兩種桫欏屬植物組培快繁技術(shù)研究

郎月婷 馬長(zhǎng)旺 于靖 郭芮 嚴(yán)岳鴻 楊東梅

摘? 要：以陰生桫欏（Alsophila latebrosa）、大葉黑桫欏（Alsophila gigantea）為研究對(duì)象，利用綠色球狀體（Green Globular Bodies，GGB）途徑，展開(kāi)快繁體系的研究，以篩選最優(yōu)的繁殖體系。結(jié)果表明：（1）陰生桫欏的快繁體系中，1/10 MS是孢子萌發(fā)最優(yōu)培養(yǎng)配方;1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L是誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生GGB的最優(yōu)培養(yǎng)配方;1/2 MS+KT 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L是其誘導(dǎo)GGB分化的最優(yōu)培養(yǎng)配方;孢子體幼苗在泥炭土∶菜園土∶珍珠巖=3∶3∶1的基質(zhì)中成活率最高。（2）在大葉黑桫欏的快繁體系中，1/10 MS為相對(duì)較好的培養(yǎng)基;1/2 MS+0.3 mg/L IBA是誘導(dǎo)產(chǎn)生GGB的最優(yōu)培養(yǎng)配方;1/2 MS+0.3 mg/L NAA對(duì)GGB分化的促進(jìn)作用最顯著;1/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA的組合可有效促進(jìn)孢子體幼苗生根。（3）通過(guò)配子體誘導(dǎo)GGB途徑，2種桫欏屬植物從孢子萌發(fā)到幼苗移栽的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程為6～8個(gè)月。可見(jiàn)，GGB途徑不僅能提高繁殖系數(shù)，也能大大縮短桫欏屬植物的繁殖時(shí)間，為實(shí)現(xiàn)桫欏屬植物的工廠化育苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：陰生桫欏;大葉黑桫欏;GGB;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：Q813.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Technology for Rapid Propagation in Vitro of Two Alsophila Species

LANG Yueting1，2， MA Changwang1，2*， YU Jing1，2， GUO Rui1，2， YAN Yuehong3， YANG Dongmei1，2*

1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Plants of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Shanghai Chenshan Botanical Garden / Shanghai Chenshan Plant Science Research Center， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201602， China

Abstract： Alsophila latebrosa and A. gigantea both have high scientific value and ornamental value. The construction of the rapid propagation system of them by gametophy-induced Green Globular Bodies （GGB） pathway was studied. In the rapid propagation system of A. latebrosa， the most optimal culture formula for spore germination was 1/10MS， the best culture medium for inducing gametophytes to produce GGB was 1/2MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L， sucrose 30 g/L and agar 6.5 g/L， the most suitable formula for GGB differentiation factor was 1/2MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L， and the survival rate of sporophyte seedlings was the highest in the substrate （peat∶garden soil∶perlite = 3∶3∶1）. In the fast propagation system of A. gigantea， the relatively suitable medium was 1/10MS， the most optimal formula for GGB induction was 1/2MS+0.3 mg/L IBA， NAA of 0.3 mg/L had the most significant effect on GGB differentiation， the combination of 0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA could promote the rooting the sporophyte seedlings. It only took 6-8 months by gametophy-induced GGB pathway for the culture of the two Alsophila species， from spore germination to seeding transplanting. Therefore， this pathway not only increased the propagation coefficiency， but also greatly reduced the propagation time of Alsophila species， which could enhance the industrial seeding of Alsophila species.

Keywords： Alsophila latebrosa; Alsophila gigantea; green globular bodies; tissue culture

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.010

桫欏科（Cyatheaceae）隸屬于蕨類植物門（Pteridophyta）薄囊蕨綱（Leptosporangiopsida）桫欏目（Cyatheales），全世界有3屬600多種，其中中國(guó)有2屬14種2變種，分別是桫欏屬（Alsophila）和白桫欏屬（Sphaeropteris），主要分布在云南、廣西、廣東、海南、臺(tái)灣等地[1-3]。桫欏科植物古老而特別，是現(xiàn)存的唯一的樹(shù)蕨類植物，對(duì)物種起源、進(jìn)化和植物地理區(qū)系等研究具有重要價(jià)值，在古地質(zhì)學(xué)、古生物學(xué)及古氣候?qū)W等學(xué)科，常被當(dāng)做理想的研究材料。另外，桫欏科植物形態(tài)優(yōu)美，觀賞性高，在廣州、深州等地區(qū)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[4-5]。可見(jiàn)，桫欏科植物既有科學(xué)價(jià)值，又有很高的觀賞價(jià)值。但由于生境破壞、過(guò)度采挖，桫欏科植物的生存現(xiàn)狀不容樂(lè)觀。因此，有必要對(duì)其展開(kāi)繁殖技術(shù)研究，利用組織培養(yǎng)的方法構(gòu)建快繁體系，一方面保護(hù)野生的桫欏科植物資源，另一方面促進(jìn)桫欏科植物在園林上的應(yīng)用。

