Ⅰ群血清11型禽腺病毒的分離鑒定與遺傳進(jìn)化分析

張宇龍，劉紅祥，滕巧泱，許春雨，馬 冬，鐘 聲，楊少艷，高天佐，于 靜，宋姍姍，孔憲好，袁 飛，劉 東，李雪松

（1.青島易邦生物工程有限公司，青島 266114；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬于腺病毒科禽腺病毒屬，是無(wú)囊膜的雙股DNA病毒[1]。根據(jù)其群特異性抗原的不同，可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群[2]。禽腺病毒根據(jù)交叉中和試驗(yàn)可分為12個(gè)血清型[3]，雞、鴨、鵝及其他禽類均可感染。有研究通過(guò)對(duì)2007—2014年家禽分離的若干株禽腺病毒進(jìn)行hexon基因序列分析，得出FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-l1為我國(guó)禽腺病毒主要的流行血清型[4]。大部分毒株會(huì)造成包涵體肝炎，剖檢肝臟黃染、腫大、表面有密集的小出血點(diǎn)或出血斑，部分毒株還會(huì)有心包積液的癥狀[5-7]。之前在我國(guó)很少見該病發(fā)生與流行的報(bào)道。自2015年6月份以來(lái)，該病在國(guó)內(nèi)大面積流行，主要集中在山東省、河南省、河北省、遼寧省、安徽省、吉林省的部分地區(qū)[8]。該病主要發(fā)生于3～5周齡肉雞，也可見于雜交雞、麻雞、種雞和蛋雞，肉鴨也可以發(fā)生，死亡率高達(dá)10%～40%。雞感染后可成為終身帶毒者，既可垂直傳播，又可水平傳播，并間歇性排毒，因此該病是目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖戶最為關(guān)注的疫病之一。

2018年9月初，山東省臨沂市某肉雞場(chǎng)30日齡的白羽肉雞暴發(fā)了一種死亡率高、發(fā)病急的疫病，發(fā)病初期雞只精神萎靡、嗜睡、食欲降低、呈卷曲姿勢(shì)、羽毛粗亂，雞群還存在拉稀現(xiàn)象，發(fā)病后很快出現(xiàn)急性死亡并引發(fā)較高死淘率。本研究從臨床采集發(fā)病雞的肝臟、脾臟等病料組織病料中分離到1株病毒，并對(duì)分離株進(jìn)行鑒定、分析，最后確診此次疫病病原為禽腺病毒Ⅰ群，基因型為D型，血清型為11型（D11型）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料山東省臨沂市某肉雞場(chǎng)送檢的疑似禽腺病毒感染的白羽肉雞。

1.2 主要材料與試劑PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司。根據(jù)GenBank中已有的FAdV Hexon基因序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)合成了1對(duì)特異性引物，引物序列FADV-F:CAARTTCAGRCAGACGGT，F(xiàn)ADV-R:TAGTGATGMCGSGACATCAT；擴(kuò)增片段為890 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用DEPC水溶解并配成20 pmol/mL溶液備用。SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ群腺病毒陽(yáng)性血清及抗原由本公司提供。

1.3 樣品的處理剖檢觀察病理變化，并取癥狀明顯的病雞的肝臟剪碎后以1∶4的比例加入含1%雙抗的生理鹽水研磨。-40℃反復(fù)凍融3次，4℃、7000 ×g離心l0 min，取上清液無(wú)菌過(guò)濾后備用，將其命名為YB7288。

1.4 常見病PCR檢測(cè)用實(shí)驗(yàn)室禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒引物進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)上述1.2處理好的樣品YB7288，確定是否有其他病毒感染。

1.5 血清學(xué)檢測(cè)取上述1.2中制備的上清液與標(biāo)準(zhǔn)I群腺病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照。濕盒中37℃孵育72 h，觀察結(jié)果。

1.6 病毒分離取上述1.2制備的上清液通過(guò)卵黃囊接種7日胚齡SPF雞胚10枚，0.2 mL/枚。置于37℃下孵育，每天照胚4次，棄除24 h內(nèi)死亡的雞胚。對(duì)24 h后死亡的雞胚進(jìn)行解剖，觀察病變。收取死亡雞胚的尿囊液、卵黃及胚體，以1∶4的比例加入含1%雙抗的生理鹽水研磨。-40℃反復(fù)凍融3次，4℃、7000 ×g離心l0 min，取上清液無(wú)菌過(guò)濾后備用，將其命名為YB7288F1。

1.7 血凝（Hemagglutination，HA）試驗(yàn) 分別取上述1.3中的上清液，按照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄中的“血凝（HA）試驗(yàn)”，分別對(duì)雞、鴨的l%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)，觀察上清液能否對(duì)動(dòng)物紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。

1.8 hexon基因擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.75 μL，酶1 μL，10×Buffer 5 μL，2×Buffer 25 μL，滅菌ddH2O 16.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR結(jié)束后，取7 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.9 目的基因同源性比對(duì)及分析測(cè)序結(jié)果利用DNAStar和MEGA6.0軟件進(jìn)行比對(duì)分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，并進(jìn)行分析。

表1 FAdV參考毒株名稱及登錄號(hào)Table 1 Name and accession number of FAdV reference strains

2 結(jié)果

2.1 解剖病理情況病雞出現(xiàn)大量心包積液（圖1A），肝臟出現(xiàn)大小不等的出血斑，肝臟顏色變淺（圖1B）；病雞腎臟充血，出血，腫大（圖1C）。

