龍鱉膠囊含藥血清對(duì)YAP抑制劑誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究

梁桂洪 黃和濤 潘建科 曾令烽 楊偉毅 羅明輝 楊園 陳紅云 韓燕鴻 趙金龍 劉軍

摘 要 目的：探索龍鱉膠囊含藥血清（后文簡(jiǎn)寫為“LBJN”）對(duì)Yes結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白（YAP）抑制劑維替泊芬（verteporfin）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：通過兩步酶消化法提取原代人膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，利用甲苯胺藍(lán)染色法和Ⅱ型膠原蛋白免疫熒光染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2、5 μmol/L verteporfin單用和分別與5%LBJN聯(lián)用48 h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，并設(shè)置溶劑對(duì)照[0.1%二甲基亞砜（DMSO）]和5%LBJN對(duì)照。采用Western blot法檢測(cè)0.1%DMSO（溶劑對(duì)照）、2 μmol/L verteporfin、2 μmol/L verteporfin+5%LBJN和0（空白對(duì)照）、2.5%LBJN、5%LBJN處理48 h后細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白[YAP、B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）、活化胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）]的表達(dá)水平;采用Western blot法檢測(cè)0（空白對(duì)照）、2.5%、5%LBJN處理48 h后細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白[哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、Beclin-1、LC3A/B ]的表達(dá)水平。結(jié)果：分離出的細(xì)胞符合軟骨細(xì)胞的特征。與0.1%DMSO比較，2、5 μmol/L verteporfin作用后細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P<0.05），且兩個(gè)濃度的作用效果相當(dāng)（P>0.05）;與單用verteporfin比較，2、5 μmol/L verteporfin與5%LBJN聯(lián)用后細(xì)胞的凋亡率均顯著降低（P<0.05）。與0.1%DMSO比較，2 μmol/L verteporfin作用后細(xì)胞中YAP、Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），而cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與2 μmol/L verteporfin比較，2 μmol/L verteporfin+5%LBJN作用后細(xì)胞中YAP、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），而cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與空白對(duì)照比較，2.5%、5%LBJN作用后細(xì)胞中YAP、Bcl-2、Beclin-1蛋白的表達(dá)水平和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ比值均顯著升高（P<0.05），而cleaved-caspase-3、mTOR蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。結(jié)論：LBJN具有阻斷YAP抑制劑verteporfin誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的自噬有關(guān)。

關(guān)鍵詞 龍鱉膠囊;含藥血清;骨性關(guān)節(jié)炎;軟骨細(xì)胞;Yes結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白抑制劑;凋亡;自噬

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To explore the protective effects of Longbie capsule contained serum （called “LBJN” for short） on the apoptosis of chondrocytes induced by YAP inhibitor verteporfin and its mechanism. METHODS： Primary human knee osteoarthritis（OA） chondrocytes were extracted by two-step enzymatic digestion， and then identified by toluidine blue staining and type Ⅱ collagen immunofluorescence staining. The effects of 2， 5 μmol/L verteporfin alone or combined with 5%LBJN on cell apoptosis were detected by flow cytometry. Solvent control（0.1% DMSO） and 5% LBJN were set. Western blot assay was adopted to detect the expression of apoptosis related proteins （YAP， Bcl-2， cleaved-caspase-3） after treated with 0.1%DMSO （solvent control）， 2 μmol/L verteporfin， 2 μmol/L verteporfin+5%LBJN和0（blank control）， 2.5% LBJN and 5% LBJN for 48 h. The expression of autophagy related proteins （mTOR， Beclin-1， LC3A/B） after treated with 0（blank control）， 2.5%， 5% LBJN for 48 h were detected by Western blot assay. RESULTS： The isolated cells accorded with the characteristics of chondrocytes. Compared with 0.1%DMSO， the apoptosis rates of cells were increased significantly after treated with 2， 5 μmol/L verteporfin （P<0.05）， and the effects of the two concentrations were similar （P>0.05）. Compared with verteporfin alone， 2， 5 μmol/L verteporfin combined with 5%LBJN could significantly decrease the apoptotic rate of cells （P<0.05）. Compared with 0.1%DMSO， the protein expression of YAP and Bcl-2 were decreased significantly after treated with 2 μmol/L verteporfin （P<0.05）， while the protein expression of cleaved-caspase-3 were increased significantly（P<0.05）. Compared with 2 μmol/L verteporfin， protein expression of YAP and Bcl-2 were increased significantly after treated with 2 μmol/L verteporfin+5%LBJN （P<0.05）， while the protein expression of cleaved-caspase-3 were decreased significantly（P<0.05）. Compared with blank control， the protein expression of YAP，Bcl-2 and Beclin-1 were increased significantly after treated with 2.5%， 5%LBJN （P<0.05）， while protein expression of cleaved-caspase-3 and mTOR were decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： LBJN can block the apoptosis of chondrocytes induced by YAP inhibitor verteporfin， and its mechanism may be related to regulating the expression of apoptosis related proteins and enhancing autophagy of chondrocytes.