前人對(duì)桫欏科植物繁殖生物學(xué)的研究，主要集中在孢子形態(tài)、配子體發(fā)育等基礎(chǔ)研究，而有關(guān)桫欏科植物快繁體系構(gòu)建方面的研究較少，主要有莫新壽等[6]、陳封政等[7]、張祖榮等[8]利用無(wú)菌播種的途徑，培育桫欏科植物幼苗。目前尚未見(jiàn)到通過(guò)綠色球狀體（Green Globular Bodies，GGB）途徑培養(yǎng)桫欏科植物幼苗的報(bào)道。GGB是一種類似于蘭科原球莖的組織[9]。跟其他組培途徑相比，通過(guò)GGB途徑能大大提高蕨類植物的增殖率[10]。Haruzo等[9]發(fā)現(xiàn)通過(guò)GGB生長(zhǎng)的速率比通過(guò)叢生芽階段繁殖更高。因此后來(lái)GGB組培繁殖途徑在多種蕨類植物中得到應(yīng)用，如鳥(niǎo)巢蕨（Neottopteris nidus）、烏毛蕨（Blechnum orientale）、鳳尾蕨（Pteris cretica）等[11-14]。由于前人研究結(jié)果顯示不同的培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著性影響[15]，故本研究對(duì)其進(jìn)行單因子試驗(yàn)、雙因子交叉試驗(yàn)及多因子正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

本研究以桫欏屬植物作為研究對(duì)象，選取了陰生桫欏（Alsophila latebrosa）、大葉黑桫欏（Alsophila gigantea），利用GGB途徑展開(kāi)快繁體系的研究，以篩選最優(yōu)的繁殖體系，為桫欏屬植物的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供可靠依據(jù)。由于先采集到陰生桫欏的孢子葉，后采集到大葉黑桫欏的孢子葉，因此在進(jìn)行陰生桫欏的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，另行設(shè)計(jì)了大葉黑桫欏組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方案。

1? 材料與方法

1.1? 材料

2種桫欏屬植物的孢子均采集于海南島的五指山、吊羅山（瓊中太平鄉(xiāng)段）、黎母山。將采集的孢子葉放到紙袋中并通風(fēng)晾干，然后將自然散落的孢子收集于離心管內(nèi)，放置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 陰生桫欏快繁體系? （1）孢子的消毒及赤霉素預(yù)處理。在離心管中加入陰生桫欏孢子與無(wú)菌水，充分震蕩后靜置12 h;以4 000 r/min離心1 min，吸走上層無(wú)菌水，重復(fù)3次;加入75%酒精并充分震蕩，無(wú)菌水清洗3次;再加入4%～5% NaClO溶液，充分震蕩后，離心4 min，用蒸餾水清洗4次;分別把不同濃度的GA3（表1）加入離心管中，處理3 min，再用無(wú)菌水清洗3次，最后每個(gè)處理制成3管孢子懸濁液，3個(gè)處理共9管。

（2）不同赤霉素預(yù)處理、蔗糖濃度和無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)孢子萌發(fā)的影響。把經(jīng)過(guò)不同濃度GA3預(yù)處理的孢子懸濁液，接種在不同蔗糖濃度和無(wú)機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基上（表1）。采用L9（34）正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，共9個(gè)處理，每個(gè)處理3皿，共27皿，每皿接種0.2 mL孢子懸濁液。瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度（232）℃，光強(qiáng)15～20 μmol/（m2·s），光照周期12 h/d。接種后每周觀察1次，孢子萌發(fā)后采用光學(xué)顯微鏡觀察，統(tǒng)計(jì)孢子的萌發(fā)率。孢子萌發(fā)率計(jì)算方法：隨機(jī)取10個(gè)顯微視野，統(tǒng)計(jì)孢子總數(shù)和萌發(fā)的孢子數(shù)，計(jì)算平均孢子萌發(fā)率。

