4R3me2s）、組蛋白3精氨酸8的對稱性二甲基化（symmetric di-methylation of histone3 arginine8，H3R8me2s），以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄激活/抑制［5-7］。已有研究表明PRMT5在肺癌［8-9］、肝癌［10］、乳腺癌［11］、黑色素瘤［12］等多種癌癥中有較高的表達(dá)，提示PRMT5可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。動物肺癌轉(zhuǎn)移模型的相關(guān)研究［8］顯示，PRMT5表達(dá)增加時腫瘤細(xì)胞生長速度較快。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用［13］。有研究［14］發(fā)現(xiàn)PRMT5是腫瘤EMT過程中的重要調(diào)控因子，如其可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力?；诖?，本研究結(jié)合生物信息學(xué)分析，檢測PRMT5在肺癌組織中的表達(dá)，并通過體外功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PRMT5對肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，分析其與患者生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)，為PRMT5作為肺癌的治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 組織芯片獲取及患者信息

73對經(jīng)石蠟包埋的肺癌及癌旁組織制成的芯片購于上海芯超生物科技有限公司。在上述患者中，男性39例、女性34例，年齡為20～84歲。

1.2 數(shù)據(jù)收集和分析

從基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）中下載癌細(xì)胞系百科全書（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）數(shù)據(jù)集GSE36139。該數(shù)據(jù)集包含917種癌細(xì)胞系的DNA突變、基因表達(dá)和染色體拷貝數(shù)等遺傳信息。從UCSC Xena數(shù)據(jù)平臺（https：//xenabrowser.net/datapages/）下載肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）的癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，并獲得RNA測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)；其中，LUAD數(shù)據(jù)中包含了517例LUAD組織和59例正常組織的測序數(shù)據(jù)，LUSC數(shù)據(jù)中包含了502例LUSC組織和51例正常組織的測序數(shù)據(jù)。采用R4.0.3分析PRMT5mRNA在上述2種肺癌及正常肺組織中的表達(dá)。同時，獲取Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/）中的肺癌數(shù)據(jù)，對PRMT5的表達(dá)與患者預(yù)后進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 細(xì)胞和主要試劑

肺癌細(xì)胞NCI-H1299、NCI-H460、HCC827、PC-9和人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

檸檬酸（pH6.0）抗原修復(fù)液、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、蘇木精染液、蘇木精返藍(lán)液、中性樹膠、免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色劑均購于武漢賽維爾生物科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）均購于美國Gibco公司，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Takara公司，實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司，PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PRMT5單克隆抗體、EMT抗體盒購于美國CST公司，肌動蛋白（β-actin）購于武漢愛博泰克生物科技有限公司，CCK8試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所，Transwell和Invasion小室購于美國Corning公司。PBST緩沖液［磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）∶Tween-20=1 000∶1］為實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.4 方法

1.4.1 石蠟包埋組織芯片中PRMT5表達(dá)量檢測 采用免疫組織化學(xué)法檢測73對石蠟包埋組織芯片中PRMT5的表達(dá)，經(jīng)脫水、封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃顆粒則視為PRMT5陽性細(xì)胞。PRMT5表達(dá)評分標(biāo)準(zhǔn)見表1，最終評分=強(qiáng)弱評分×比例評分。后續(xù)，將根據(jù)其獲得的最終評分與患者的臨床特征行相關(guān)性分析。

表1 PRMT5表達(dá)評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 PRMT5 expression scoring criteria

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) MRC-5、PC-9、293T細(xì)胞均采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，NCI-H1299、NCI-H460、HCC827細(xì)胞均采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞的培養(yǎng)條件均為37℃、5%CO2。

1.4.3 細(xì)胞中PRMT5表達(dá)量檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測MRC-5、NCI-H1299、NCI-H460、HCC827、PC-9細(xì)胞中PRMT5的表達(dá)。制備上述5種細(xì)胞的蛋白，按照說明書進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗和二抗孵育，最后用Odyssey紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。使用的一抗為β-actin、PRMT5抗體（稀釋比例均為1∶1 000），熒光二抗稀釋比例為1∶5 000。

1.4.4PRMT5-shRNA寡核苷酸合成 目的基因?yàn)镻RMT5，物種來源為人。靶向PRMT5的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）寡核苷酸序列見表2。

表2 sh RNA寡核苷酸序列Tab 2 Oligonucleotide sequence of shRNA

1.4.5PRMT5-shRNA慢病毒重組質(zhì)粒構(gòu)建 選用PLenR-GPH載體［吉滿生物科技（上海）有限公司］作為慢病毒載體，其自帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記，便于后續(xù)觀察轉(zhuǎn)染效率。利用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶使載體線性化，而后分別將表2中的寡聚核苷酸序列插入PLenR-GPH載體的EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)之間，構(gòu)建PRMT5-shRNA慢病毒重組質(zhì)粒。

