BVDV E2蛋白的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立

陳昕迪，郝永清

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）又稱牛病毒性腹瀉病毒-粘膜病病毒，與豬瘟病毒、羊邊界病病毒同屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）[1]。該病毒可引起牛、豬、羊、鹿等動(dòng)物患牛病毒性腹瀉病[2]。其中，持續(xù)性感染、母畜流產(chǎn)和仔豬免疫抑制是該病的主要特征，同時(shí)也是預(yù)防和治療的難點(diǎn)[3]。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖和種畜的頻繁調(diào)運(yùn)，BVDV的感染趨勢(shì)迅速上升，這給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。E2蛋白是BVDV的囊膜糖蛋白，位于病毒粒子的囊膜表面[5]，具有較強(qiáng)的免疫原性，是介導(dǎo)宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附的重要部位。當(dāng)該病毒侵入機(jī)體時(shí)，E2蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[6]。本試驗(yàn)分離得到了牛病毒性腹瀉病毒（BVDV-1）MCD株，原核表達(dá)并純化E2基因截短蛋白，建立BVDV E2血清抗體間接ELISA檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研制BVDV檢測(cè)試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞及質(zhì)粒BVDV-1 MCD株、牛腎細(xì)胞（madin-darby bovine kidney，MDBK）、pCold TF質(zhì)粒均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑牛病毒性腹瀉、牛傳染性鼻氣管炎、?？谔阋?、牛副結(jié)核、布魯菌病、赤羽病及小反芻獸疫的牛陽(yáng)性血清均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；Ni-IDA蛋白純化試劑盒、改良型BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒、ELISA酶標(biāo)板購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；兔抗牛IgG-HRP、兔抗牛IgG-FITC購(gòu)自Abcam公司；BVDV牛標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；TMB顯色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)根據(jù)BVDV-1 MCD株E2蛋白的基因序列（GenBank登錄號(hào)：AB038020.1），用DNAStar分析E2基因的抗原區(qū)、親水區(qū)及表面展示概率，選取主要抗原域，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)E2基因的特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物5'-GTGGCTCTGGCGGTG GCGGTTCTATGCGGCTGCAGGACT-3'；下游引物5'-CCGCTCGAGTAACATAGGCCCTAATTTATCA TC-3'。

1.4 E2基因的擴(kuò)增與克隆提取該病毒基因組的總RNA，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增E2的基因，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性2 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。4℃保存，檢驗(yàn)并回收PCR產(chǎn)物。

1.5 E2基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建將膠回收的目的片段和pCold TF質(zhì)粒用KpnⅠ和XhoⅠ酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。T4 DNA連接酶連接目的片段和pCold TF質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，涂板挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定，提取陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后送至生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

1.6 重組蛋白的表達(dá)及純化將pCold TF-E2轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG 37℃誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎菌體，離心后分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，判定蛋白的表達(dá)方式，并利用Ni-IDA蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。

1.7 重組蛋白Western blot檢測(cè)將純化過(guò)的E2重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜，以牛BVDV陽(yáng)性血清作為一抗（1∶200稀釋?zhuān)?7℃作用1 h，TBST緩沖液洗3～5次，再加入HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG作為二抗（1∶2000稀釋?zhuān)?7℃作用1 h，TBST緩沖液洗3～5次后ECL顯色。

1.8 間接ELISA檢測(cè)方法的建立

1.8.1 反應(yīng)的條件 用正交篩選的方法，分別使用包被液梯度稀釋純化后的E2蛋白8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL包被96孔酶標(biāo)板，牛BVDV陰性血清和陽(yáng)性血清分別按1∶200、1∶100、1∶50、1∶25稀釋作為一抗，以兔抗牛IgG-HRP分別按1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000作為二抗，以10% PEG4000、5%脫脂乳、5%胎牛血清和1% BSA作為封閉液，37℃條件下反應(yīng)以確定最佳封閉條件，以及血清、酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度和工作時(shí)間，依據(jù)P/N值確定ELISA方法的最佳反應(yīng)條件。

1.8.2 陰性與陽(yáng)性臨界值的確定 取50份牛病毒性腹瀉病的陰性血清樣品，依據(jù)最佳反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，根據(jù)OD450值計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，根據(jù)陰陽(yáng)判定臨界值+3SD確定該ELISA方法的陰陽(yáng)臨界值。

