氣相色譜-一測多評法同時測定佛手揮發(fā)油中6種成分的含量

羅忻昳 李培 何兵 張春 張丹 田吉

中圖分類號 R284.1 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）16-1995-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.16.13

摘 要 目的：建立同時測定佛手揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6種成分含量的方法。方法：采用氣相色譜-一測多評法。色譜柱為Agilent DB-17毛細管柱，檢測器為火焰離子化檢測器，載氣為氮氣（純度99.999%），載氣流速為0.5 mL/min，氮氣（尾吹）流速為25 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為280 ℃，程序升溫，進樣量為0.5 μL，分流比為35 ∶ 1。以檸檬烯為內(nèi)參物，計算α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯等4種成分的相對校正因子，再根據(jù)相對校正因子計算佛手揮發(fā)油中4種成分的含量，并與內(nèi)標(biāo)法（以十二烷為內(nèi)標(biāo)物，測定6種成分）進行比較。結(jié)果：α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.030 5～0.213 8、0.066 6～0.466 0、0.021 8～0.152 3、0.765 2～5.356 4、0.387 3～2.710 8、0.034 2～0.239 6 mg/mL（r均大于0.999）;檢測限分別為4.82、7.89、4.01、4.54、5.53、2.47 ?g/mL，定量限分別為15.34、25.91、13.69、15.70、18.68、8.36 ?g/mL;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗的RSD均小于2%;平均加樣回收率分別為96.08%、97.48%、100.90%、101.22%、100.54%、95.84%（RSD均小于3%，n=6）。α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯的平均相對校正因子分別為0.997 8、1.530 7、0.952 4、1.025 5（RSD均小于1%）。內(nèi)標(biāo)法測得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇的含量分別為3.296 9～20.994 1、11.300 6～39.440 9、3.684 2～11.291 4、174.857 8～511.611 8、0～285.127 3、0～48.858 6 mg/g;一測多評法測α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯的含量分別為3.296 8～20.994 0、11.300 3～39.439 7、3.684 1～11.291 1、0～285.126 6 mg/g;兩種方法測得α-蒎烯等4種成分含量的相對誤差均小于1%。結(jié)論：所建氣相色譜-一測多評法簡便、快捷，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可用于佛手揮發(fā)油成分的定量分析及質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 佛手揮發(fā)油;氣相色譜法;一測多評法;含量測定

Simultaneous Determination of 6 Components in Volatile Oil from Citrus medica by GC-QAMS

LUO Xinyi，LI Pei，HE Bing，ZHANG Chun，ZHANG Dan，TIAN Ji（School of Pharmacy， Southwest Medical University， Sichuan Luzhou 646000， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of α-pinene， β-pinene， myrcene， limonene， γ-terpinene and α-terpineol in volatile oil from Citrus medica. METHODS： GC-QAMS method was adopted. The determination was performed on Agilent DB-17 capillary column. Flame ionization detector was adopted with nitrogen as carrier gas （purity 99.999%） at the flow rate of 0.5 mL/min. The flow rate of nitrogen （make-up gas） was 25 mL/min， the flow rate of hydrogen was 30 mL/min， and the flow rate of air was 400 mL/min. The inlet temperature was 250 ℃， and the detector temperature was 280 ℃ （programmed temperature）， and injection volume was 0.5 μL with split ratio of 35 ∶ 1. Using limonene as internal reference， relative correction factors of α-pinene， β-pinene， myrcene and γ-terpinene were calculated. The contents of 4 components in the samples were calculated according to the relative correction factors. The results were compared between QAMS and internal standard method （ISM， using dodecane as internal substance， 6 components to be determined）. RESULTS： The linear range of α-pinene， β-pinene， myrcene， limonene， γ-terpinene and α-terpineol were 0.030 5-0.213 8， 0.066 6-0.466 0， 0.021 8-0.152 3， 0.765 2-5.356 4， 0.387 3- 2.710 8， 0.034 2-0.239 6 mg/mL （all r>0.999）. The limits of detection were 4.82， 7.89， 4.01， 4.54， 5.53， 2.47 ?g/mL， and the limits of quantification were 15.34， 25.91， 13.69， 15.70， 18.68， 8.36 ?g/mL， respectively. RSDs of precision， repeatability and stability tests （24 h） were all less than 2%. The average recovery rates were 96.08%， 97.48%， 100.90%， 101.22%， 100.54%， 95.84% （all RSD<3%， n=6）. The average relative correction factors of α-pinene， β-pinene， myrcene and γ-terpinene were 0.997 8， 1.530 7， 0.952 4 and 1.025 5 （all RSD<1%）. The contents of α-pinene， β-pinene， myrcene， limonene， γ-terpinene and α-terpineol by ISM were 3.296 9-20.994 1， 11.300 6-39.440 9， 3.684 2-11.291 4， 174.857 8-511.611 8， 0-285.127 3， 0-48.858 6 mg/g， respectively. The contents of α-pinene， β-pinene， myrcene and γ-terpinene determined by QAMS were 3.296 8-20.994 0， 11.300 3- 39.439 7， 3.684 1-11.291 1， 0-285.126 6 mg/g， respectively. Relative content errors of 4 components as α-pinene determined by 2 methods were all less than 1%. CONCLUSIONS： The established GC-QAMS method is simple， rapid， accurate and repeatable， and can be used for quantitative analysis and quality control of volatile oil from C. medica.

