離心法分離畢赤酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞

劉泰瑜， 馮 豪， 張建國(guó)

上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093

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離心法分離畢赤酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞

劉泰瑜， 馮 豪， 張建國(guó)*

上海理工大學(xué)食品科學(xué)與工程研究所，上海 200093

本文以畢赤酵母為研究對(duì)象，探索出一種分離活酵母細(xì)胞的新方法。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變淋巴細(xì)胞分離液和50%聚蔗糖溶液的比例，獲得不同密度的酵母細(xì)胞分離液，進(jìn)而通過(guò)離心分層的方法可使畢赤酵母活細(xì)胞主要存留于離心液的上層。當(dāng)酵母細(xì)胞分離液的密度為1.1467 g/mL(27.5% 淋巴細(xì)胞分離液+72.5%聚蔗糖溶液)，分離液上下層中酵母活細(xì)胞的分配比例差別達(dá)到最大，分別為94.67%(分離液上層)和5.33%(分離液下層)。畢赤酵母細(xì)胞濃度為4.35×108～1.13×109/mL時(shí)，活細(xì)胞在分離液上下兩層的分配比例約為95%和5%。低畢赤酵母細(xì)胞存活率有利于離心分離。本方法可用于有效分離培養(yǎng)液中的畢赤酵母活細(xì)胞。

畢赤酵母； 離心； 死細(xì)胞； 分離細(xì)胞

畢赤酵母是一種能利用甲醇為碳源，且高效表達(dá)外源蛋白的工業(yè)微生物。畢赤酵母來(lái)源多種外源蛋白作為工業(yè)用酶和蛋白藥物已經(jīng)商業(yè)化[1]。所以越來(lái)越受到人們的重視[2-5]。畢赤酵母的優(yōu)點(diǎn)總結(jié)為以下幾個(gè)方面：1、高密度發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞干重達(dá)到130 g/L[6]。2、高效表達(dá)外源蛋白，外源蛋白在畢赤酵母中含量可高達(dá)35%[7]。3、重組后的畢赤酵母遺傳穩(wěn)定。4、畢赤酵母培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便。

由于工業(yè)上的需要，篩選有更好性質(zhì)的畢赤酵母是有必要的。亞硝基胍(NTG)誘變微生物的方法已經(jīng)較為成熟，具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)[8]。NTG誘變過(guò)程需要連續(xù)誘變的步驟。通常的連續(xù)誘變是采用從前一個(gè)步驟中取一部分樣品繼續(xù)培養(yǎng)、誘變的重復(fù)操作。在這些重復(fù)操作步驟中，從前一步誘變的樣品庫(kù)中取出部分樣品的步驟中就損失了前面幾步誘變的細(xì)胞，降低了獲得目的細(xì)胞的機(jī)率。所以，去掉取樣的步驟，開發(fā)另外的方法去掉誘變后的死細(xì)胞，保存盡量多的誘變后活細(xì)胞，然后繼續(xù)誘變，可以提高NTG誘變畢赤酵母的機(jī)率。密度梯度離心法已經(jīng)成功用于分離哺乳動(dòng)物細(xì)胞[9]。畢赤酵母死細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞器被液泡降解的現(xiàn)象，所以推斷也會(huì)導(dǎo)致與畢赤酵母活細(xì)胞密度的不同。

本文摸索出一種新穎的聚蔗糖密度梯度離心方法，成功去除畢赤酵母培養(yǎng)液中的畢赤酵母死細(xì)胞。本方法可以應(yīng)用到微生物連續(xù)誘變的操作中，盡量多的除去死細(xì)胞，保留活細(xì)胞，從而保證誘變效果的最大化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、試劑及培養(yǎng)基

畢赤酵母菌株GS115為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液(密度1.077 g/mL)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。50%聚蔗糖溶液(密度1.173 g/mL)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。其它化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10 g(Oxiod)、蛋白胨20 g(Oxiod)、葡萄糖20 g(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母培養(yǎng)

在YPD培養(yǎng)基平板上將畢赤酵母菌株GS115進(jìn)行劃線分離，30℃下培養(yǎng)3d后挑取單菌落接入裝有5 mL YPD培養(yǎng)基的20 mL試管中，在30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h。然后全部轉(zhuǎn)接入裝有100 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 酵母細(xì)胞分離液的配置