KEYWORDS ? Longbie capsule; Contained serum; Osteoarthritis; Chondrocytes; YAP inhibitor; Apoptosis; Autophagy

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)軟骨的破壞性改變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆酝诵行约膊1]。軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變的主要因素，因此抑制軟骨細(xì)胞凋亡是緩解軟骨退變的有效途徑[2]。Yes結(jié)構(gòu)結(jié)合蛋白（YAP）是Hippo信號(hào)通路下游的效應(yīng)因子，同時(shí)也是轉(zhuǎn)錄共激活因子，其不僅能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等各項(xiàng)生物學(xué)行為，而且還能以不同的方式調(diào)控軟骨細(xì)胞的成熟和分化，并能維持軟骨細(xì)胞的軟骨表型[3-4]。因此，本課題組擬利用YAP抑制劑維替泊芬（verteporfin）誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，借此探索藥物對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA的主要病機(jī)是腎虛血瘀，因此補(bǔ)腎活血是該病對(duì)應(yīng)的治則[5]。本課題組前期通過循證研究證實(shí)了補(bǔ)腎活血中藥在治療OA方面具有確切的療效[6]。在補(bǔ)腎活血治則的指導(dǎo)下，本院骨傷科研發(fā)了補(bǔ)腎活血中藥龍鱉膠囊，該方由巴戟天、仙茅等多味中藥組成。方中以巴戟天、仙茅為君藥，溫腎助陽(yáng);土鱉蟲、全蝎、蜈蚣、蘄蛇等為臣藥，透骨搜風(fēng)、通絡(luò)止痛;丹參、制川烏等為佐藥，活血化瘀、散寒止痛;黃芪、牛膝為使藥，益氣升陽(yáng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，引藥下行。諸藥合用，共奏補(bǔ)腎活血之效。該方在臨床上用于治療OA取得了較為滿意的療效[7]。同時(shí)，本課題組前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，龍鱉膠囊具有抑制OA炎癥反應(yīng)的作用[8]。然而，該方對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡等相關(guān)生物學(xué)行為的影響尚不明確，阻礙了其后續(xù)改良和研發(fā)。

中藥復(fù)方含藥血清可模擬藥物在人體內(nèi)的代謝過程，從而準(zhǔn)確地反映藥物在體外實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際情況[9]。因此，本課題組擬利用血清藥理學(xué)方法[10]，探索龍鱉膠囊含藥血清（后文簡(jiǎn)寫為“LBJN”）對(duì)體外OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響。此外，有研究表明，軟骨細(xì)胞自噬失調(diào)是軟骨退行性病變的重要特征之一[11-13]，而且通過上調(diào)細(xì)胞的自噬水平可抑制軟骨細(xì)胞凋亡[14]。因此，本課題組擬同時(shí)研究LBJN對(duì)OA軟骨細(xì)胞自噬水平的影響，為揭示補(bǔ)腎活血中藥龍鱉膠囊防治OA的分子機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