KEYWORDS? ?Volatile oil from Citrus medica; GC; QAMS; Content determination

佛手為蕓香科植物佛手Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle 的干燥果實，收載于2020年版《中國藥典》（一部），具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰之功[1]。佛手主產(chǎn)于我國廣東、四川、浙江等地，根據(jù)產(chǎn)地不同被稱為廣佛手、川佛手和浙佛手等[2]，主要含揮發(fā)油、黃酮、香豆素和多糖等成分[3]。佛手外皮為黃綠色或橙黃色，有皺紋和油點，氣香，是揮發(fā)油的主要來源[1]。近年來，關(guān)于佛手揮發(fā)油藥理作用的報道逐漸增多，且研究顯示其具有抑菌[4]、止咳平喘祛痰[5]、抗抑郁[6]、抗腫瘤[7-9]等作用，現(xiàn)已被廣泛用于香水、化妝品、醫(yī)藥、食品等行業(yè)。此外，佛手揮發(fā)油還可用于芳香療法，用于調(diào)節(jié)患者情緒和改善輕微的應(yīng)激障礙癥狀，如焦慮、抑郁、癡呆癥的行為障礙和慢性疼痛等[10]。目前關(guān)于佛手揮發(fā)油的研究主要集中在成分分析方面，有學(xué)者采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析了不同產(chǎn)地佛手揮發(fā)油的成分，結(jié)果表明，佛手揮發(fā)油中含有萜烯類及其含氧衍生物，其中檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、α-松油醇等6種成分在佛手揮發(fā)油中的含量較高[11-16];有研究指出，檸檬烯是佛手揮發(fā)油的主要成分，具有抗炎、抗焦慮、抑制細胞增殖、抗腫瘤等作用[17]。此外，α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯、α-松油醇等也具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化以及抗哮喘等多種藥理作用[18-20]。

2020年版《中國藥典》（一部）中佛手“含量測定”項僅規(guī)定以高效液相色譜法測定橙皮苷的含量[1]。本課題組前期雖然采用氣相色譜法（GC）測定了佛手揮發(fā)油中主成分檸檬烯的含量[21]，但考慮到揮發(fā)油是由多種萜類成分組成的有效部位，故單一成分的含量測定不能完全反映揮發(fā)油的整體質(zhì)量?，F(xiàn)代中藥質(zhì)量評價提倡采用多指標(biāo)質(zhì)量控制模式，對對照品的種類和數(shù)量需求均較大[22]，而一測多評法（QAMS）可通過單一對照品而實現(xiàn)對多個成分的同步檢測，檢測成本大大降低[22]，但文獻報道的QAMS相關(guān)研究以液相色譜法居多[23-24]?；诖?，本研究采用氣相色譜-一測多評 法（GC-QAMS）測定佛手揮發(fā)油中α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等成分的含量，旨在為佛手藥材及其揮發(fā)油的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 7890A型GC儀、Agilent 8890型GC儀（美國Agilent公司），島津GC-2030型GC儀（日本shimadzu公司），XR 205SM-DR型十萬分之一電子天平（瑞士Precisa公司）。

1.2 主要藥品與試劑

α-蒎烯對照品（批號00016834-424，純度98.9%）、α-松油醇對照品（批號00020105-FMC，純度98.0%）均購自美國ChromaDex公司;β-蒎烯對照品（批號131559，純度99.5%）購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;月桂烯對照品（批號BCBW0611，純度93.0%）、γ-松油烯對照品（批號STBH9503，純度98.8%）均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;檸檬烯對照品（批號100470-201503，純度96.0%）購自中國食品藥品檢定研究院;十二烷對照品（內(nèi)標(biāo)，批號K1920078，純度99.7%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;乙酸乙酯為分析純，水為超純水。