圖1 不同器官病理變化Fig.1 The pathological changes of different organs

2.2 血清學(xué)檢測(cè)經(jīng)過(guò)72 h后，在瓊脂板中觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。待檢樣品YB7288與D11標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清間產(chǎn)生沉淀線，呈陽(yáng)性反應(yīng)，與C4標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和8b標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清間無(wú)沉淀產(chǎn)生，為陰性反應(yīng)，且陰性、陽(yáng)性對(duì)照成立（表2）。

表2 瓊脂擴(kuò)散結(jié)果表Table 2 Result of agar-gel precipitation (AGP) Test

2.3 血凝（HA）試驗(yàn)對(duì)YB7288病毒分離株進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示雞、鴨1%紅細(xì)胞懸液均呈現(xiàn)下滑，故其對(duì)雞、鴨的l%紅細(xì)胞懸液均無(wú)血凝活性。

2.4 病毒分離將病料樣品過(guò)濾后，經(jīng)卵黃囊接種雞胚2 d開始死亡，雞胚死亡時(shí)間為48～133 h，死亡雞胚的病變主要表現(xiàn)為接種雞胚后48 h雞胚活力減弱，胚體發(fā)育不良，皮膚潮紅有出血點(diǎn)（圖2A）。絨毛尿囊膜有不同程度的增厚，呈灰白色。肝臟腫大，有的表面見灰白色壞死斑（圖2B）。

圖2 病料接種雞胚的病變Fig.2 Lesion of chicken embryo inoculated with the sample

2.5 雞常見病毒性疾病PCR結(jié)果使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的引物，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒均為陰性。

2.6 hexon基因PCR結(jié)果以分離病毒基因組為模板，PCR擴(kuò)增病毒hexon基因后，經(jīng)瓊脂糖電泳得到約890 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相一致（見圖3）。

圖3 YB7288病毒分離株hexon基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of YB7288 virus isolate hexon gene

2.7 hexon基因同源性分析將測(cè)序得到的hexon基因序列與GenBank中的FAdV各個(gè)基因型序列以及分離自山東的基因型為D型的序列進(jìn)行同源性對(duì)比，分離株的基因型為D型，血清型為11型。如圖4所示，分離株與分離自山東的FAdV株的核苷酸序列相似性最高，達(dá)到了100%。

圖4 FAdV hexon基因核苷酸序列同源性比較（%）Fig.4 Homology analysis of nucleotides of hexon gene of FAdVs (%)

2.8 hexon基因系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA6.0和DNAStar軟件對(duì)分離株hexon基因序列建立基因進(jìn)化樹，根據(jù)FAdV的基因型將其進(jìn)行分組。從進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)可以看到本試驗(yàn)的19株（1個(gè)分離株序列和18個(gè)參考株序列）hexon序列按照基因型劃分為5個(gè)種（A種、B種、C種、D種和E種），具有明顯的基因多樣性（圖5）。從進(jìn)化樹分支和遺傳距離可以看出，本試驗(yàn)分離毒株為禽腺病毒D種11型。

圖5 FAdV hexon基因進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on Hexon gene of FAdVs

3 討論

近年來(lái)我國(guó)禽腺病毒感染率一直在逐年上升，據(jù)以往報(bào)道，各個(gè)血清型中感染率最高的為C4型和8b型。C4型主要造成心包積水綜合征，8b型為包涵體肝炎的主要病因。包涵體肝炎主要的病變是肝臟顏色變淺、質(zhì)脆、腫脹，表面有密集的小出血點(diǎn)或大小不等的出血斑，嚴(yán)重者可見灰黃色壞死灶。在此次山東臨沂某養(yǎng)殖場(chǎng)送檢病例剖解中，心包中發(fā)現(xiàn)有大量淡黃色清亮積液，肝臟質(zhì)脆、腫大且顏色變淺、發(fā)黃，個(gè)別有肝臟出血斑，腎臟腫大并伴有充血癥狀，可見禽腺病毒D11型發(fā)病后癥狀與C4、8b癥狀相似，會(huì)造成心包積液和包涵體肝炎的癥狀。在此之前我國(guó)少有禽腺病毒D11型感染的報(bào)道，此次疫病的發(fā)生，說(shuō)明在我國(guó)部分地區(qū)還存在D11型毒株的流行。

通過(guò)本次病例可見，Ⅰ群禽腺病毒D11與C4、8b一樣對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)具有較大威脅。目前禽腺病毒感染尚無(wú)特效治療藥物，其綜合防控措施主要以疫苗免疫接種和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理為主。免疫程序一般為7～9日齡首免，30日齡前后進(jìn)行二免，肌肉注射0.3～0.5 mL/只。做瓊擴(kuò)試驗(yàn)結(jié)果表明，D11與C4、8b型之間幾乎不存在或存在很小一部分交叉保護(hù)，所以在白羽肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)盡量選用含有C4、8b和D11毒株的疫苗進(jìn)行免疫。雞群還應(yīng)做好免疫抑制病的防控，特別是傳染性法氏囊、傳染性貧血綜合征等，這些疾病均可導(dǎo)致腺病毒的繼發(fā)感染[9]。

雞舍發(fā)生禽腺病毒感染很大的一部分原因都是由飼養(yǎng)管理不到位、養(yǎng)殖密度過(guò)大、通風(fēng)不良、飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡等原因造成的。因此，應(yīng)同時(shí)改善雞只飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，防止冷應(yīng)激和熱應(yīng)激，合理控制養(yǎng)殖密度，飼料中適量添加維生素和礦物質(zhì)，保證飲水安全衛(wèi)生，發(fā)病雞要及時(shí)隔離飼養(yǎng)，避免造成水平傳播感染。