四川規(guī)模兔場(chǎng)球蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查

葉勇剛，任永軍，于吉峰，魏 勇，葉建強(qiáng)，肖 璐，曹 冶，謝 晶，李興玉，潘 夢(mèng)，林 毅，張先惠，康潤(rùn)敏

（四川省畜牧科學(xué)研究院 動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066）

兔球蟲(chóng)病是家兔最常見(jiàn)也是對(duì)家兔危害最為嚴(yán)重的一種寄生蟲(chóng)病，主要分為腸球蟲(chóng)病和肝球蟲(chóng)病。其中腸球蟲(chóng)病主要由腸道球蟲(chóng)如已公認(rèn)的穿孔艾美耳球蟲(chóng)、中型艾美耳球蟲(chóng)、大型艾美耳球蟲(chóng)、梨形艾美耳球蟲(chóng)、無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)、盲腸艾美耳球蟲(chóng)、腸艾美耳球蟲(chóng)、小型艾美耳球蟲(chóng)、黃艾美耳球蟲(chóng)和維氏艾美耳球蟲(chóng)感染引起；肝球蟲(chóng)病主要由斯氏艾美耳球蟲(chóng)感染引起[1-2]。不同種類(lèi)的球蟲(chóng)其致病力差異較大，其中斯氏艾美耳球蟲(chóng)致病力最強(qiáng)[3-5]。

目前，生產(chǎn)上對(duì)兔球蟲(chóng)病的防控主要依靠藥物預(yù)防為主，在飼料或飲水中添加抗球蟲(chóng)藥物是預(yù)防兔球蟲(chóng)病的有效方法。在抗球蟲(chóng)病方面，除妊娠期外，在規(guī)?；脠?chǎng)兔的其他生長(zhǎng)階段均會(huì)連續(xù)使用添加抗球蟲(chóng)藥物的飼料，在長(zhǎng)期藥物選擇下，即便不停更換藥物種類(lèi)，耐藥蟲(chóng)株也會(huì)不斷出現(xiàn)。四川是我國(guó)養(yǎng)兔第一大省[6]，隨著近年來(lái)養(yǎng)兔產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，規(guī)?；B(yǎng)殖程度不斷提高，規(guī)模兔場(chǎng)數(shù)量逐步增多[7]；高設(shè)施化、現(xiàn)代化養(yǎng)殖條件雖然提高了生產(chǎn)效益，但卻并未減少球蟲(chóng)病的發(fā)生。此外，四川近10年來(lái)鮮有兔球蟲(chóng)病流行病學(xué)報(bào)告，僅見(jiàn)郝桂英[8]對(duì)四川西昌市郊兔球蟲(chóng)感染情況調(diào)查和Yin等[9]對(duì)四川不同地區(qū)110份糞樣的調(diào)查?；诖?，開(kāi)展四川規(guī)模兔場(chǎng)球蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查十分必要，可為四川省科學(xué)防治兔球蟲(chóng)病提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑2×Taq PCR Master Mix和糞便基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；D2000 Plus DNA Ladder購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；飽和食鹽水溶液和2.5%重鉻酸鉀溶液由本實(shí)驗(yàn)室配制。參照文獻(xiàn)[10]合成11種兔艾美耳球蟲(chóng)鑒定引物，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 糞樣的采集在四川東部（遂寧市、簡(jiǎn)陽(yáng)市）、南部（自貢市、眉山市）、西部（雅安市）、北部（綿陽(yáng)市、巴中市）、中部（成都周邊的大邑縣、金堂縣）五個(gè)大區(qū)域，選擇15個(gè)存欄數(shù)量大于1000的規(guī)模化養(yǎng)兔場(chǎng)（每個(gè)區(qū)域選擇3個(gè)兔場(chǎng)），分別采集1～3月齡、3～6月齡和6月齡以上三個(gè)年齡段兔新鮮糞樣450份。每份糞樣不低于20 g，單獨(dú)存放于透明塑料采樣袋中做好標(biāo)記，置于裝有冰袋的泡沫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室鏡檢。

