禽白血病病毒p27基因在畢赤酵母中的表達

曹利利，宮鵬濤，姜 旭,，郭衍冰，宋建臣，董 航，姚新華，苑淑賢,王 治

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，長春 130062；2.吉林大學動物醫(yī)學學院，長春 130062；3.延邊大學農學院，延邊 133000；4.北部戰(zhàn)區(qū)疾病預防控制中心，濟南 250014）

禽白血?。╝vian leukosis）是指由反轉錄病毒科禽α反轉錄病毒屬的禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的，以造血細胞增生為主的一類腫瘤性疾病[1]。ALV作為我國二類動物疫病，能夠誘發(fā)禽類的多種腫瘤性疾病，致使生產性能下降，甚至死亡。自1908年首次分離該病毒以來，ALV呈全球流行，嚴重制約了世界各國的禽業(yè)發(fā)展[2]。ALV作為國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012～2020年）中優(yōu)先防治的病原[3]，目前只能依靠病原檢測為手段淘汰陽性雞，進而達到凈化的目的[4]。因此，精準診斷對于有效防控ALV至關重要[5]。

ALV基因組中主要包括gag、pol、env基因，在不同亞群間，gag編碼的p27蛋白十分保守且同源性達96%以上[6]，含有許多可以用于檢測的抗原表位[7]。以往研究常借助原核系統(tǒng)表達p27蛋白用于ALV檢測方法的建立。研究表明，酵母方法和大腸桿菌表達相比，有細胞繁殖快，培養(yǎng)與試驗方法簡單，適用于工業(yè)生產等優(yōu)勢[8]，且因畢赤酵母表達外源蛋白的高效性，研究者們已經實現(xiàn)多種外源蛋白的高效表達[9-10]。而目前國內外尚無畢赤酵母表達ALV p27蛋白的相關報道。利用畢赤酵母表達外源蛋白的高穩(wěn)定、高表達、高分泌、高密度生長的特性，本研究對禽白血病的種間特異性抗原p27蛋白進行表達，獲得的表達產物為制備包被抗原，建立禽白血病病毒ELISA檢測方法或組裝試劑盒奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 毒株與細胞DF1、細胞禽白血病標準毒株HRPS-103[11]由本實驗室保存；巴斯德畢赤酵母GS115購自Invitrogen公司。

1.2 載體與工具酶表達載體pPIC9K購自Invitrogen公司；pMD18-T載體、dNTP、Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ、NotⅠ、T4 DNA連接酶等均購自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑與試劑盒病毒基因組RNA提取試劑盒、DL2000 DNA marker、PCR反應試劑、pre-stained protein marker購自天根生化科技有限公司；通用型RT-PCR試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；Biospin膠回收試劑盒購自BioFlux公司；Plasmid Miniprep Purification Kit Ⅱ 購自捷恩麥克生物科技有限公司；ALV檢測試劑盒購自IDEXX公司；Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）購自康為世紀生物科技有限公司。

1.4 p27基因的克隆

1.4.1 引物合成 查找已發(fā)表的AIV全基因序列中p27的基因序列（GenBank登錄號：Z46390.1），利用Primer Premier 5.0軟件設計一對特異性引物，且兩端分別含有EcoRⅠ與NotⅠ酶切位點。p27-F：GA CGAATTCATGAAGACAGAGGGACCCGCCTG，p27-R：AGGCGGCCGCTTAATGATGATGATGAT GATGCTACGCGGCTATGCCTTGATCCG。

1.4.2 cDNA合成 按照病毒RNA提取試劑盒的操作說明提取ALV HRPS-103的RNA，以禽白血病總RNA為模板，反轉錄后得到cDNA，于-20℃保存。

1.4.3 p27基因的擴增 以ALV cDNA為模板擴增p27基因。反應體系為：cDNA 2 μL，引物p27-F/R各1 μL， ddH2O 10 μL，2×Taq PCR Master Mix 4 μL。反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增的目的片段進行初步判斷。

1.4.4 pMD18-T-p27的構建 對含有p27基因片段進行膠回收，與pMD18-T載體相連接后轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，隨后提取重組質粒進行測序鑒定。

