我國部分地區(qū)豬養(yǎng)殖場耐藥基因mcr-1陽性大腸桿菌的PFGE和RAPD分型對比研究

仝慧嫻，姚曉慧，王舒豐，魏建超，劉 珂，邵東華，邱亞峰，馬志永，李蓓蓓，劉聚祥

（1.河北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，保定 071000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

多黏菌素作為飼料添加劑和治療藥物在動物養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用多年。近年來隨著耐藥性問題越來越嚴重，該藥物被重新應(yīng)用于人醫(yī)臨床，治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染，特別是碳青霉烯耐藥腸桿菌感染。長期以來，多黏菌素耐藥率比較低，其耐藥機制主要是特定基因突變激活PmrA/PmrB和PhoP/PhoQ雙調(diào)控系統(tǒng)，對細胞膜LPS中的脂質(zhì)A修飾后導(dǎo)致耐藥[1]。2016年，多黏菌素耐藥基因mcr-1首次在中國被發(fā)現(xiàn)[2]，由于其主要由質(zhì)粒攜帶，可以在不同細菌間橫向傳播，使多黏菌素耐藥率持續(xù)快速升高，引起了全世界的關(guān)注與重視，丹麥、法國、新西蘭等近50個國家相繼檢測到了該基因[3]。此外，人源臨床分離菌中也檢測到了mcr-1，但其檢出率遠遠低于養(yǎng)殖動物源細菌[4-6]，Yi等[7]提出，人源臨床分離菌中檢測到的mcr-1很可能也來源于動物中的mcr-1基因。

探明耐藥菌的親緣關(guān)系對耐藥傳播機制研究和耐藥性防控十分重要。常用的分子分型方法有脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、隨機擴增多態(tài)性分析（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA）和核糖體分型等[8-9]。本研究對我國9個省份33個豬養(yǎng)殖場中mcr-1的流行情況進行調(diào)查，采用PFGE和RAPD兩種方法分析mcr-1陽性菌株的親緣關(guān)系，并對兩種方法的分型能力和操作可行性進行比較，為豬源mcr-1耐藥菌株的防控及分子分型方法的選擇提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2016～2017年，自我國青海、四川、北京、貴州、海南、江西、山西、山東、新疆共9個省市自治區(qū)33個豬養(yǎng)殖場，用無菌拭子采集糞便樣品，共計采取122份樣品。

1.2 主要試劑麥康凱固體培養(yǎng)基（MacConkey Agar，MAC）、腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion，BHI）購自北京路橋有限公司；限制性內(nèi)切酶XbaI及配套的酶切緩沖液購自寶生物工程（上海）有限公司；PCR Premix反應(yīng)體系、糞便DNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；多黏菌素E、萬古霉素均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 菌株的分離用無菌接種環(huán)蘸取糞便樣品，劃線于含有多黏菌素E（3 mg/L）和萬古霉素（20 mg/L）的MAC培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后，每個樣品隨機挑取一個菌落，再次劃線純化后，挑取單克隆菌落于1 mL BHI培養(yǎng)基中，37℃條件下200 rpm過夜培養(yǎng)。使用20%的甘油保種，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 耐藥基因mcr-1的檢測及菌種鑒定按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，提取細菌基因組DNA作為模板進行PCR擴增。上游引物F：5'-CGGTCAGTCCGTTTGTTC-3'；下游引物R：5'-CTTGGTCGGTCTGTAGGG-3'[10]。擴增引物由Invitrogen公司合成。擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物純化測序證實其為mcr-1基因。對mcr-1陽性菌株經(jīng)16S rRNA測序進行種屬鑒定。

1.5 mcr-1陽性大腸桿菌同源性聚類分析

1.5.1 PFGE分型 根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心Pulse Net[11]的PFGE分子分型的大腸桿菌標準化實驗室操作，采用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶對細菌基因組進行酶切。設(shè)置電泳參數(shù)為：起始轉(zhuǎn)換時間2.2 s，終止轉(zhuǎn)換時間54.2 s，電泳時間19 h，電壓6 V/cm，電場夾角120°。脈沖場凝膠電泳是一種分離大分子DNA或染色體的方法，在脈沖場凝膠電泳中，電場不斷在兩種有一定夾角（90°或20°或180°）的方向變動，電場轉(zhuǎn)換后，相對較小的分子可以較快地轉(zhuǎn)變移動方向，較大的分子在轉(zhuǎn)向時較為困難，這樣使不同分子量大小的DNA片段在脈沖場凝膠電泳中能有效地分離開來[12]。