1.3 卵囊定量檢查每克糞便卵囊數(shù)（Oocysts per gram，OPG）采用麥?zhǔn)戏ㄟM(jìn)行檢測(cè)[11]。

1.4 卵囊的收集以每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)為單位，將30份定量檢測(cè)后剩余的糞樣混合，研磨碾碎后加入適量水混勻，用80目濾網(wǎng)過(guò)濾2次，濾液4000 ×g 離心5 min，沉淀加入飽和食鹽水混勻放置1 min后過(guò)濾，濾液2000 ×g離心5 min，取上清液加入5倍體積水混合后，5000 ×g離心8 min，小心棄掉上清液，沉淀即為收集的卵囊。

1.5 卵囊的形態(tài)鑒定取適量卵囊于2.5%重鉻酸鉀溶液中孵化（溫度為28℃），每天在顯微鏡下觀察卵囊孢子化情況，根據(jù)孢子化卵囊顏色、有無(wú)內(nèi)外殘?bào)w、有無(wú)卵膜孔等，參照?qǐng)D譜和國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)資料進(jìn)行蟲(chóng)種鑒定。

1.6 卵囊的分子鑒定將上述卵囊置于凍存管中（卵囊濃度大于1×105個(gè)/mL），經(jīng)-80℃和室溫反復(fù)凍融5次后，提取總DNA。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL反應(yīng)液用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 球蟲(chóng)鑒定結(jié)果球蟲(chóng)種類(lèi)的鑒定，多采用形態(tài)學(xué)方法鑒定，主要將球蟲(chóng)卵囊孢子化后，依據(jù)卵囊顏色、形狀、尺寸、有無(wú)卵膜孔、有無(wú)內(nèi)外殘?bào)w、孢子化時(shí)間等形態(tài)特征進(jìn)行辨別，此法簡(jiǎn)單、直觀，但卻耗費(fèi)時(shí)間，同時(shí)也需要觀察者掌握必要的形態(tài)學(xué)知識(shí)和相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。Oliveira等[10]建立了針對(duì)11種兔球蟲(chóng)鑒別診斷的PCR方法，很好的補(bǔ)充了形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足。本研究將二者結(jié)合并用于兔球蟲(chóng)種類(lèi)鑒定，結(jié)果表明四川規(guī)?；脠?chǎng)感染球蟲(chóng)9種，分別為巨型艾美耳球蟲(chóng)、中型艾美耳球蟲(chóng)、黃艾美耳球蟲(chóng)、穿孔艾美耳球蟲(chóng)、無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)、斯氏艾美耳球蟲(chóng)、盲腸艾美耳球蟲(chóng)、梨形艾美耳球蟲(chóng)和小型艾美耳球蟲(chóng)。除小型艾美耳球蟲(chóng)外，其余8種均已出現(xiàn)在近5年的四川兔球蟲(chóng)流病調(diào)查文獻(xiàn)中[9]。腸艾美耳球蟲(chóng)在此次調(diào)查中未被檢出，或許與養(yǎng)殖方式、采集區(qū)域或覆蓋養(yǎng)殖場(chǎng)數(shù)量不夠大有關(guān)。9種孢子化球蟲(chóng)卵囊見(jiàn)圖1；不同種球蟲(chóng)PCR擴(kuò)增條帶大小與文獻(xiàn)一致[10]，結(jié)果見(jiàn)圖2。巨型艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈卵圓形，淡黃色，卵膜孔明顯，呈堤狀突出于卵囊壁外，卵囊內(nèi)有外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)35.51 μm ± 5.56 μm，寬25.39 μm± 3.42 μm，具體見(jiàn)圖1A。中型艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈長(zhǎng)圓形，玫瑰橙黃，有卵膜孔，卵囊內(nèi)有外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)27.36 μm ± 4.45 μm，寬16.24 μm ± 6.02 μm，具體見(jiàn)圖1B。黃艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈卵圓形，黃色，在寬一段有明顯的卵膜孔，卵囊內(nèi)無(wú)外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)30.48 μm ± 3.64 μm，寬19.12 μm ± 4.57μm，具體見(jiàn)圖1C。穿孔艾美耳球蟲(chóng)：卵囊小呈橢圓形，無(wú)色或淡綠色，無(wú)卵膜孔，卵囊內(nèi)有外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)23.36 μm ± 6.12 μm，寬14.83 μm± 3.56 μm，具體見(jiàn)圖1D。無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈卵圓形，淡黃色，有卵膜孔，卵囊內(nèi)無(wú)外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)32.46 μm ± 3.12 μm，寬22.76 μm ± 1.95μm，具體見(jiàn)圖1E。斯氏艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈長(zhǎng)卵圓形，淡黃色或無(wú)色，有卵膜孔，卵囊內(nèi)無(wú)外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)36.12 μm ± 3.14 μm，寬20.63 μm ± 1.37 μm，具體見(jiàn)圖1F。盲腸艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈長(zhǎng)圓形，淡黃色或無(wú)色，有明顯卵膜孔，卵囊內(nèi)有外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)33.22 μm ± 6.04 μm，寬18.40 μm ± 2.56 μm，具體見(jiàn)圖1G。梨形艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈梨形，淡黃色，有卵膜孔，卵囊內(nèi)無(wú)外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)有內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)28.96 μm± 2.18 μm，寬18.64 μm ± 2.18 μm，具體見(jiàn)圖1H。小型艾美耳球蟲(chóng)：卵囊呈圓形，無(wú)色，卵膜孔不明顯，卵囊內(nèi)無(wú)外殘?bào)w，孢子囊內(nèi)無(wú)內(nèi)殘?bào)w，長(zhǎng)11.76 μm ± 1.24 μm，寬10.78 μm ± 0.21 μm，具體見(jiàn)圖1I。