（3）NAA、6-BA對(duì)GGB誘導(dǎo)的影響。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置0、0.1、0.3、0.5 mg/L 4個(gè)水平的NAA濃度和0、0.2、0.5、1.0 mg/L 4個(gè)水平的6-BA濃度進(jìn)行雙因子交叉實(shí)驗(yàn)，共16個(gè)處理，每個(gè)處理接種10皿，重復(fù)3次。基本培養(yǎng)基為1/2 MS，蔗糖30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。接種后每周觀察1次，3～4周后繼代1次，觀察并記錄GGB大小、數(shù)量，計(jì)算GGB誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)。

（4）KT、IAA對(duì)GGB分化的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑KT（0、0.1、0.5、1.0 mg/L，4個(gè)濃度水平）、IAA（0、0.1、0.5、1.0 mg/L，4個(gè)濃度水平）設(shè)計(jì)雙因子交叉實(shí)驗(yàn)。將GGB團(tuán)切分，接種到不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度組合的培養(yǎng)基中，共16個(gè)處理，每個(gè)處理接種5瓶，重復(fù)3次。接種后每周觀察1次，統(tǒng)計(jì)GGB分化率。

（5）不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)無(wú)根苗生根的影響。將GGB分化得到的無(wú)根孢子體幼苗接種到以下5種培養(yǎng)基中：（1）1/2 MS;（2）1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L;（3）1/2 MS+BA 0.05 g/L+IBA 0.05 g/L;（4）1/2 MS+IBA 0.2 mg/L;（5）1/2 MS+NAA 0.2 mg/L。蔗糖30.0 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種3株幼孢子體。接種后每周觀察1次，觀察記錄生根數(shù)，測(cè)量根長(zhǎng)、株高，統(tǒng)計(jì)生根率。

（6）不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)孢子體幼苗移栽成活率的影響。當(dāng)孢子體幼苗長(zhǎng)到株高3～4 cm、根長(zhǎng)2～3 cm時(shí)，打開(kāi)培養(yǎng)瓶并在培養(yǎng)室煉苗3 d，再放在自然光照下煉苗7 d，然后移栽至4種培養(yǎng)基質(zhì)中（蛭石∶石沙=2∶1;菜園土∶泥炭土=2∶1;菜園土∶珍珠巖=2∶1;泥炭土∶菜園土∶珍珠巖=3∶3∶1）。每種基質(zhì)移栽3盆，每盆10株，每周觀察記錄存活情況。

1.2.2? 大葉黑桫欏快繁體系? （1）孢子懸濁液的制備。制備方法同1.2.1（1），但不進(jìn)行赤霉素預(yù)處理。

（2）不同無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)孢子萌發(fā)的影響。接種方法與培養(yǎng)條件同1.2.1（2），但大葉黑桫欏僅接種在不同無(wú)機(jī)鹽濃度的培養(yǎng)基上，無(wú)機(jī)鹽濃度為MS、1/2 MS、1/5 MS、1/8 MS、1/10 MS，共5個(gè)水平。

（3）NAA、IBA、KT、6-BA對(duì)GGB誘導(dǎo)的影響。通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出1/2 MS為GGB誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基，選擇2種細(xì)胞生長(zhǎng)素NAA、IBA和2種細(xì)胞分裂素KT、6-BA，其濃度均設(shè)置為0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4個(gè)濃度水平，共16個(gè)處理。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種5個(gè)配子體。蔗糖為30 g/L，瓊脂7 g/L，pH 5.8。接種后，每10 d觀察1次，把產(chǎn)生GGB的配子體移植到新的培養(yǎng)瓶里，完成繼代增殖，記錄GGB大小、數(shù)量，計(jì)算GGB誘導(dǎo)率。

（4）NAA、IBA、KT、6-BA對(duì)GGB分化的影響。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為NAA、IBA、KT、6-BA，濃度均設(shè)置為0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4個(gè)濃度水平，共16個(gè)處理。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種5個(gè)GGB團(tuán)?；九囵B(yǎng)基設(shè)置為MS，蔗糖為30 g/L，瓊脂6.5 g/L，pH 5.8。接種后每周觀察1次，3周后統(tǒng)計(jì)GGB分化率。