TI2-E型熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司;Novo Quanteon型流式細(xì)胞儀購(gòu)自安捷倫生物（杭州）有限公司;Advantage A10型純水系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;Forma 型CO2培養(yǎng)箱、A2型生物安全柜均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;ChemiDoc Touch型高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;M1000 Pro型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士Tecan公司。

1.2 主要藥品與試劑

龍鱉膠囊（批準(zhǔn)文號(hào)為粵藥制字Z20071030，規(guī)格為每粒0.5 g）由廣東省中醫(yī)院藥劑中心生產(chǎn)，成人劑量為每次2 g、每天給藥3次;青-鏈霉素雙抗（批號(hào)15140-122）、高糖DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500BT）、澳洲胎牛血清（批號(hào)10099141）、含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶（批號(hào)25200072）、0.25%胰酶（批號(hào)15050065）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）均購(gòu)自美國(guó)Gbico公司;二甲基亞砜（DMSO）、Ⅱ型膠原蛋白酶（批號(hào)C6885）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;YAP抑制劑verteporfin原料藥（批號(hào)S1786，純度99.31%）購(gòu)自美國(guó)Selleck公司;甲苯胺藍(lán)染色液試劑盒（批號(hào)G3663）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)K300）購(gòu)自上海博彩生物科技有限公司;FITC/Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)556547）購(gòu)自美國(guó)BD公司;發(fā)光試劑ECL試劑盒（批號(hào)WBKLS0100）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;Western及碘化丙啶（PI）細(xì)胞裂解液（批號(hào)P0013）、苯甲基磺酰氟（PMSF，批號(hào)ST506）、蛋白酶抑制劑混合物（批號(hào)P1005）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗人YAP單克隆抗體（批號(hào)14074）、兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）單克隆抗體（批號(hào)3498）、兔抗人活化胱天蛋白酶3（cleaved-caspase-3）單克隆抗體（批號(hào)9664）、兔抗人哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）單克隆抗體（批號(hào)2983）、兔抗人自噬相關(guān)蛋白Beclin-1單克隆抗體（批號(hào)3495）、兔抗人自噬相關(guān)蛋白LC3A/B單克隆抗體（批號(hào)12741）、小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)3700）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)7074）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（批號(hào)7076）均購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗人Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）多克隆抗體（批號(hào)ab34712）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠10只，1.5月齡，雌雄各半，體質(zhì)量為（200±10） g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格號(hào)44002100025404，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2018-0094。大鼠購(gòu)入后于廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由飲水和進(jìn)食。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案由廣東省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.4 人OA關(guān)節(jié)軟骨組織

在獲得于廣東省中醫(yī)院明確診斷為原發(fā)性膝關(guān)節(jié)OA并住院行關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的知情同意后，收集其術(shù)后丟棄的關(guān)節(jié)軟骨組織樣本，用以提取原代OA軟骨細(xì)胞。本研究臨床組織樣本的獲取過程嚴(yán)格遵循《赫爾辛基宣言》以及我國(guó)有關(guān)臨床試驗(yàn)研究法規(guī)、規(guī)范進(jìn)行，并由廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)后實(shí)施，倫理批件號(hào)為BE2019-103。

2 方法

2.1 LBJN的制備

根據(jù)龍鱉膠囊的成人臨床用量，按體表面積法換算得大鼠的使用劑量為0.625 g/kg，于每天9：00和15：00左右根據(jù)大鼠體質(zhì)量分別灌胃給藥（以水為溶劑，灌胃體積為2 mL）1次，連續(xù)灌胃7天。末次灌胃1 h后，在大鼠麻醉狀態(tài)下于腹主動(dòng)脈采血，將血樣以3 000 r/min離心10 min，收集上清液（即為含藥血清），隨后在56 ℃水浴中孵育、滅活30 min，然后用0.22 μm針頭過濾器過濾除菌。將10只大鼠的血清獨(dú)立分裝后放置在-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 原代人OA軟骨細(xì)胞的提取與鑒定