圖2 9種兔球蟲(chóng)特異性PCR鑒定結(jié)果Fig.2 The PCR identification results of 9 species of rabbit coccidium

2.2 不同地區(qū)不同年齡段兔球蟲(chóng)感染率及感染程度對(duì)采自各地區(qū)不同日齡兔的450份糞樣進(jìn)行球蟲(chóng)卵囊檢測(cè)。結(jié)果顯示，1～3月齡幼兔球蟲(chóng)感染率達(dá)96%，其中東、南、西、北和中部地區(qū)幼兔球蟲(chóng)感染率分別為96.67%，96.67%、96.67%、96.67%和93.33%；4～6月齡兔球蟲(chóng)感染率為77.33%，其中東、南、西、北和中部地區(qū)兔球蟲(chóng)感染率分別為76.67%、80%、76.67%、80%、73.33%；6月齡以上兔球蟲(chóng)感染率為40.00%，其中東、南、西、北和中部地區(qū)兔球蟲(chóng)感染率分別為40%、46.67%、36.67%、43.33%、33.33%。1～3月齡幼兔球蟲(chóng)感染程度最高，平均OPG值為14 913；其次為4～6月齡，平均OPG值為4320；6月齡以上兔球蟲(chóng)感染程度最低，OPG值為716；具體結(jié)果詳見(jiàn)表1。本次對(duì)兔球蟲(chóng)病的調(diào)查涉及四川8個(gè)市區(qū)，15個(gè)規(guī)模養(yǎng)兔場(chǎng)，兔球蟲(chóng)總感染率達(dá)71.11%，Yin等[9]（2016）報(bào)道四川兔球蟲(chóng)感染率56.4%、邢勇等[12]（2017）報(bào)道的內(nèi)蒙古包頭固陽(yáng)縣兔球蟲(chóng)感染率25.33%，Jing等[13]（2012）報(bào)道的中國(guó)西南地區(qū)兔球蟲(chóng)感染率62.5%；低于姜英等[14]（2013）報(bào)道的河南兔球蟲(chóng)感染率74.6%、簡(jiǎn)永利等[15]（2014）報(bào)道的浙江溫州地區(qū)兔球蟲(chóng)感染率77.1%、王曄娥等[16]（2017）報(bào)道的陜西榆林獺兔球蟲(chóng)感染率100%，陳仁鋒等[17]（2015）報(bào)道的福建郊區(qū)肉兔球蟲(chóng)感染率85.86%。其中1～3月齡幼兔球蟲(chóng)感染率在各年齡組中最高，與以上所有調(diào)查報(bào)告一致。