23批佛手藥材（編號S1～23）均購自原產(chǎn)地，經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院張春教授鑒定為佛手蕓香科植物佛手C. medica L. var. sarcodactylis Swingle 的干燥果實。采用水蒸氣蒸餾提取法制備佛手揮發(fā)油（共23批，以無水硫酸鈉去除揮發(fā)油中的殘余水分，得率為0.2%～1.0%）。佛手藥材信息來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 單一對照品貯備液 精密稱取α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇對照品76.34、83.22、90.68、191.30、203.82、90.06 mg，分別置于10 mL量瓶中，加入乙酸乙酯溶解，制成上述6種成分質(zhì)量濃度分別為7.634、8.322、9.068、19.130、20.382、9.006 mg/mL的單一對照品貯備液。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取十二烷對照品適量，加入乙酸乙酯溶解，混勻，制成質(zhì)量濃度為7.327 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.1.3 混合對照品溶液 分別精密量取“2.1.1”項下6種單一對照品貯備液400、800、240、4 000、1 900、380 μL，置于10 mL量瓶中，加入乙酸乙酯定容，混勻，得各成分質(zhì)量濃度分別為0.305 4、0.665 8、0.217 6、7.652 0、3.872 6、0.342 2 mg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述貯備液5 mL及“2.1.2”項下內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加入乙酸乙酯定容至10 mL，混勻，即得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇、十二烷質(zhì)量濃度分別為0.152 7、0.332 9、0.108 8、3.826 0、1.936 3、0.171 1、0.732 7 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液 精密稱取佛手揮發(fā)油0.1 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入“2.1.2”項下內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加入乙酸乙酯定容，混勻，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent DB-17毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）;檢測器為火焰離子化檢測器;載氣為氮氣（純度99.999%），載氣流速為0.5 mL/min;氮氣（尾吹）流速為25 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min;進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為280 ℃，程序升溫（起始溫度50 ℃，以5 ℃/min升溫至60 ℃，再以2 ℃/min升溫至100 ℃，然后以20 ℃/min升溫至250 ℃，保留5 min）;進樣量為0.5 μL，分流比為35 ∶ 1。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

分別取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液以及空白對照溶液（乙酸乙酯），按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，各待測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按檸檬烯峰計均不低于100 000，空白對照對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.1.3”項下混合對照品貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置于2 mL量瓶中，精密加入“2.1.2”項下內(nèi)標(biāo)溶液0.2 mL，加入乙酸乙酯定容，混勻，得不同質(zhì)量濃度的系列線性溶液（表2），按“2.2”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、各成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，結(jié)果見表3。

2.5 檢測限與定量限考察

取“2.1.3”項下混合對照品溶液，用乙酸乙酯逐級稀釋，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比3 ∶ 1、10 ∶ 1計算α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6種成分的檢測限與定量限。結(jié)果，上述6種成分的檢測限分別為4.82、7.89、4.01、4.54、5.53、2.47 ?g/mL，定量限分別為15.34、25.91、13.69、15.70、18.68、8.36 ?g/mL。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.1.3”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6種成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值。結(jié)果，上述6種成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為0.37%、0.55%、1.09%、0.13%、0.07%、0.11%（n=6），表明儀器精密度較好。

2.7 重復(fù)性試驗

取佛手揮發(fā)油樣品（批號20191028），按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6種成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，并按內(nèi)標(biāo)法計算樣品中上述6種成分的含量。結(jié)果，上述6種成分含量的RSD分別為0.71%、1.07%、1.51%、0.72%、0.66%、0.82%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.4”項下供試品溶液（批號20191028），分別于室溫下0、2、4、8、16、24 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6種成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值。結(jié)果，上述6種成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為0.74%、0.58%、1.02%、0.41%、0.56%、0.23%（n=6），表明佛手揮發(fā)油供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

分別精密稱取已知含量的佛手揮發(fā)油（批號20191028）50 μL（約0.043 g），共6份，置于10 mL量瓶中，分別精密加入“2.1.1”項下α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇等6種單一對照品貯備液100、190、54、1 040、480、90 μL，精密加入“2.1.2”項下內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加入乙酸乙酯定容，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄各待測成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值并計算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.10 QAMS法的建立

2.10.1 相對校正因子的計算 取“2.4”項下系列線性溶液（質(zhì)量濃度與表2中各濃度梯度對應(yīng)），按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以檸檬烯為內(nèi)參物（因檸檬烯為佛手揮發(fā)油的主要成分，具有多種藥理活性，含量較高且對照品價格便宜，故選擇檸檬烯為內(nèi)參物），計算其余4種成分的相對校正因子（fk/s）：fk/s=（Cs×Ak）/（Ck×As）。式中，Cs為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，As為內(nèi)參物色譜峰峰面積，Ck為其余成分質(zhì)量濃度，Ak為對照成分色譜峰峰面積。具體結(jié)果見表5（因采用內(nèi)標(biāo)法和QAMS法時α-松油醇的結(jié)果差異較大，RSD>3%，不適用于? ?QAMS法測定，故未納入）。