以不同比例混合淋巴細(xì)胞分離液和50%聚蔗糖溶液以獲得不同密度的酵母細(xì)胞分離液。

1.2.3 總細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞比例的計(jì)算

每毫升培養(yǎng)液中畢赤酵母細(xì)胞總數(shù)采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定[10]。每毫升培養(yǎng)液中畢赤酵母活細(xì)胞數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定[11]。活細(xì)胞比例用公式1計(jì)算所得。

活細(xì)胞比例(%) =畢赤酵母活細(xì)胞數(shù)/畢赤酵母細(xì)胞總數(shù)×100

公式11.2.4 畢赤酵母細(xì)胞分離液密度對(duì)分離效果的影響

取0.1 mL菌液加入1.0 mL不同密度的聚蔗糖溶液中，在3 000 r/min下離心20 min。然后取分離液上層液體0.55 mL，轉(zhuǎn)入已滅菌的1.5 mL離心管中，兩管液體在震蕩器上震蕩10 S以混合均勻，然后分別計(jì)算每管中的畢赤酵母細(xì)胞總數(shù)和畢赤酵母活細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 畢赤酵母細(xì)胞濃度對(duì)分離效果的影響

通過(guò)稀釋方法獲得一系列不同細(xì)胞濃度的畢赤酵母培養(yǎng)液。然后用同樣方法進(jìn)行分離操作，并分別計(jì)算上下層液體中的畢赤酵母細(xì)胞總數(shù)和畢赤酵母活細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 畢赤酵母細(xì)胞存活率對(duì)分離效果的影響

分別取不同培養(yǎng)時(shí)間的畢赤酵母細(xì)胞培養(yǎng)液，利用稀釋方法調(diào)整細(xì)胞濃度保持一致，同法進(jìn)行密度梯度離心，然后分別計(jì)算上下層液體中的畢赤酵母細(xì)胞總數(shù)和活畢赤酵母細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 酵母細(xì)胞分離液密度對(duì)分離效果的影響

本研究中通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法與血球計(jì)數(shù)板法測(cè)得24 h后酵母菌原液的存活率為78%，活細(xì)胞密度為9.25×108/mL。酵母細(xì)胞分離液的密度范圍為1.1058g/mL～1.1538 g/mL。圖1為采用不同密度的酵母細(xì)胞分離液對(duì)畢赤酵母細(xì)胞存活率的影響。酵母細(xì)胞分離液密度為1.1058 g/mL時(shí)，畢赤酵母細(xì)胞的存活率為5.82%。當(dāng)酵母細(xì)胞分離液密度為1.1058 g/mL～1.1250 g/mL之間時(shí)，隨著酵母細(xì)胞分離液密度的增大，細(xì)胞存活率也呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。當(dāng)酵母細(xì)胞分離液密度高于1.1250 g/mL時(shí)，酵母細(xì)胞存活率維持在40%左右。

圖1 離心對(duì)畢赤酵母細(xì)胞存活率的影響

使用不同密度的酵母細(xì)胞分離液離心后，畢赤酵母活細(xì)胞在分離液上下層中的分配比例如圖2所示。隨著分離液密度增加，上層中酵母活細(xì)胞的比例由10.99%逐漸增大至92.80%，下層中活細(xì)胞的比例則由89.01%下降至7.20%。當(dāng)分離液密度為1.1467 g/mL(27.5%淋巴細(xì)胞分離液+72.5%的聚蔗糖溶液)，上下層中活細(xì)胞分配比例差距達(dá)到最大，比例值分別為94.67%和5.33%。

圖2 分離液密度對(duì)畢赤酵母活細(xì)胞在上下

2.2 酵母細(xì)胞濃度對(duì)活細(xì)胞在分離液上下層中分配的影響

當(dāng)培養(yǎng)液中酵母細(xì)胞濃度在4.35×107～1.39×109/mL時(shí)，使用密度為1.1467 g/mL的酵母細(xì)胞分離液，酵母活細(xì)胞在分離液上下兩層中的分配情況如圖3所示。當(dāng)酵母細(xì)胞濃度在4.35×108～1.13×109/mL的范圍內(nèi)，活細(xì)胞在分離液上下兩層中的分配比例分別為95%和5%。