通過兩步酶消化法提取原代人膝關(guān)節(jié)OA軟骨細(xì)胞。取患者因膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)而丟棄的關(guān)節(jié)軟骨組織，置于50 mL離心管中（含1%青-鏈霉素雙抗的PBS），將軟骨組織剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的碎片，加入適量0.25%胰酶，在37 ℃搖床上以180 r/min振蕩30 min;隨后，將軟骨組織剪成大小約0.1 cm×0.1 cm的小碎片，加入0.2%Ⅱ型膠原蛋白酶，繼續(xù)在37 ℃搖床上以180 r/min振蕩4 h。結(jié)束后，將細(xì)胞懸液過200目篩網(wǎng)，然后以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液;細(xì)胞沉淀以PBS重懸后，以1 500 r/min 離心5 min，棄去上清液;用含1%青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并將其接種于含上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)3天后首次換液，之后按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。取第2或第3代細(xì)胞，采用甲苯胺藍(lán)染色法和ColⅡ免疫熒光染色法對(duì)其進(jìn)行鑒定[15]。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OA軟骨細(xì)胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化后，制成密度為5×104 ?mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種到6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組[0.1%二甲基亞砜（DMSO）]、2 μmol/L verteporfin組（verteporfin以0.1%DMSO溶解，下同）、5 μmol/L verteporfin組、5%LBJN組、2 μmol/L verteporfin+5%LBJN組和5 μmol/L verteporfin+5%LBJN組，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔（各組濃度均根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）。各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)試劑或藥物處理48 h后，收集各孔上清液，以3 000 r/mim離心5 min后，棄去上清液;用不含EDTA的0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，然后以3 000 r/mim離心5 min，棄去上清液;用PBS重懸細(xì)胞，然后以3 000 r/mim離心5 min，棄去上清液;用1×binding buffer100 μL重懸細(xì)胞，然后每孔分別加入FITC、PI染料各5 μL，輕輕混勻，常溫下避光孵育15 min。孵育結(jié)束后，用1×binding buffer 400 μL重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白YAP、Bcl-2、cleaved-caspase-3表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OA軟骨細(xì)胞，用含EDTA的0.25%胰酶消化后，制成密度為2×105 mL-1的細(xì)胞懸液，按每孔2 mL接種到6 cm皿中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為溶劑對(duì)照組（0.1%DMSO）、2 μmol/L verteporfin組、2 μmol/L verteporfin+5%LBJN組和不同濃度[0（空白對(duì)照）、2.5%、5%]LBJN組。各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)試劑或藥物處理48 h后，收集各孔細(xì)胞，以5 000 r/mim離心5 min，棄去上清液;沉淀加入適量細(xì)胞裂解液（Western及PI細(xì)胞裂解液-PMSF-蛋白酶抑制劑混合物=100 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V），充分裂解后，以12 000 r/mim離心10 min，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白高溫變性后，取變性蛋白在60 V電壓下行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳30 min，再調(diào)節(jié)電壓至100 V繼續(xù)電泳1 h，然后在245 mA電流下轉(zhuǎn)膜（聚偏二氟乙烯膜）90 min。以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入稀釋比例均為1 ∶ 1 000的YAP、Bcl-2、cleaved-caspase-3一抗和稀釋比例為1 ∶ 2 000的β-actin一抗，4 ℃下孵育過夜;以TBST溶液洗膜5 min×3次，加入稀釋比例均為1 ∶ 1 000的相應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h;以TBST溶液洗膜5 min×3次，加入ECL顯色，放入化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)中曝光顯影。采用Image J 1.46 r軟件測(cè)定蛋白條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果分別以溶劑或空白對(duì)照組為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2.5 細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白mTOR、 Beclin-1和LC3A/B的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。按“2.4”項(xiàng)下方法制備細(xì)胞懸液、接種并常規(guī)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為0（空白對(duì)照）、2.5%LBJN、5%LBJN組。各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)試劑或藥物作用48 h后，檢測(cè)細(xì)胞中mTOR、Beclin-1和LC3A/B蛋白的表達(dá)水平。其中，mTOR、Beclin-1、LC3A/B一抗稀釋比例均為1 ∶ 1 000，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗的稀釋比例為1 ∶ 1 000，其余條件均同“2.4”項(xiàng)下。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以空白對(duì)照組為參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 人OA軟骨細(xì)胞的提取和鑒定結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)分離后正常貼壁生長(zhǎng)，于倒置顯微鏡下觀察到其呈長(zhǎng)梭形和多邊形（圖1A）。經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)顏色則較淺;細(xì)胞界限清楚，呈長(zhǎng)梭形或多邊形（圖1B）。經(jīng)免疫熒光染色后，細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的紅色熒光（圖1C），表明ColⅡ熒光染色為陽(yáng)性（ColⅡ是構(gòu)成軟骨基質(zhì)的主要成分之一，故可通過檢測(cè)其表達(dá)情況對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定[16]）。以上結(jié)果均符合OA軟骨細(xì)胞的特征，故鑒定分離出的細(xì)胞為OA軟骨細(xì)胞。