1.8.3 特異性試驗(yàn) 利用已建立的間接ELISA 方法，檢測(cè)BVDV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清和牛傳染性鼻氣管炎、牛赤羽病、?？谔阋?、牛副結(jié)核、牛布魯菌病和小反芻獸疫的陽(yáng)性血清樣品，評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.8.4 敏感性試驗(yàn) 將BVDV陽(yáng)性血清從1∶2開(kāi)始依次梯度稀釋?zhuān)罁?jù)最佳反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，以確定該ELISA方法的敏感性。

1.8.5 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)以上優(yōu)化反應(yīng)條件，利用間接ELISA方法檢測(cè)5份BVDV陽(yáng)性血清，每個(gè)血清設(shè)置5個(gè)重復(fù)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)；同時(shí)利用不同批次純化的抗原，檢測(cè)同一份血清，進(jìn)行組間重復(fù)試驗(yàn)，依據(jù)OD450值分析變異系數(shù)。

1.8.6 臨床樣本的檢測(cè) 利用以上優(yōu)化條件建立的間接ELISA方法包被E2蛋白對(duì)200份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。IDEXX BVDV總抗體檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：99-44000）用于檢測(cè)大缸奶樣或血清中的抗體，評(píng)估BVDV是否在牛群中存在。用以上兩種方法進(jìn)行臨床樣本的檢測(cè)，測(cè)定二者的符合率。

1.8.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照已經(jīng)建立的間接ELISA方法，取14個(gè)包被封閉后的ELISA板，一半置于37℃，另一半置于4℃保存。連續(xù)14 d，每天取不同溫度的酶標(biāo)板，其中6列加入BVDV的陰性血清，另外6列加入BVDV陽(yáng)性血清。比較不同溫度下14 d內(nèi)的OD450值，由此分析本研究建立的ELISA方法的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 E2基因的擴(kuò)增以提取的BVDV基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增E2基因，電泳后可見(jiàn)一條片段約為722 bp的條帶，與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

圖1 BVDV E2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR product of BVDV E2 gene

2.2 E2基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定將測(cè)序正確的片段與表達(dá)載體pCold TF連接，PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pCold TF-E2使用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，得到兩條大小為5769 bp和722 bp的片段（圖2），均與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確。

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.3 E2 重組蛋白的表達(dá)優(yōu)化重組蛋白表達(dá)的條件，使用IPTG在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)4 h，將破碎產(chǎn)物的上清液和沉淀分別同時(shí)進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在82 kDa處，上清液和沉淀均有條帶，但上清液中的條帶更加清晰且顏色較深，證明該蛋白成功表達(dá)且大部分存在于上清液中，為可溶性表達(dá)。將獲得的重組蛋白命名為rE2。

圖3 重組蛋白rE2的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of recombinant protein rE2 by SDS-PAGE

2.4 重組蛋白rE2的純化利用Ni-IDA蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化并獲得重組蛋白rE2，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，得到單一的條帶（圖4），證明獲得的重組蛋白rE2純度較高。

圖4 重組蛋白rE2的純化Fig.4 Purification of recombinant protein rE2

2.5 重組蛋白rE2 Western blot鑒定用誘導(dǎo)表達(dá)后的E2蛋白通過(guò)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用抗體小量純化試劑盒純化后的牛BVDV陽(yáng)性血清作為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG作為二抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組蛋白可被陽(yáng)性血清識(shí)別，發(fā)生特異性反應(yīng)（圖5）。

圖5 重組蛋白rE2的 Western blot分析Fig.5 Analysis of recombinant protein rE2 Western blot

2.6 間接ELISA 最佳工作條件的確定

2.6.1 最佳抗原包被濃度及最佳血清稀釋倍數(shù)的確定通過(guò)正交篩選確定最佳抗原包被的濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)。結(jié)果顯示，當(dāng)抗原包被濃度為8 μg/mL,一抗的稀釋度為1∶100時(shí)，陽(yáng)性血清的OD450值為0.998，陰性血清的OD450值為0.145，P/N值為6.883最為合適（表1）。

表1 矩陣滴定Table 1 Matyix titration

2.6.2 封閉液的確定 通過(guò)表2可以看出，當(dāng)陽(yáng)性血清OD450值接近于1，P/N值最大為3.433，因此可以確定10% PEG4000為最佳封閉液。

表2 封閉液的確定Table 2 Determination of the blocking buffer

2.6.3 二抗稀釋度的確定 用以上優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果可知，當(dāng)二抗稀釋度為1∶6000時(shí)，P/N值最大為2.488（表3），確定二抗稀釋比1∶6000是最佳稀釋條件。