圖3 畢赤酵母細(xì)胞濃度對(duì)活細(xì)胞在分離

2.3 酵母細(xì)胞存活率對(duì)分離效果的影響

畢赤酵母細(xì)胞濃度為1.2×109/mL，酵母存活率為11%時(shí)，活細(xì)胞在分離液上下層中的分配比例分別為91.01%和8.99%。隨著酵母存活率的提高，分離液上下層中活細(xì)胞的分配比例差距逐漸縮小。當(dāng)酵母細(xì)胞存活率為84.04%時(shí)，活細(xì)胞在分離液上下層中的分配比例分別為70.05%和29.55%。

圖4 畢赤酵母細(xì)胞存活率對(duì)離心分離活

3 結(jié)論

畢赤酵母的應(yīng)用前景越來(lái)越受到研究者的重視。畢赤酵母在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用。畢赤酵母表達(dá)的蛋白包括蛋白藥物[12]、工業(yè)用酶[13]、畢赤酵母作為模板改造外源蛋白糖基化，使外源蛋白的糖基化水平和結(jié)構(gòu)和人源蛋白相同[14]。畢赤酵母的高密度培養(yǎng)方法也比較成熟[15]。但是畢赤酵母在高密度培養(yǎng)時(shí)一個(gè)不足就是死亡率高。畢赤酵母高密度培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞死亡率達(dá)到35%[16]，限制了外源蛋白的表達(dá)[17]。所以，通過(guò)誘變的方式得到性能更好的畢赤酵母菌株是得到更高外源蛋白產(chǎn)量的一個(gè)途徑。連續(xù)誘變的方法是一個(gè)有效但是繁瑣的方法去誘變畢赤酵母，但是而且連續(xù)誘變操作中取樣繼續(xù)誘變的操作導(dǎo)致大部分上一步誘變細(xì)胞的喪失[18]。所以本研究中開發(fā)出一種簡(jiǎn)單的分離畢赤酵母活細(xì)胞和死細(xì)胞的方法，可以避免NTG誘變操作過(guò)程中連續(xù)取樣導(dǎo)致的大量誘變后的畢赤酵母損失。

本文以畢赤酵母為研究對(duì)象，嘗試開發(fā)一種新的分離酵母活細(xì)胞的方法。通過(guò)改變淋巴細(xì)胞分離液和50%聚蔗糖溶液的比例，獲得了不同密度的酵母細(xì)胞分離液，并成功將畢赤酵母的活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行了分離。研究結(jié)果表明，畢赤酵母活細(xì)胞主要分布在分離液的上層。當(dāng)酵母細(xì)胞分離液密度為1.1467 g/mL時(shí)，分離液上層中活細(xì)胞分配比例達(dá)94.67%。該種類型的酵母細(xì)胞分離液也能用于分離細(xì)胞濃度在4.35×108～1.13×109/mL的畢赤酵母細(xì)胞培養(yǎng)液樣品。并且低畢赤酵母細(xì)胞存活率有利于離心分離的效果。采用離心分離法的依據(jù)是細(xì)胞比重的不同。而畢赤酵母細(xì)胞的凋亡可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞密度的改變[19]。這可能是因?yàn)榧?xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累[20]，從而導(dǎo)致死細(xì)胞和活細(xì)胞的密度有所差別。

目前探索出的分離方法尚不能100%分離活細(xì)胞，此外離心會(huì)造成至少60%的畢赤酵母細(xì)胞死亡。這些問(wèn)題有待通過(guò)進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)。

[1] Martínez JL, Liu L, Petranovic D,etal. Pharmaceutical protein production by yeast: towards production of human blood proteins by microbial fermentation [J]. Curr Opin Biotechnol, 2012, 23(6):965-971.

[2] De Schutter K, Lin YC, Tiels P,etal. Genome sequence of the recombinant protein production hostPichiapastoris[J]. Nat Biotechnol, 2009, 27(6):561-566.

[3] Dalziel M, Crispin M, Scanlan CN,etal. Emerging Principles for the Therapeutic Exploitation of Glycosylation [J]. Science, 2014, 343(6166):1235681.