使用BioNumerics 7.1軟件進行分析，以沙門菌H9812為標準菌株進行校準，標定條帶位置，根據(jù)Dice系數(shù)確定菌株間的同源關(guān)系，以相似性系數(shù)為80%作為同一譜型劃分依據(jù)[13]，根據(jù)圖譜之間的相似性系數(shù)，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（unweighted pair groupaverage method，UPGMA）進行聚類，并生成聚類樹。

1.5.2 RAPD分型 RAPD是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種簡單且快速的可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)[14]，是以DNA為模板，隨機引物單個加入，且引物與基因組有特定的結(jié)合位點，如果這些結(jié)合位點符合擴增的條件，即可擴增出相應(yīng)的片段。理論上，在一定的擴增條件下，用相同的引物，復(fù)雜性越高的基因組產(chǎn)生的擴增條帶也越多[15]。隨機引物序列為：5'-GTTTCGCTCC-3'[16]，引物由Invitrogen公司合成；反應(yīng)體系為：模板DNA 5～50 ng，25 pmol/μL隨機引物，10×PCR Mix 12.5 μL，加入ddH2O補足25 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，45個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2% DE瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電壓設(shè)置為150 V，電泳時間約60～70 min。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

同樣使用BioNumerics 7.1軟件分析結(jié)果，采用與PFGE分析時相同的設(shè)置，生成聚類樹。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離鑒定及mcr-1基因檢測結(jié)果從我國9個省市自治區(qū)33個豬養(yǎng)殖場采集的122份糞便樣本中分離得到86株耐藥菌株，結(jié)果見表1。經(jīng)PCR檢測共有63株mcr-1陽性菌株，部分電泳圖譜如圖1所示。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST序列比對，與登錄號KP347127.1中mcr-1堿基序列同源性為100%，確認PCR產(chǎn)物為mcr-1片段。利用16S rRNA測序進行種屬鑒定發(fā)現(xiàn)，63株mcr-1陽性菌株均為大腸桿菌。

圖1 mcr-1基因檢測電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR detection of mcr-1 gene

表1 我國9個省份豬源mcr-1陽性菌株分離結(jié)果Table 1 The isolation of mcr-1-positive bacteria of pig origin from 9 provinces in China

2.2 mcr-1陽性大腸桿菌同源性聚類分析

2.2.1 PFGE分型結(jié)果 63株mcr-1陽性大腸桿菌的XbaⅠ-PFGE聚類圖譜見圖2。將63株菌株P(guān)FGE圖譜導(dǎo)入，結(jié)果顯示：63株mcr-1陽性大腸桿菌經(jīng)PFGE試驗后，得到33～1135 kb的電泳條帶，條帶數(shù)目為8～20條。

圖2 mcr-1陽性大腸桿菌XbaⅠ-PFGE樹狀圖Fig.2 XbaⅠ-PFGE dendrogram of mcr-1-positive E.coli isolates

以相似性系數(shù)為80%作為同一譜型劃分依據(jù)[13]，即圖中譜型相似系數(shù)大于80%為表現(xiàn)出克隆關(guān)系的菌株，小于80%則視為無克隆關(guān)系。共獲得56種PFGE譜型，多樣性極高，僅有7組菌株表現(xiàn)出克隆關(guān)系，且其中6組菌株均來自于同一個地區(qū)，沒有觀察到優(yōu)勢克隆菌株，相同譜型的分離株來自同一省份的同一農(nóng)場，大多數(shù)菌株來自同一省份卻是位于不同的分支，沒有顯示出相近的親緣關(guān)系。

2.2.2 RAPD分型結(jié)果 63株mcr-1陽性大腸桿菌的RAPD凝膠電泳圖如圖3所示。63株mcr-1陽性大腸桿菌經(jīng)過RAPD試驗后均得到了圖譜，菌株條帶數(shù)為1～8條。

圖3 mcr-1陽性大腸桿菌的RAPD電泳圖Fig.3 RAPD electrophoresis of mcr-1-positive E.coli

RAPD圖譜同樣使用BioNumerics 7.1軟件進行分析，因此，同樣以相似性系數(shù)為80%作為同一譜型劃分依據(jù)[13]，即圖中譜型相似系數(shù)大于80%為表現(xiàn)出克隆關(guān)系的菌株，小于80%則視為無克隆關(guān)系。結(jié)果顯示：共獲得55種RAPD譜型，有7組菌株表現(xiàn)出克隆關(guān)系，其中有4組菌株來自于同一個地區(qū)。