3.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果

與溶劑對(duì)照組比較，2、5 μmol/L verteporfin組細(xì)胞的凋亡率均顯著升高（P<0.05），且2、5 μmol/L verteporfin組細(xì)胞凋亡率組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果表明，2、5 μmol/L verteporfin均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且兩個(gè)濃度的作用效果相當(dāng)。與溶劑對(duì)照組比較，5%LBJN組細(xì)胞凋亡率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明正常情況下LBJN對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)影響;與單用verteporfin組比較，對(duì)應(yīng)濃度的verteporfin+LBJN聯(lián)用組細(xì)胞的凋亡率均顯著降低（P<0.05），表明LBJN具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。各組OA軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)的流式細(xì)胞圖見圖2，凋亡率的檢測(cè)結(jié)果見表1。

3.3 各組OA軟骨細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白YAP、Bcl-2、cleaved-caspase-3表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與溶劑對(duì)照組比較，2 μmol/L verteporfin組細(xì)胞中YAP、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），而cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）;與2 μmol/L verteporfin組比較，2 μmol/L verteporfin+5%LBJN組細(xì)胞中YAP、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），而cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與空白對(duì)照組比較，2.5%、5%LBJN組細(xì)胞中YAP、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），而cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。各組細(xì)胞中YAP、Bcl-2和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的電泳圖見圖3，表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果見表2。

3.4 各組OA軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白mTOR、 Beclin-1和LC3A/B表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，2.5%、5%LBJN組細(xì)胞中mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），而Beclin-1蛋白表達(dá)水平和LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ比值均顯著升高（P<0.05）。各組細(xì)胞中mTOR、Beclin-1和LC3A/B蛋白表達(dá)的電泳圖見圖4，表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果見表3。