1.4.6 慢病毒包裝 使用促轉(zhuǎn)染試劑將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒及輔助包裝質(zhì)粒［吉滿生物科技（上海）有限公司］與293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10～12 h，而后加入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑促進(jìn)轉(zhuǎn)染8 h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液并進(jìn)行濃縮，獲得慢病毒原液。

1.4.7 慢病毒感染、穩(wěn)定敲除PRMT5細(xì)胞株建立及其敲除效果分析 將處于對數(shù)生長期的H1299細(xì)胞以105個/mL接種于6孔板，按照慢病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=20加入病毒并添加2.5μg/mL聚凝胺進(jìn)行感染，以獲取穩(wěn)定敲除PRMT5的H1299細(xì)胞株。培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率。更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取細(xì)胞總RNA并制備細(xì)胞裂解蛋白，采用反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、Western blotting檢測PRMT5的敲除效果，具體步驟參照說明書進(jìn)行。引物序列見表3。

表3 q PCR引物序列Tab 3 Primer sequences for qPCR

1.4.8 細(xì)胞增殖能力檢測 將分別轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA和NC-shRNA的H1299細(xì)胞以5×104個/mL接種至96孔板中，37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)12、24、48、72 h，而后向每孔加入10μL CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀測定細(xì)胞在450 nm處的吸光度。

1.4.9 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測 將分別轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA和NC-shRNA的H1299細(xì)胞按5×104個/孔分別加入Transwell和Invasion小室中，各設(shè)置3個復(fù)孔。將小室放入下層添加了700μL含10%FBS的RPMI-1640的24孔板中培養(yǎng)48 h，而后經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌3次，采用結(jié)晶紫染料染色30 min，再用PBS洗滌3次，最終用平底的濕棉簽輕輕擦去小室內(nèi)部未遷移至下層的細(xì)胞，于顯微鏡下拍照并統(tǒng)計穿過Transwell和Invasion小室的細(xì)胞總數(shù)，取3個復(fù)孔的平均值分別代表細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

1.4.10 EMT相關(guān)蛋白及其基因檢測 選取生長狀態(tài)良好的已分別轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA和NC-shRNA的NCIH1299細(xì)胞，抽提總RNA并制備細(xì)胞裂解蛋白，采用Western blotting、qPCR檢測敲除PRMT5后的EMT相關(guān)蛋白［E鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和轉(zhuǎn)錄因子SNAI1］及其基因的表達(dá)。qPCR引物序列見表3，其中VIM和SNAI1是轉(zhuǎn)移激活基因，CDH1是轉(zhuǎn)移抑制基因。使用的抗體包括β-actin、PRMT5、E-cadherin、vimentin和SNAI1抗體（稀釋比例均為1∶1 000）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料以±s表示，采用Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRMT5在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

對73例患者的肺癌及癌旁組織芯片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，結(jié)果（圖1）顯示PRMT5在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P=0.000）；隨后，對PRMT5表達(dá)與患者的不同臨床特征間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果（表4）顯示PRMT5在腫瘤Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.033）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測PRMT5在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of PRMT5 in lung cancer tissuesand adjacent tissuesby immunohistochemistry

表4 PRMT5的表達(dá)水平與肺癌患者臨床特征間的關(guān)系Tab 4 Relationship between the expression of PRMT5 and the clinical features of lung cancer patients

Continued Tab

2.2 PRMT5在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

CCLE數(shù)據(jù)集GSE36139中共有來自24個原發(fā)部位的腫瘤，共917株不同的癌細(xì)胞系。對這917種癌細(xì)胞系進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2A、B）顯示PRMT5mRNA在肺癌等多個原發(fā)部位腫瘤中表達(dá)，且在LUAD和大細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平均高于LUSC（P=0.034，P=0.028）。隨后，采用Western blotting檢 測MRC-5、NCI-H1299、NCI-H460、HCC827、PC-9細(xì)胞中PRMT5的表達(dá)，結(jié)果（圖2C）顯示與MRC-5細(xì)胞相比，PRMT5在肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)。

圖2 PRMT5在多種癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig 2 Expression of PRMT5 in various cancer cells

2.3 穩(wěn)定敲除PRMT5細(xì)胞株的構(gòu)建及PRMT5對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

本研究通過轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA1、PRMT5-shRNA2、PRMT5-shRNA3篩選穩(wěn)定敲除PRMT5的細(xì)胞株，于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并采用反轉(zhuǎn)錄及qPCR、Western blotting檢測PRMT5的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果（3A、B）顯示，與轉(zhuǎn)染NC-shRNA相比，轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA3后的NCIH1299細(xì)胞中PRMT5表達(dá)明顯降低，因此該細(xì)胞株即為穩(wěn)定敲除PRMT5的NCI-H1299細(xì)胞株（在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，提及PRMT5-shRNA即為PRMT5-shRNA3）。