（5）IAA、NAA對(duì)無(wú)根苗生根的影響。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IAA、NAA，利用雙因子交叉分組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。這2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度水平都設(shè)置為0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4個(gè)濃度水平，共16個(gè)處理。將無(wú)根的孢子體幼苗接種到不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基里，基本培養(yǎng)基為MS，蔗糖30.0 g/L，瓊脂6.0 g/L，pH 5.8。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種5個(gè)孢子體幼苗。接種后每周觀察1次，3周后觀察、記錄生根數(shù)，測(cè)量根長(zhǎng)、株高，統(tǒng)計(jì)生根率。

（6）煉苗和移栽。方法同1.2.1（6），但僅移栽到泥炭土∶菜園土∶珍珠巖=3∶3∶1的培養(yǎng)基質(zhì)中。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 22.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，顯著性水平設(shè)置為α=0.05。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 陰生桫欏快繁體系

2.1.1? 不同濃度的赤霉素、蔗糖、無(wú)機(jī)鹽對(duì)孢子萌發(fā)的影響? 表2顯示，蔗糖、無(wú)機(jī)鹽和赤霉素3因素的P值均大于顯著性水平，即3個(gè)因素均對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)顯著性影響，因此，進(jìn)行直觀分析。表3顯示，3個(gè)因素中，無(wú)機(jī)鹽因素的極差R值最大，說(shuō)明無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)孢子萌發(fā)的影響最大，而且無(wú)機(jī)鹽濃度為1水平（1/10 MS）時(shí)，其對(duì)應(yīng)的K1值最大，為41.22，說(shuō)明低濃度無(wú)機(jī)鹽條件利于孢子萌發(fā)。其次是蔗糖因素，其極差R值僅次于無(wú)機(jī)鹽，而且蔗糖濃度為1水平（0 g/L）時(shí)，對(duì)應(yīng)的K1值最大，為42.67，顯示孢子在低糖條件下萌發(fā)效果較好。赤霉素因素的極差R值最小，說(shuō)明赤霉素對(duì)陰生桫欏孢子的萌發(fā)的影響最小，而且赤霉素為1水平（0 mg/L）時(shí)，對(duì)應(yīng)的K1值最大，說(shuō)明不用赤霉素處理有利于孢子萌發(fā)，加入赤霉素反而抑制孢子萌發(fā)。3個(gè)因素的K1值都最大，這說(shuō)明赤霉素、蔗糖、無(wú)機(jī)鹽分別在1水平時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)的促進(jìn)效果最優(yōu)。萌發(fā)率結(jié)合萌發(fā)時(shí)間來(lái)看，1/10 MS培養(yǎng)基是陰生桫欏孢子萌發(fā)的最優(yōu)培養(yǎng)基，萌發(fā)率可達(dá)62.33%，2周后開(kāi)始萌發(fā)（圖1A、圖1B）。

2.1.2? NAA、6-BA對(duì)誘導(dǎo)配子體產(chǎn)生GGB的影響? 在誘導(dǎo)率方面，方差分析結(jié)果顯示，NAA、6-BA不同濃度組合對(duì)配子體誘導(dǎo)GGB具有顯著影響;進(jìn)行多重比較結(jié)果顯示，處理10的誘導(dǎo)率最高為46.67%，與其他處理之間有顯著差異（處理5～7除外）。在增殖倍數(shù)方面，方差分析結(jié)果顯示，各處理之間GGB增殖倍數(shù)具有顯著差異，說(shuō)明2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不同濃度的組合對(duì)GGB的增殖有顯著影響;多重比較結(jié)果顯示，處理10的增殖倍數(shù)最高為3.67，與其他處理有顯著差異（處理2、5～7及14除外）。從GGB生長(zhǎng)情況來(lái)看，隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增加，GGB會(huì)褐化或配子體會(huì)變黃，但濃度過(guò)低時(shí)，GGB呈團(tuán)松散且生長(zhǎng)緩慢。大部分GGB集中在4周～6周之間被誘導(dǎo)出來(lái)，極少數(shù)在9周之后才誘導(dǎo)出來(lái)（表4）。綜上所述，配子體誘導(dǎo)產(chǎn)生GGB的最適植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為處理10，即NAA 0.3 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L，誘導(dǎo)率可達(dá)46.67%，增殖倍數(shù)可達(dá)3.67，6周左右誘導(dǎo)出GGB，且GGB團(tuán)長(zhǎng)勢(shì)良好，呈綠色球狀（圖1C～圖1F）。