2.2.3 PFGE與RAPD分型比較 PFGE圖譜與RAPD圖譜對比發(fā)現(xiàn)，PFGE譜型更加多樣化，條帶數(shù)目比RAPD多且清晰度更高，其穩(wěn)定性與可分析性更強。PFGE結(jié)果與RAPD結(jié)果大致相同，僅有部分菌株在使用兩種分析方法時產(chǎn)生差異。如菌株M17GZZ5-1與菌株M17SDZ36-3在使用PFGE分析時親緣關(guān)系較遠，而RAPD顯示較近。

3 討論

多黏菌素被視為治療革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”[17]；然而由質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1的發(fā)現(xiàn)嚴重威脅了該藥的臨床應(yīng)用[1]。mcr-1被發(fā)現(xiàn)后，我國立即禁止多黏菌素作為飼料添加劑使用[18]，以期降低多黏菌素的耐藥率，防止出現(xiàn)無藥可用的局面。

本研究調(diào)查了2016～2017年從全國9個省份采集的122份糞便樣品。共得到86株耐藥菌株，其中63株為mcr-1陽性菌株。對63株mcr-1陽性菌鑒定發(fā)現(xiàn)均為大腸桿菌，該結(jié)果與Chen等[6]的報道相似，這表明mcr-1在豬養(yǎng)殖場中主要宿主是大腸桿菌，且流行率很高。其余的23株耐藥菌株未檢測到mcr-1，推測其可能攜帶其他多黏菌素耐藥基因如mcr-2、mcr-3、mcr-4等[19-20]。

本研究對63株mcr-1陽性大腸桿菌進行分子分型試驗，共得到了56個清晰的PFGE譜型，有7組菌株顯示出克隆關(guān)系；從PFGE樹狀圖中分析發(fā)現(xiàn)，我國mcr-1陽性大腸桿菌呈多樣性，沒有優(yōu)勢克隆菌株的出現(xiàn)。使用RAPD的方法對63株mcr-1陽性大腸桿菌進行分子分型試驗，共得到了55個RAPD譜型，有7對菌株顯示出克隆關(guān)系。通過對PFGE與RAPD的分型結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn)，有個別菌株使用兩種分型方法得到的結(jié)果有些許差別，有些菌株（如菌株M17GZZ5-1和菌株M17SDZ36-3）在RAPD圖譜中關(guān)系相近，在PFGE圖譜中差距較大，這種情況此前有過報道[21-22]，這可能是由于RAPD的電泳圖條帶數(shù)目少，部分條帶不清晰，對菌株進行同源性分析時造成了影響，不易分辨菌株間親緣關(guān)系。

兩種分型方法產(chǎn)生差異的可能是RAPD技術(shù)的穩(wěn)定性差、可重復(fù)性低、分辨率低和分析力低等[23-24]導(dǎo)致，而PFGE穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、可分析性強，被譽為細菌分子分型的“金標準”[25]，在分析菌株克隆關(guān)系時遠遠優(yōu)于RAPD[26-27]，目前已廣泛用于流行病學調(diào)查中，是流行病學調(diào)查中分析菌株間克隆關(guān)系的有效手段。閆大琦等[28]研究發(fā)現(xiàn)，對影響RAPD結(jié)果的因素進行優(yōu)化可以提高其穩(wěn)定性與分辨率，因此在條件不允許的情況下，也可考慮采用RAPD技術(shù)。

綜上所述，本研究調(diào)查了我國9個省份豬養(yǎng)殖場的mcr-1流行情況，發(fā)現(xiàn)mcr-1的主要宿主是大腸桿菌，并且流行率非常高。通過RAPD與PFGE試驗，發(fā)現(xiàn)63株mcr-1陽性大腸桿菌中沒有優(yōu)勢克隆菌株。對比兩種分型方法獲得的結(jié)果，PFGE圖譜帶型清晰、穩(wěn)定、可分析性強；RAPD電泳圖清晰但條帶數(shù)目少，穩(wěn)定性與可分析性相對PFGE圖譜較弱。在對細菌進行分子分型時推薦使用脈沖場凝膠電泳（PFGE）技術(shù)。對于缺乏高端設(shè)備的實驗室，優(yōu)化影響RAPD因素后可考慮采用RAPD技術(shù)。