4 討論

關(guān)節(jié)軟骨中的細(xì)胞外基質(zhì)是維持正常軟骨功能的重要物質(zhì)，其由分布在關(guān)節(jié)軟骨中唯一的軟骨細(xì)胞分泌而成，而異常的軟骨細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致軟骨細(xì)胞減弱或喪失相關(guān)分泌功能，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變的主要病理因素[17-18]。因此，通過有效的途徑抑制軟骨細(xì)胞凋亡將可能成為防治OA的重要手段。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，YAP可調(diào)控軟骨細(xì)胞成熟、增殖、分化并維持軟骨表型特征[19]，且在OA軟骨組織中YAP的表達(dá)下降[3]。因此，本研究利用YAP抑制劑verteporfin構(gòu)建軟骨細(xì)胞凋亡模型。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，2、5 μmol/L verteporfin均能促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡;且與單用verteporfin組比較，對(duì)應(yīng)濃度的verteporfin+LBJN聯(lián)用組細(xì)胞的凋亡率均顯著降低。以上結(jié)果表明，LBJN具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2是重要的凋亡抑制因子，其可通過抑制下游caspase-3的激活，有效地抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20]。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，而cleaved-caspase-3是caspase-3的活化形式，在細(xì)胞凋亡的發(fā)生過程中cleaved-caspase-3的表達(dá)水平會(huì)明顯升高[21]。由于2、5 μmol/L verteporfin對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響無(wú)明顯差異，因此本研究以2 μmol/L verteporfin為凋亡誘導(dǎo)劑進(jìn)行了后續(xù)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 μmol/L verteporfin可下調(diào)細(xì)胞中Bcl-2蛋白并上調(diào)細(xì)胞中cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá);而5%LBJN則可上調(diào)細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)并下調(diào)cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)。這表明LBJN可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而起到抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞自噬是細(xì)胞自身通過降解其內(nèi)部受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，利用物質(zhì)的循環(huán)和再利用達(dá)到維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常功能的重要活動(dòng)形式[22]。近年來(lái)有研究表明，軟骨細(xì)胞自噬的增強(qiáng)可以抑制其凋亡和衰老，改善軟骨基質(zhì)代謝活性，從而延緩OA的進(jìn)展[23]。細(xì)胞自噬過程受mTOR等基因的調(diào)控，抑制mTOR蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[24-25]。Beclin-1和LC3A/B均為自噬標(biāo)記蛋白，其表達(dá)水平的高低可反映細(xì)胞自噬的情況。其中，Beclin-1是自噬體形成過程中所必需的重要元件，LC3A/B則是構(gòu)成自噬體的重要結(jié)構(gòu)[26]。當(dāng)自噬形成時(shí)，胞漿型LC3A/B（即LC3A/B-Ⅰ）會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w中的膜型LC3A/B（即LC3A/B-Ⅱ），因此可通過檢測(cè)LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ比值的大小來(lái)判斷細(xì)胞自噬的水平[26]。本研究結(jié)果顯示，LBJN可抑制OA軟骨細(xì)胞中mTOR蛋白的表達(dá)、上調(diào)細(xì)胞中Beclin-1蛋白的表達(dá)、升高細(xì)胞中LC3A/B-Ⅱ/LC3A/B-Ⅰ比值，從而提高軟骨細(xì)胞的自噬水平。

綜上所述，LBJN具有阻斷YAP抑制劑verteporfin致OA軟骨細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白 YAP、Bcl-2、cleaved-caspase-3和自噬相關(guān)蛋白mTOR、 Beclin-1、LC3A/B的表達(dá)有關(guān)。因細(xì)胞凋亡與自噬水平之間調(diào)控關(guān)系復(fù)雜，后續(xù)將深入探索龍鱉膠囊是否可通過調(diào)節(jié)mTOR及其下游相關(guān)信號(hào)通路的活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞的自噬水平，進(jìn)一步闡明該方調(diào)控OA軟骨細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] HE Y，LI Z，ALEXANDER P G，et al. Pathogenesis of osteoarthritis：risk factors，regulatory pathways in chondrocytes，and rxperimental models[J]. Biology（Basel），2020，9（8）：194.

[ 2 ] HWANG H S，KIM H A. Chondrocyte apoptosis in the pathogenesis of osteoarthritis[J]. Int J MolSci，2015，16（11）：26035-26054.

[ 3 ] DENG Y J，LU J Q，LI W L，et al. Reciprocal inhibition of YAP/TAZ and NF-κB regulates osteoarthritic cartilage degradation[J]. Nature Communications，2018，9（1）：4564.

[ 4 ] DELVE E，CO V，REGMI S C，et al. YAP/TAZ regulates the expression of proteoglycan 4 and tenascin C in superficial-zone chondrocytes[J]. Eur Cell Mater，2020，39：48- 64.

[ 5 ] 潘建科，洪坤豪，劉軍，等.基于關(guān)聯(lián)規(guī)則和復(fù)雜系統(tǒng)嫡聚類的膝骨關(guān)節(jié)炎用藥規(guī)律研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（12）：229-232.

[ 6 ] 梁桂洪，梁祖建，林勇凱，等.補(bǔ)腎活血中藥對(duì)比塞來(lái)昔布治療膝骨性關(guān)節(jié)炎療效與安全性的Meta分析[J].中國(guó)藥房，2016，27（27）：3810-3814.