表3 二抗稀釋度的確定Table 3 Determination of the dilution of second antibody

2.6.4 陰陽(yáng)臨界值判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 根據(jù)以上最佳反應(yīng)條件，取50份通過(guò)IDEXX抗體檢測(cè)試劑盒鑒定為陰性血清的樣品進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。根據(jù)陰陽(yáng)判定臨界值+3SD確定臨界值為0.33。

2.6.5 特異性試驗(yàn) 利用以上建立的間接ELISA方法，對(duì)牛病毒性腹瀉病、牛傳染性鼻氣管炎、布魯菌病、小反芻獸疫、赤羽病、副結(jié)核、口蹄疫等牛常見(jiàn)的傳染病陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，只對(duì)牛病毒性腹瀉病的血清有較好的反應(yīng)，對(duì)其他血清均無(wú)明顯反應(yīng)，表明所建立的該方法有較好的特異性。

表4 特異性試驗(yàn)Table 4 Specific test results

2.6.6 敏感性試驗(yàn) 將BVDV的陽(yáng)性血清從1∶2開(kāi)始依次倍比稀釋?zhuān)?dāng)血清稀釋至1∶4096時(shí)仍可判斷為陽(yáng)性，表明所建立的方法具有較高的敏感性（圖6）。

圖6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity test results

2.6.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照以上建立的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)5份牛的BVDV陽(yáng)性血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，由組間和組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果可知，組間和組內(nèi)的變異系數(shù)均小于5%，表明該方法具有較好的重復(fù)性（表5）。

表5 E2-ELISA 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Reproducibility test for E2-ELISA

2.6.8 臨床樣品的檢測(cè) 采用以上建立的間接ELISA方法對(duì)180份血清進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)，檢出陽(yáng)性血清158份，陰性血清22份，用IDEXX抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)180份相同的血清樣本，結(jié)果顯示陽(yáng)性血清167份，陰性血清13份，共同檢出陽(yáng)性血清158份，陰性血清13份，兩者的符合率為（158+13）/180=95%（表6）。

表6 E2-ELISA 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Table 6 Clinical sample test results of E2-ELISA

2.6.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 比較不同溫度下14 d內(nèi)的OD450值，相對(duì)誤差均在5%以內(nèi)，且相對(duì)誤差較小，證明該方法具有較好的穩(wěn)定性（表7）。

表7 E2-ELISA 穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果Table 7 Results of the E2-ELISA stability test

3 討論

牛病毒性腹瀉病是牛的常見(jiàn)病，廣泛分布于全世界，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成了極大的危害，并且在臨床上多為持續(xù)性感染[7]。持續(xù)性感染的動(dòng)物長(zhǎng)期處在免疫耐受狀態(tài)，體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生特異性抗體，但又終生帶毒排毒，這也是致使BVDV長(zhǎng)期存在且難以控制的原因[8]。E2是在BVDV結(jié)構(gòu)蛋白中免疫原性最強(qiáng)的糖蛋白，在靠近N末端的一半含有多種依賴構(gòu)象的抗原決定域，它們的N端伸出病毒囊膜外，這是決定抗原性和與宿主細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵部位[9]。此試驗(yàn)成功分離了BVDV，對(duì)通過(guò)RT-PCR鑒定為陽(yáng)性的結(jié)果測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在BLAST上進(jìn)行比對(duì)，確定該病毒株的基因型為BVDV-1。選取E2蛋白的某一段基因構(gòu)建重組蛋白，利用牛的BVDV陽(yáng)性血清進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果證明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。間接ELISA是血清學(xué)檢測(cè)方法中常用的較為敏感和特異的方法，它成功的關(guān)鍵在于抗原的純度[10]，去除與試驗(yàn)無(wú)關(guān)的雜蛋白才能避免假陽(yáng)性反應(yīng)的發(fā)生。本試驗(yàn)利用Ni-IDA柱純化的重組蛋白rE2作為間接ELISA試驗(yàn)的包被抗原，以HRP標(biāo)記的兔抗牛IgG為二抗建立的檢測(cè)方法檢測(cè)BVDV抗體，通過(guò)試驗(yàn)初步驗(yàn)證了該方法具有良好的敏感性及特異性。IDEXX BVDV總抗體檢測(cè)試劑盒是一種用于檢出血清、血漿和牛奶樣品中BVDV抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)產(chǎn)品，可用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。用建立的E2-ELISA抗體檢測(cè)方法和IDEXX ELISA抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)180份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比結(jié)果可知，二者符合率為95%。通過(guò)初步試驗(yàn)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)建立的BVDV E2蛋白間接ELISA方法敏感、特異、可行，這為進(jìn)一步研制BVDV檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。