[4] Vogl T, Hartner FS, Glieder A. New opportunities by synthetic biology for biopharmaceutical production inPichiapastoris[J]. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(6):1094-1101.

[5] Gasser B, Prielhofer R, Marx H,etal.Pichiapastoris: protein production host and model organism for biomedical research [J]. Future Microbiol, 2013, 8(2):191-208.

[6] Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeastPichiapastoris[J]. FEMS Microbiol Rev, 2000, 24(1):45-66.

[7] Couderc R, Baratti J. Oxidation of methanol by the yeast,Pichiapastoris: Purification and properties of the alcohol oxidase [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1980, 44: 2279-2289.

[8] Harper M, Lee CJ. Genome-wide analysis of mutagenesis bias and context sensitivity of N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) [J]. Mutat Res, 2012, 731(1-2):64-67.

[9] 陳希, 許瑞, 蔣易楠等.密度梯度離心法同時(shí)分離新生大鼠原代心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞[J]. 生理學(xué)報(bào) 2015:423-430.

[10] 錢存柔.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程(第2版) [M]. 北京大學(xué)出版社; 2013.

[11] 黃亞?wèn)|, 時(shí)小艷.微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù) [M]. 中國(guó)輕工業(yè)出版社; 2012.

[12] Meehl M, Stadheim TA. Biopharmaceutical discovery and production in yeast [J]. Curr Opin Biotechnol, 2014, 30:120-127.

[13] Potvin G, Ahmad A, Zhang Z. Bioprocess engineering aspects of heterologous protein production inPichiapastoris: A review [J]. Biochemical Engineering Journal, 2012, 64:91-105.

[14] Gerngross T. Production of complex human glycoproteins in yeast [J]. Adv Exp Med Biol, 2005,564:139.

[15] Looser V, Brühlmann B, Bumbak F,etal. Cultivation strategies to enhance productivity ofPichiapastoris: A review [J]. Biotechnol Adv, 2015,3(6 Pt2):1177-1193.

[16] Hohenblum H, Borth N, Mattanovich D. Assessing viability and cell-associated product of recombinant protein producingPichiapastoriswith flow cytometry [J]. J Biotechnol, 2003, 102(3):281-290.

[17] Heyland J, Fu J, Blank LM,etal. Carbon Metabolism Limits Recombinant Protein Production inPichiapastoris[J]. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(8):1942-1953.

[18] Weis R, Luiten R, Skranc W,etal. Reliable high-throughput screening withPichiapastorisby limiting yeast cell death phenomena [J]. FEMS Yeast Research, 2004, 5:179-189.

[19] Martinet W, Raes HR, Contreras R,etal. Bax-induced cell death inPichiapastoris[J]. Biotechnology Letters, 1999, 21:821-829.

[20] Winkler J, Seybert A, K?nig L,etal. Quantitative and spatio-emporal features of protein aggregation in Escherichia coli and consequences on protein quality control and cellular ageing [J]. EMBO J, 2010,29(5):910-923.

Separation of alive and deadPichiapastoriscells by centrifugation

LIU Tai-yu, FENG Hao，ZHANG Jian-guo

Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, P.R.China

A new method of separating alivePichiapastoriscells from deadPichiapastoriscells using centrifugation approach was presented, in which alivePichiapastorisstayed in the up layer of centrifugation solution by changing the density of centrifugation solution through adjusting the ratio of Ficoll-Hypaque solution and 50% polysucrose solution. When the centrifugation method was carried out with thePichiapastoriscell density at 4.35×108/mL ～ 1.13×109/mL (27.5% of Ficoll-Hypaque solution and 72.5% of 50% polysucrose solution), it led to 95% and 5% alive stayed in up and down layer of centrifugation solution respectively, which was the highest proportion. And, low ratio of alivePichiapastoriscells provided higher distribution ratio of up layer centrifugation solution. In summary, this method effectively separate alivePichiapastorisfrom deadPichiapastoriscells.

Pichiapastoris; centrifugation; dead cells; alive cells

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21306112)；上海市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.13ZR1429100)；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃(No.slg14037)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金。

劉泰瑜(1991～)，男，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究。Tel：021-55803272，E-mail：757360730@qq.com。

*通訊作者: 張建國(guó)，男，副教授。Tel：021-55803272，E-mail：jgzhang@usst.edu.cn。