[ 7 ] 潘建科，楊偉毅，劉軍，等.龍鱉膠囊治療膝骨關(guān)節(jié)炎臨床療效及其對(duì)生活質(zhì)量的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（3）：558-561.

[ 8 ] 潘建科，謝輝，劉軍，等.龍鱉膠囊對(duì)骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)通路及NF-κB p65的調(diào)控研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（1）：65-69，261-276.

[ 9 ] 策力木格，張小峰，蘇都娜，等.血清藥物化學(xué)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國(guó)藥房，2017，28（7）：978-981.

[10] 李若飛，于春萍，蘭丁璇，等.中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與相關(guān)問題探討[J/OL].全科口腔醫(yī)學(xué)電子雜志，2019，6（31）：125，136[2021-1-15]. http：//wenku.baidu.com/view/d61394484935eefdc8d376eeaeaad1f34793117e.

[11] MUSUMECI G，CASTROGIOVANNI P，TROVATO F M，et al. Biomarkers of chondrocyte apoptosis and autophagy in osteoarthritis[J]. Int J MolSci，2015，16（9）：20560- 20575.

[12] JIANG S，LIU Y，XU B，et al. Noncoding RNAs：new re- gulatory code in chondrocyte apoptosis and autophagy[J]. Wiley Interdiscip Rev RNA，2020，11（4）：e1584.

[13] DUAN R，XIE H，LIU Z Z. The role of autophagy in osteoarthritis[J]. Front Cell DevBiol，2020，25（8）：608388.

[14] YANG H，WEN Y，ZHANG M，et al. MTORC1 coordinates the autophagy and apoptosis signaling in articular chondrocytes in osteoarthritic temporomandibularjoint[J]. Autophagy，2020，16（2）：271-288.

[15] 潘建科，謝輝，劉軍，等.龍鱉膠囊對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（8）：3234-3237.

[16] 魏鈺，魏民.人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的體外分離與培養(yǎng)[J].中國(guó)組織工程研究，2019，23（25）：4056-4061.

[17] THOMAS C M，F(xiàn)ULLER C J，WHITTLES C E，et al. Chondrocyte death by apoptosis is associated with the initiation and severity of articular cartilage degradation[J]. Int J Rheum Dis，2011，14（2）：191-198.

[18] BARRETO G，MANNINEN M，K EKLUND K. Osteoarthritis and Toll-like receptors：when innate immunity meets chondrocyte apoptosis[J]. Biology（Basel），2020，9（4）：65.

[19] XIE W，XIAO W，TANG K，et al. Yes-associated protein 1：role and treatment prospects in orthopedic degenerative diseases[J]. Front Cell Dev Biol，2020，15（8）：573455.

[20] WARREN C F A，WONG-BROWN M W，BOWDEN N A. Bcl-2 family isoforms in apoptosis and cancer[J]. Cell Death Dis，2019，10（3）：177.

[21] SAVITSKAYA M A，ONISHCHENKO G E. Mechanisms of apoptosis[J]. Biochemistry（Mosc），2015，80（11）：1393-1405.

[22] GALLUZZI L，GREEN D R. Autophagy-independent functions of the autophagy machinery[J]. Cell，2019，177（7）：1682-1699.

[23] LUO P，GAO F，NIU D，et al. The role of autophagy in chondrocyte metabolism and osteoarthritis：a comprehensive research review[J]. Biomed Res Int，2019，2019：5171602.

[24] KIM Y C，GUAN K L. mTOR：a pharmacologic target for autophagy regulation[J]. J Clin Invest，2015，125（1）：25- 32.

[25] ZHANG Y，VASHEGHANI F，LI Y H，et al. Cartilage- specific deletion of mTOR upregulates autophagy and protects mice from osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis，2015，74（7）：1432-1440.

[26] NEW J，THOMAS S M. Autophagy-dependent secretion：mechanism，factors secreted，and disease implications[J]. Autophagy，2019，15（10）：1682-1693.

（收稿日期：2021-01-20 修回日期：2021-05-21）

（編輯：林 靜）