采用CCK8法檢測轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA細(xì)胞和轉(zhuǎn)染NC-shRNA細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果（圖3C）顯示，在培養(yǎng)48、72 h后，PRMT5-shRNA組細(xì)胞的增殖能力顯著低于NC-shRNA組（均P=0.000）。采用Transwell小室和Invasion小室檢測轉(zhuǎn)染PRMT5-shRNA組和NC-shRNA組細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果（圖3D、E）顯示，PRMT5-shRNA組細(xì)胞的遷移、侵襲能力均低于NCshRNA組（均P=0.000）。

圖3 沉默PRMT5對肺癌細(xì)胞NCI-H1299的增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig 3 Effectsof silencing PRMT5 on proliferation,migration and invasion abilities of lung cancer cell NCI-H1299

2.4 干擾肺癌細(xì)胞系PRMT5對EMT相關(guān)蛋白及其基因的影響

采用Western blotting檢測穩(wěn)定敲除PRMT5的細(xì)胞NCI-H1299中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果（圖4A）顯示敲除PRMT5后E-cadherin的表達(dá)水平增加、vimentin和SNAI1的表達(dá)水平下降；同時，采用反轉(zhuǎn)錄及qPCR檢測上述蛋白的基因（CDH1、SNAI1、VIM）表達(dá)情況，結(jié)果（圖4B）顯示轉(zhuǎn)移激活基因VIM和SNAI1的表達(dá)水平下降，轉(zhuǎn)移抑制基因CDH1的表達(dá)水平增加。

圖4 敲除PRMT5后EMT相關(guān)蛋白及其基因的表達(dá)Fig 4 Expression of EMT-associated proteinsand the genesafter PRMT5 knockout

2.5 PRMT5 mRNA在肺癌及正常肺組織中的表達(dá)及其表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性

從UCSC Xena數(shù)據(jù)平臺下載TCGA數(shù)據(jù)庫，獲得LUAD和LUSC的RNA-seq數(shù)據(jù)，并通過R語言分析PRMT5mRNA在該2種肺癌及正常肺組織中的表達(dá)。結(jié)果（圖5A、B）顯示，PRMT5mRNA在肺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織（均P=0.000）。隨后，通過Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫對肺癌組織中PRMT5mRNA的表達(dá)與肺癌患者總生存（overall survival，OS）率、無復(fù)發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）率的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果（圖5C、D）顯示PRMT5mRNA高表達(dá)的LUAD患者的OS率低于PRMT5mRNA低表達(dá)患者（P=0.005），而PRMT5mRNA的表達(dá)水平與LUSC患者的OS率無相關(guān)性；同時，與PRMT5mRNA低表達(dá)的LUSC患者相比，PRMT5mRNA高表達(dá)患者的RFS率較低（P=0.028）。繼而提示，PRMT5表達(dá)的增加與肺癌的不良預(yù)后有關(guān)。

圖5 TCGA數(shù)據(jù)庫中PRMT5 mRNA在肺癌及正常肺組織中的表達(dá)及其表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Fig 5 Expression of PRMT5 mRNAin lung cancer tissues and normal lung tissuesfrom TCGA database and thecorrelation with prognosis

3 討論

在全球范圍內(nèi)，肺癌已成為癌癥致死的首要原因，平均每年致死人數(shù)高達(dá)170多萬［15］。多項(xiàng)研究［9，11，16］表明，PRMT5在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，即其可通過對H4R3me2s、H3R8me2s行甲基化修飾來調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制或激活，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)PRMT5在肺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與臨床病理分級相關(guān)。隨后，我們通過慢病毒干擾體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRMT5能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且EMT相關(guān)上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)增加、間質(zhì)性標(biāo)記蛋白vimentin和SNAI1表達(dá)減少；繼而提示，PRMT5可能通過調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)來促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。但PRMT5究竟是對EMT相關(guān)蛋白直接作用，還是通過組蛋白甲基化來影響該蛋白的表達(dá)，尚需進(jìn)一步探討。本研究進(jìn)一步結(jié)合大數(shù)據(jù)對PRMT5mRNA在LUAD和LUSC中的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其在2種肺癌組織中均表達(dá)增加，且隨著PRMT5mRNA表達(dá)的增加，LUAD患者OS、LUSC患者RFS縮短，表明PRMT5發(fā)揮著促進(jìn)肺癌發(fā)展的作用。

相關(guān)文獻(xiàn)［9］報道，高濃度的特異性PRMT5抑制劑GSK591可阻斷細(xì)胞中PRMT5的活性，對人胚肺成纖維細(xì)胞IMR-90和肺癌細(xì)胞A549有選擇性殺傷活性。目前，已有多項(xiàng)針對PRMT5的臨床試驗(yàn)處于安全性和有效性的測試階段［17］。綜上所述，PRMT5在肺癌中高表達(dá)，可發(fā)揮促腫瘤的作用，并且其可能通過參與調(diào)節(jié)肺癌EMT信號通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。PRMT5表達(dá)與肺癌的不良預(yù)后有關(guān)，該結(jié)果或?qū)楹Y選肺癌的潛在治療靶標(biāo)提供參考。

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