2.1.3? KT、IAA對(duì)誘導(dǎo)GGB分化的影響? 方差分析結(jié)果表明，各處理之間GGB分化率具有顯著差異。處理1、4、8、11、13的分化率都為0，說(shuō)明高濃度的KT和IAA都對(duì)GGB的分化有抑制作用;KT濃度超過(guò)0.5 mg/L或者小于0.1 mg/L都不利于GGB的分化，IAA濃度超過(guò)0.5 mg/L或者小于0.1 mg/L也不利于GGB的分化，只有2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在0.1～0.5 mg/L之間時(shí)對(duì)GGB 的分化有促進(jìn)作用。從多重比較結(jié)果來(lái)看，處理6與其他處理之間具有顯著性差異，促進(jìn)GGB分化的效果最理想（表5）。分化率結(jié)合分化時(shí)間來(lái)看，誘導(dǎo)GGB分化的最適植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為處理6，即KT 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L，其誘導(dǎo)分化率為38.90%，GGB分化產(chǎn)生幼孢子體芽苗的時(shí)間為7周（圖1G～圖1H）。

2.1.4? 不同培養(yǎng)基對(duì)無(wú)根孢子體幼苗生根的影響? 方差分析結(jié)果顯示，各處理間具有顯著差異。多重比較結(jié)果顯示，處理2與其他處理差異顯著，平均生根率最高，為77.80%。所有處理的大部分幼苗在株高長(zhǎng)到3～4 cm的時(shí)候，根有2～3 cm長(zhǎng)，每株有2～4根。生根時(shí)間為3～4周，其中處理2的生根時(shí)間為3周（表6）。因此，陰生桫欏孢子體幼苗最適的生根植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方為處理2，即1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L（圖1 I）。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在不加入外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理1具有較高的生根率，與添加了植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的處理3、4、5的生根率相當(dāng)。這說(shuō)明植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑需要控制適當(dāng)?shù)臐舛?，才能促進(jìn)孢子體幼苗的生根，否則會(huì)起抑制作用。

2.1.5? 不同培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)孢子體幼苗移栽成活率的影響? 方差分析結(jié)果顯示，基質(zhì)對(duì)幼苗的成活率具有顯著性影響。幼孢子體苗在處理4（泥炭土∶菜園土∶珍珠巖=3∶3∶1）的成活率最高，4周后最高成活率可達(dá)67.73%（表7）（圖1J～圖1L）。

2.2? 大葉黑桫欏快繁體系

2.2.1? 無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)孢子萌發(fā)的影響? 方差分析結(jié)果顯示，無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)大葉黑桫欏的孢子萌發(fā)沒(méi)有顯著性影響（表8）。不同鹽濃度下，孢子都能萌發(fā)，萌發(fā)率為24.53%～40.66%，萌發(fā)時(shí)間為14～28 d。其中1/10 MS處理下的孢子萌發(fā)率最高，為40.66%，萌發(fā)時(shí)間也較早，2周開(kāi)始萌發(fā)（圖2A、圖2B）。