1.5 酵母表達質粒的構建將pPIC9K載體與構建的質粒pMD18-T-p27分別進行雙酶切，回收目的片段，在4℃條件下通過T4 DNA Ligase連接酶連接過夜。取酵母感受態(tài)細胞80 μL同10 μL構建的質粒pPIC9K-p27輕混后進行電轉，隨后取電轉產物100 μL均勻涂布于含有Zeocin的YPDS培養(yǎng)基中，在30℃條件下培養(yǎng)3～5 d后，挑取單菌落接種于5 mL液體YPDS培養(yǎng)基中，在28～30℃、250 rpm條件下振蕩過夜，隨后提取菌液基因組以PCR進行鑒定。

1.6 p27蛋白的誘導表達將重組菌培養(yǎng)至OD600值為2～6時，于1000 ×g條件下離心5 min后收集菌體，以BMMY重懸至OD600值為1.0，持續(xù)培養(yǎng)120 h，期間每隔24 h取樣1 mL并加入甲醇用于誘導目的蛋白的表達，取出的菌液以4000×g離心8 min，收集上清液。

定義10 稱fti+v/ti+v-1′(A′(ti+v)/A′(ti+v-1))為變換φi下，馬爾可夫過程{ξ(t)，t∈T}，(t1 <…

1.7 SDS-PAGE鑒定將處理后的樣品加入SDSPAGE凝膠孔中，濃縮膠部分以80 V條件電泳，分離膠部分以120 V條件電泳。電泳結束后將凝膠置于考馬斯亮藍R-250中緩緩搖動染色4 h，而后在脫色液中脫色至凝膠條帶清晰。

1.8 Western blot鑒定切割SDS-PAGE電泳后凝膠至適當大小，同時裁剪一張略大于膠的PVDF膜并以甲醇激活，濾紙?zhí)崆霸谵D膜液中浸泡，按照陰極、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙、陽極的順序放置，排除中間氣泡后，110 V條件下濕轉30 min；取出膜在封閉液中封閉2 h后，加入ALV陽性血清作為一抗，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入1∶5000稀釋的HRP兔抗雞IgY作為二抗，于37℃搖動孵育1 h后TBST洗膜3次，每次5 min；在膜上滴適量DAB顯色后拍照保存。

1.9 p27蛋白表達條件的優(yōu)化以單菌落接種YPD液體培養(yǎng)基，30℃條件下220 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。取100 μL重組菌液接入50 mL BMGY中，每隔5 h取樣一次測定OD600值，記錄并繪制生長曲線。各條件的優(yōu)化方法如下：

（1）目的蛋白表達量檢測：取5 mL菌液，離心收集上清液，按照Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行純化。經DHS NanoPro 2010/2020超微量紫外可見分光光度計測定蛋白表達量。（2）誘導時間：重組菌共誘導表達120 h，每隔24 h取樣1次，檢測目的蛋白表達量。（3）甲醇誘導濃度：每隔24 h向培養(yǎng)基中添加1次甲醇，使甲醇終濃度分別為1.5%、1.25%、1%、0.75%、0.5%、0.25%，在培養(yǎng)72 h后檢測目的蛋白表達量。（4）pH值：以PBS緩沖液調節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0，在其他誘導條件相同的情況下檢測目的蛋白表達量。（5）誘導溫度：調節(jié)培養(yǎng)基溫度分別為30℃、28℃、26℃、24℃，在其他誘導條件相同的情況下檢測目的蛋白表達量。

2 結果

2.1 PCR擴增結果對PCR產物進行凝膠電泳分析，如圖1所示，在760 bp處有條帶顯示，且大小與預期一致。

圖1 p27基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of p27 gene

2.2 pMD18-T-p27的酶切鑒定將pMD18-T與目的基因p27連接成功后提取質粒，以限制性內切酶（EcoRⅠ和NotⅠ）進行雙酶切，如圖2所示，在760 bp處有條帶顯示且與預期大小一致。

圖2 pMD-p27的雙酶切產物Fig.2 pMD-p27 double digestion results

2.3 測序結果分析將測序結果在NCBI中進行BLAST比對，結果顯示重組質粒中目的片段大小為717 bp，與已公布的AIV基因序列（GenBank登錄號：Z46390.1）相比同源性為100%。

2.4 酵母表達株的鑒定將構建的重組質粒pPIC9K-p27雙酶切后進行電泳，結果如圖3所示，在760 bp處有條帶顯示，與預期大小一致。說明成功構建pPIC9K-p27。

圖3 重組酵母株pPIC9K-p27的鑒定結果Fig.3 Identification of the recombinant yeast strain pPIC9K-p27