表1 不同地區(qū)不同年齡段兔球蟲(chóng)感染率及感染程度Table 1 Infection rate and intensity of coccidiosis in different age groups in different regions

2.3 不同兔場(chǎng)流行的球蟲(chóng)種類(lèi)對(duì)不同地區(qū)各養(yǎng)兔場(chǎng)檢出的球蟲(chóng)進(jìn)行種類(lèi)鑒定，結(jié)果顯示，在15個(gè)規(guī)模養(yǎng)兔場(chǎng)中，球蟲(chóng)感染均為混合感染，每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)檢出4～7種球蟲(chóng)。從各個(gè)兔場(chǎng)感染的球蟲(chóng)種類(lèi)來(lái)看，四川省規(guī)模兔場(chǎng)感染的球蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種為巨型艾美耳球蟲(chóng)、中型艾美耳球蟲(chóng)和黃艾美耳球蟲(chóng)，場(chǎng)陽(yáng)性率超過(guò)90%，其次為穿孔艾美耳球蟲(chóng)、無(wú)殘艾美耳球蟲(chóng)、斯氏艾美耳球蟲(chóng)、盲腸艾美耳球蟲(chóng)、梨形艾美耳球蟲(chóng)和小型艾美耳球蟲(chóng)，詳見(jiàn)表2。其中巨型艾美耳球蟲(chóng)和中型艾美耳球蟲(chóng)在最近已報(bào)道的四川兔球蟲(chóng)流行種類(lèi)中，流行率排在第2和第4位[9]。

表2 15個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)感染的兔球蟲(chóng)種類(lèi)Table 2 Rabbit coccidial species detected in fifteen farms

四川是中國(guó)養(yǎng)兔第一大省，兔年出欄量占全國(guó)總出欄量的43.75%。兔的生產(chǎn)模式主要有集約化的規(guī)模生產(chǎn)模式、合作組生產(chǎn)模式和庭院生產(chǎn)模式，就全國(guó)而言，規(guī)模兔場(chǎng)家兔出欄量已占總出欄量一半以上[6]。近年來(lái)，四川隨著養(yǎng)兔產(chǎn)業(yè)的調(diào)整升級(jí)，規(guī)?；脠?chǎng)數(shù)量也日益增加。盡管規(guī)?；脠?chǎng)飼養(yǎng)條件高于合作社和庭院養(yǎng)殖場(chǎng)，但由于其四季繁殖加之兔舍多有增溫和保溫措施，在給兔帶來(lái)舒適性的同時(shí)，也為球蟲(chóng)卵囊的發(fā)育創(chuàng)造了條件[7,18]。此外，調(diào)查的15個(gè)養(yǎng)兔場(chǎng)幾乎都使用添加抗球蟲(chóng)藥物如氯苯胍、氯羥吡啶等商品全價(jià)料，該法早期雖能有效遏制球蟲(chóng)病，但隨著時(shí)間的推移和不重視定期科學(xué)更換抗球蟲(chóng)藥物，造成多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)用常規(guī)添加藥物劑量的飼料不能有效控制球蟲(chóng)病。這也是本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)規(guī)模養(yǎng)兔場(chǎng)球蟲(chóng)感染率和感染程度較高的原因。

綜上所述，四川規(guī)模兔場(chǎng)球蟲(chóng)感染陽(yáng)性率為71.11%。主要流行9種球蟲(chóng)，其中巨型艾美耳球蟲(chóng)、中型艾美耳球蟲(chóng)和黃艾美耳球蟲(chóng)場(chǎng)陽(yáng)性率最高，為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種。1～3月齡幼兔球蟲(chóng)感染率和感染程度最高，普遍為中度感染，是防控的重點(diǎn)。