2.2.2? 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)GGB的影響? 結(jié)果顯示，IBA、NAA、KT、6-BA這4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)誘導(dǎo)大葉黑桫欏的配子體產(chǎn)生GGB都有促進(jìn)作用;在不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，GGB誘導(dǎo)率為0。方差分析結(jié)果顯示，處理之間GGB誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)差異顯著。從表9可見(jiàn)，2種細(xì)胞生長(zhǎng)素中，IBA誘導(dǎo)產(chǎn)生GGB的效果強(qiáng)于NAA;2種細(xì)胞分裂素中6-BA的誘導(dǎo)效果比KT更好，但6-BA隨著濃度的提高，誘導(dǎo)率大幅下降，說(shuō)明低濃度的6-BA對(duì)誘導(dǎo)GGB有良好效果。多重比較結(jié)果顯示，處理E2（IBA，濃度為0.3 mg/L）與其他處理（E14除外）均有顯著差異，誘導(dǎo)率最高，達(dá)52.00%，其次為E14（6-BA，濃度為0.5 mg/L），誘導(dǎo)率為46.47%。而處理E5（NAA，濃度為0.1 mg/L）、E8（NAA，濃度為1.0 mg/L）、E15（6-BA，濃度為1.0 mg/L）的誘導(dǎo)率為0。從增殖倍數(shù)來(lái)看，最大增殖倍數(shù)為E2處理，增殖倍數(shù)為4.67，與其他處理（E4、E13、E14除外）有顯著差異，其次為E14（6-BA，濃度0.5 mg/L），增殖倍數(shù)為4.44。從GGB出現(xiàn)的時(shí)間來(lái)看，大量產(chǎn)生GGB的時(shí)間集中在28～ 35 d，其中E2處理28 d出現(xiàn)GGB。因此，IBA和6-BA這2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)GGB增殖的促進(jìn)作用較好。0.3 mg/L IBA是誘導(dǎo)大葉黑桫欏GGB分化和增殖的最優(yōu)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方，誘導(dǎo)率可達(dá)52.00%，增殖倍數(shù)為4.67（圖2C～圖2I）。

2.2.3? 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)GGB分化的影響? 結(jié)果顯示，2種細(xì)胞生長(zhǎng)素中NNA對(duì)GGB分化的誘導(dǎo)效果要強(qiáng)于IBA，2種細(xì)胞分裂素中6-BA誘導(dǎo)GGB分化的效果要強(qiáng)于KT，4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中NAA對(duì)GGB分化的刺激作用最明顯。方差分析結(jié)果顯示，不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度處理對(duì)GGB分化率具有顯著影響（表10）。多重比較結(jié)果顯示，處理F6（NAA 0.3 mg/L）對(duì)大葉黑桫欏GGB分化的促進(jìn)作用最顯著，與其他處理（F14除外）之間有顯著差異。但是，隨著4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增加，GGB的分化率降低，甚至出現(xiàn)抑制分化的情況。如處理F4（IBA 1.0 mg/L）、F11（KT 1.0 mg/L）、F12（KT 2 mg/L）等分化率為0，出現(xiàn)了明顯的抑制分化作用。這說(shuō)明高濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)GGB的分化具有抑制作用。綜上所述，0.3 mg/L NAA對(duì)大葉黑桫欏GGB分化的促進(jìn)作用最顯著，分化率最高可達(dá)45.33%（圖2J）。

2.2.4? 不同濃度IAA、NAA對(duì)無(wú)根苗生根的影響? 方差分析結(jié)果顯示，不同濃度的IAA和NAA組合對(duì)生根率具有顯著影響。多重比較結(jié)果顯示，處理G10（0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA）的生根率最高，達(dá)52.00%，與其他處理有顯著的差異;處理G13（0 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA）的生根率最低，為21.33%（表11）?？梢?jiàn)，0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA的組合對(duì)刺激大葉黑桫欏的孢子體幼苗生根的作用最優(yōu)，生根率可達(dá)52.00%。

2.2.5? 煉苗和移栽? 煉苗和移栽的方法與陰生桫欏一樣，但是大葉黑桫欏幼苗移栽15 d后，大部分幼苗枯萎（圖2K～圖2L）。

3? 討論

本研究結(jié)果顯示，赤霉素對(duì)陰生桫欏的孢子萌發(fā)沒(méi)有顯著影響，這與前人的研究結(jié)果不同。前人的研究結(jié)果顯示，桫欏科植物有休眠期，需要用赤霉素打破休眠期[16]，但是本研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)過(guò)赤霉素處理的陰生桫欏的孢子反而具有更高的萌發(fā)率。由于在陰生桫欏的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)赤霉素對(duì)孢子的萌發(fā)沒(méi)有積極效應(yīng)。因此，在大葉黑桫欏的實(shí)驗(yàn)中僅考慮不同無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)孢子萌發(fā)率的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)陰生桫欏的孢子在低糖、低鹽濃度的培養(yǎng)基中萌發(fā)率較高。在蔗糖濃度方面，與前人的研究結(jié)果一致，劉保東等[17]、孫曉丹[18]的研究表明，低濃度蔗糖有利于腎蕨（Nephrolepis auriculata）、桂皮紫萁（Osmunda cinnamomea var. asiatica）的孢子萌發(fā);在無(wú)機(jī)鹽濃度方面，本研究結(jié)果與前人的相反，前人的研究表明，粗梗水蕨（Ceratopteris pteridoides）[19]、球子蕨（Onoclea sensibilis）[20]等在高鹽濃度的培養(yǎng)基中孢子萌發(fā)情況比在低鹽濃度中好。本研究中不同濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)大葉黑桫欏孢子萌發(fā)的影響效果不顯著，1/10MS培養(yǎng)基相對(duì)效果較好，這與徐艷等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，這可能是因?yàn)榇笕~黑桫欏孢子內(nèi)含有足夠的氮源，或者在孢子萌發(fā)過(guò)程中會(huì)分解產(chǎn)生部分氮，所以在組織培養(yǎng)時(shí)不需要外加太多氮源。