圖4 PCR鑒定結果Fig.4 PCR identification results

2.6 p27蛋白的鑒定

2.6.1 SDS-PAGE結果 SDS-PAGE凝膠結果如圖5所示，約30 kDa處有條帶顯示，且與p27蛋白預期大小相符，并將表達的重組蛋白命名為rp27。

圖5 重組蛋白rp27的SDS-PAGE結果Fig.5 SDS-PAGE results of rp27 protein

2.6.2 Western blot結果 Western blot顯色結果如圖6所示，約30 kDa處有條帶顯示，與預期相符，說明表達的重組蛋白p27具有良好的反應原性。

圖6 重組蛋白rp27的Western blot結果Fig.6 Western blot results of rp27 protein

2.7 表達條件的優(yōu)化

2.7.1 重組菌生長曲線 持續(xù)觀察酵母的培養(yǎng)及生長情況，如圖7所示，10 h后酵母菌進入對數生長期，培養(yǎng)至30 h期間OD600呈逐漸上升趨勢，隨后重組菌生長速度減緩。

圖7 重組菌體的生長曲線Fig.7 Growth curve of recombinant bacteria

2.7.2 誘導時間的優(yōu)化結果 如圖8A所示，隨著誘導時間的逐步延長，蛋白表達呈快速上升趨勢，直至72 h時表達量最大，隨后繼續(xù)誘導重組蛋白rp27產量則略有下降。

2.7.3 甲醇濃度的優(yōu)化結果 如圖8B所示，當甲醇濃度為1.0%時p27蛋白表達量最大，而濃度或高或低時重組蛋白rp27產量都會減少。

2.7.4 pH值的優(yōu)化結果 如圖8C所示，以不同pH條件培養(yǎng)重組菌，rp27蛋白的表達量有所不同，當培養(yǎng)液pH值為7.0時rp27表達量最大。

2.7.5 誘導溫度的優(yōu)化結果 如圖8D所示，重組菌在不同溫度誘導條件下，當溫度為28℃時rp27蛋白的表達量最高。

圖8 誘導條件的優(yōu)化Fig.8 Optimization of induction conditions

3 討論

檢測p27已成為國內外種群凈化ALV的常用方法之一，本實驗室通過構建目的重組質粒，經誘導以酵母分泌表達，首次在國內通過畢赤酵母系統(tǒng)制備了高純度的p27蛋白。對于ALV的診斷國外已有商品化試劑盒，國內也有利用大腸桿菌表達p27蛋白及建立檢測方法等研究，但仍存在價格昂貴，分離提取p27蛋白的產量少，成本較高，生物學活性較低等問題。周晨妍等[12-14]分別將木聚糖酶 Xyn43A和 抗病毒蛋白RC28在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達進行比較，結果表明畢赤酵母表達較優(yōu)，且相比于大腸桿菌系統(tǒng)可有效克服蛋白翻譯后加工以及修飾不夠的難題。毛婭卿等[12]通過原核誘導表達p27蛋白約為27 kDa，而本實驗所表達的P27蛋白約為30 kDa，分析其原因，推測可能是與畢赤酵母系統(tǒng)表達過程中對蛋白進行了翻譯修飾有關，這一推測與胡青松等[16]的實驗結果相一致。為了保證了重組蛋白與天然p27蛋白結構和功能的相似，本研究選擇酵母分泌表達目的蛋白，為研究p27衣殼蛋白的生物學功能，以及與宿主相互作用等提供基礎。

以往研究表明，畢赤酵母表達體系相較于其他原核或真核表達系統(tǒng)，不僅能夠提高重組蛋白的生物學活性，還具有對培養(yǎng)環(huán)境要求簡單、成本低等優(yōu)勢[17]。但它也存在一定不足，如分泌表達的蛋白可被自身分泌的蛋白酶降解，有些蛋白表達量較低或者發(fā)生過度糖基化等，但可以通過其他技術手段盡量揚長避短。在畢赤酵母生長與誘導過程中，時間、pH、溫度、甲醇濃度等都會影響到p27蛋白的表達[18]，選擇最適合的反應條件能有效的提升蛋白的表達量[19-20]。實驗中通過不斷優(yōu)化各種反應條件，確保能夠獲得高表達的p27蛋白，相比以往的大腸桿菌表達系統(tǒng)，畢赤酵母表達體系生長周期短且提純過程技術簡單成熟，加之發(fā)酵生產中安全性較高，更適于工業(yè)化規(guī)模生產，為下一步診斷試劑盒的商品化生產與應用奠定了良好的基礎。