2.10.2 相對校正因子的耐用性考察 取“2.4”項下系列線性溶液，按“2.2”項下色譜條件分別以不同色譜儀（Agilent 7890A型、Agilent 8890型、島津GC-2030型GC儀）、不同品牌色譜柱（Agilent DB-17、島津 InertCap 17、島津 WondaCap 17，規(guī)格均為30 m×0.32 mm，0.25 μm，下同）進樣。結(jié)果，以Agilent 7890A型、Agilent 8890型GC儀以及不同品牌色譜柱得到的相對校正因子變化均較小，可共用;雖然以島津GC-2030型GC儀在不同品牌色譜柱上的相對校正因子變化也較小，但與上述兩種GC儀比較，所得相對校正因子差異較大，提示同一廠家儀器的相對校正因子耐用性較好;同一色譜儀在不同品牌色譜柱上所得的相對校正因子差異較小，耐用性好，詳見表6。此外，由于3種不同品牌色譜柱以Agilent DB-17的分離度、峰形更好，基線更平穩(wěn)，故選擇Agilent DB-17色譜柱進行后續(xù)考察。

2.10.3 不同儀器對含量的影響 取佛手揮發(fā)油（批號20191028），按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2” 項下色譜條件進樣測定，按各自的相對校正因子計算α-蒎烯等4種成分的含量，每樣品平行測定3次。結(jié)果，內(nèi)標(biāo)法和QAMS法以不同儀器所得含量測定結(jié)果基本一致，RSD<2%，詳見表7。

2.10.4 待測成分色譜峰定位 以檸檬烯峰的保留時間為參照，計算α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯及γ-松油烯峰的相對保留時間，考察不同色譜儀（Agilent 7890A型、Agilent 8890型、島津GC-2030型GC儀）、色譜柱（Agilent DB-17、島津 WondaCap 17、島津 InertCap 17）對相對保留時間的影響。結(jié)果，不同型號儀器、不同色譜柱對4種成分相對保留時間的影響均不明顯，RSD為0.20%～1.41%，提示可以通過相對保留時間來定位待測成分的色譜峰，詳見表8。

2.11 含量測定

分別精密稱取23批佛手揮發(fā)油各100 μL，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，分別以內(nèi)標(biāo)法和QAMS法計算含量，每樣品平行測定3次，取平均值，結(jié)果見表9。

由表9可知，各批次佛手揮發(fā)油中，兩種方法所得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯等4種成分含量的相對誤差（RE）均小于1%（以每批樣品計），表明所得結(jié)果無明顯差異。

3 討論

本課題組前期對Agilent DB-5、Agilent DB-17兩種不同極性的色譜柱進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以Agilent DB-5為色譜柱時，佛手揮發(fā)油中多數(shù)成分的分離效果較好，但檸檬烯峰后面有個小峰（基本包進了檸檬烯峰中），經(jīng)反復(fù)調(diào)整色譜條件也不能將之與檸檬烯基線分離。采用Agilent DB-17色譜柱后，檸檬烯與后面的小峰達到基線分離，色譜圖中的大部分峰的分離效果較好，但β-蒎烯峰與月桂烯峰保留時間相近，易重合，未達到基線分離，經(jīng)反復(fù)試驗，最終通過降低初始溫度實現(xiàn)基線分離，得到各成分分離均較好的色譜圖，故最終選擇Agilent DB-17為色譜柱。載氣流速通常選用1 mL/min，但因十二烷峰旁邊有小色譜峰，二者未能分開;當(dāng)將載氣流速調(diào)為0.5 mL/min后，十二烷峰峰形較好，且與相鄰色譜峰基線分離。

外標(biāo)法簡便但要求進樣量十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的色譜條件下進行，否則易造成分析誤差;內(nèi)標(biāo)法測定結(jié)果準(zhǔn)確，由于內(nèi)標(biāo)物與待測成分峰面積的比值不受進樣量波動的影響，因而在一定程度上消除了操作條件等變化所引起的誤差[25-26]，但內(nèi)標(biāo)物的選擇很重要。本課題組前期在參考文獻[27]的基礎(chǔ)上，分別選擇萘、正十一烷、十二烷為內(nèi)標(biāo)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，十二烷在GC圖譜中的出峰時間與前后相鄰峰相差較大，分離度好，且十二烷的保留時間在6種待測成分之間，故選擇十二烷為內(nèi)標(biāo)物。

由于α-松油醇的相對保留時間在不同色譜柱中相差較大，無法準(zhǔn)確定位，且采用QAMS法與內(nèi)標(biāo)法計算所得的含量相差亦較大，故未采用QAMS法檢測α-松油醇的含量，最終采用QAMS法測定其他4種成分的含量。本研究結(jié)果顯示，QAMS法和內(nèi)標(biāo)法所得α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、γ-松油烯等4種成分含量的RE均小于1%，兩種方法比較無明顯差異。

綜上所述，所建GC-QAMS法簡便、快捷，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可用于佛手揮發(fā)油成分的定量分析及質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2021-04-20 修回日期：2021-07-16）

（編輯：陳 宏）