本研究中在陰生桫欏的GGB分化階段，分化率偏低。這可能與分化階段所用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類、濃度有關(guān)。前人研究表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)蕨類植物誘導(dǎo)GGB和GGB分化起著關(guān)鍵性的作用，不同種類和濃度對(duì)植物誘導(dǎo)GGB和GGB分化的影響不同[22]。本研究通過(guò)前期大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選了2種誘導(dǎo)GGB效果較好的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA、6-BA和2種對(duì)GGB分化有良好促進(jìn)作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑KT、IAA，進(jìn)行雙因子交叉實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)誘導(dǎo)GGB和GGB分化有促進(jìn)作用，但誘導(dǎo)率最高不逾50%，增殖位數(shù)不及4，分化率最高不逾40%。因此，日后還應(yīng)進(jìn)行濃度梯度更小的雙因子實(shí)驗(yàn)，甚至多因子實(shí)驗(yàn)，以篩選最合適的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合和濃度，進(jìn)一步提高陰生桫欏的GGB誘導(dǎo)率和GGB分化率。與陰生桫欏不同的是，在探究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)大葉黑桫欏誘導(dǎo)GGB的影響實(shí)驗(yàn)中，采用單因子設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，IBA對(duì)誘導(dǎo)GGB的效果最優(yōu)，誘導(dǎo)率為52.00%，增殖倍數(shù)為4.67，分化率達(dá)45.33%，均高于陰生桫欏?？梢?jiàn)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)桫欏屬植物誘導(dǎo)GGB、GGB分化的作用，具有種間差異。另外，在大葉黑桫欏GGB分化實(shí)驗(yàn)中，GGB在沒(méi)有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的情況下分化率極低，為8.0%。但加入高濃度的KT和IBA卻明顯抑制GGB分化，這說(shuō)明GGB分化需要有低濃度的外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑刺激，但高濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑反而抑制分化。

不管是單因子實(shí)驗(yàn)，還是雙因子實(shí)驗(yàn)，本研究所用的2種桫欏屬植物GGB誘導(dǎo)率和分化率都在50%左右，明顯高于水鱉蕨（Asplenium delavayi）、日本腎蕨（Nephrolepis cordfolia）。在水鱉蕨、日本腎蕨的組織培養(yǎng)過(guò)程中，前人往細(xì)胞分裂素BA中添加NAA、IBA等細(xì)胞生長(zhǎng)素，誘導(dǎo)GGB的效果最理想，但誘導(dǎo)率只有30%左右[23-24]，這說(shuō)明利用GGB途徑繁殖桫欏屬植物可行，但是日后還需要設(shè)置雙因子交叉實(shí)驗(yàn)，或者多因子實(shí)驗(yàn)，以篩選高效的GGB誘導(dǎo)配方。

在陰生桫欏幼苗移栽實(shí)驗(yàn)中，基質(zhì)為泥炭土∶菜園土∶珍珠巖=3∶3∶1時(shí)，幼苗成活率最高，達(dá)60%以上。而在大葉黑桫欏幼苗移栽時(shí)，采用這個(gè)基質(zhì)配方，其移栽后成活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陰生桫欏，這可能是由于陰生桫欏于12月進(jìn)行移栽，移栽時(shí)氣溫適宜;而大葉黑桫欏于9月份進(jìn)行移栽，移栽時(shí)氣溫過(guò)高。移栽成活率低的具體原因還需要進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)