中空纖維液相微萃取-高效液相色譜法測(cè)定荊芥及其復(fù)方制劑中胡薄荷酮的含量

李萍 胡爽 白小紅 畢小平

摘 要 目的：建立荊芥飲片及其復(fù)方制劑中胡薄荷酮的含量測(cè)定方法。方法：采用中空纖維液相微萃取-高效液相色譜法（HF-LPME-HPLC）。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以胡薄荷酮富集倍數(shù)為考察指標(biāo)，樣品相溶液鹽（NaCl）濃度、萃取時(shí)間、攪拌速度為考察因素，采用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化荊芥飲片及其復(fù)方制劑（以復(fù)方荊芥顆粒為例）的HF-LPME條件，并進(jìn)行驗(yàn)證。采用HPLC法測(cè)定胡薄荷酮的含量，色譜柱為Hypersil C18，流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。以2020年版《中國(guó)藥典》（一部）荊芥飲片項(xiàng)下HPLC法為參照，驗(yàn)證本研究所建HF-LPME-HPLC法的可行性。結(jié)果：HF-LPME最優(yōu)條件為以正壬醇為萃取溶劑，在pH為7、NaCl濃度為11%的樣品相溶液中，以800 r/min攪拌萃取36 min。HPLC方法學(xué)考察結(jié)果顯示，胡薄荷酮檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.05～5 μg/mL（r=0.999 0）;檢測(cè)限和定量限分別為0.4、1.3 ng/mL;日內(nèi)、日間精密度的RSD分別為1.8%～4.0%、1.5%～4.1%（n=3）;重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD均小于8%（n=6）;荊芥飲片和復(fù)方荊芥顆粒中胡薄荷酮的平均回收率分別為102.6%～105.1%、97.2%～102.3%，RSD分別不高于4.1%和6.2%（n=3）。采用藥典方法和本研究建立方法測(cè)得荊芥飲片中胡薄荷酮的平均含量分別為0.84 mg/g（RSD=4.3%，n=3）和0.87 mg/g（RSD=5.5%，n=3），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：建立的HF-LPME-HPLC法實(shí)現(xiàn)了對(duì)胡薄荷酮的富集與濃縮，具有較強(qiáng)的純化能力與較高的靈敏度，可用于荊芥飲片及其復(fù)方制劑中胡薄荷酮的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 中空纖維液相微萃取;高效液相色譜法;中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法;胡薄荷酮;荊芥飲片;復(fù)方制劑

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of pulegone in Schizonepetae tenuifolia decoction pieces and its compound preparation. METHODS： Hollow fiber liquid-phase microextraction coupled with HPLC （HF-LPME-HPLC） was adopted. Based on single factor tests， HF-LPME condition of S. tenuifolia decoction pieces and its compound preparation （taking Compound S. tenuifolia granule as an expample） was optimized by central composite design-response surface methodology using pulegone enrichment multiple as index， with the concentration of sample phase solution （NaCl）， extraction time and stirring speed as factors. Validation test was conducted. HPLC method was adopted to determine the content of pulegone. The determination was performed on Hypersil C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.3% phosphoric acid （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 252 nm， the column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. The feasibility of HF-LPME-HPLC method established in this study was validated by using HPLC method stated in the item of S. tenuifolia decoction pieces in 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅰ） as reference. RESULTS： The optimum HF-LPME conditions included n-nonanol as the extraction solvent， sample phase solution with 11% NaCl and pH value of 7， stirring speed of 800 r/min， extraction time of 36 min. Results of HPLC methodology investigation showed that linear range of pulegone were 0.05-5 μg/mL （r=0.999 0）. The limits of detection and quantitation were 0.4 and 1.3 ng/mL， respectively. RSDs of intra-day and inter-day precision were 1.8%-4.0% and 1.5%-4.1% （n=3）， respectively. RSDs of reproducibility and stability tests （24 h） were all lower than 8%（n=6）. Average recoveries of S. tenuifolia decoction pieces and Compound S. tenuifolia granule were 102.6%-105.1% and 97.2%-102.3%， respectively; RSDs were not higher than 4.1% and 6.2% （n=3）. The average contents of pulegone in S. tenuifolia decoction pieces determined by pharmacopoeia method and established method were 0.84 mg/g （RSD=4.3%， n=3） and 0.87 mg/g （RSD=5.5%， n=3）， respectively， with no significant difference （P>0.05）. CONCLUSIONS： The established HF-LPME-HPLC method can enrich and concentrate pulegone， shows strong purification ability and high sensitivity， and can be used to determine the contents of pulegone in S. tenuifolia decoction pieces and its compound preparation.

KEYWORDS ? Hollow fiber liquid-phase microextraction; HPLC; Central composite design-response surface methodology; Pulegone; Schizonepetae tenuifolia decoction piece; Compound pregaration

荊芥為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，性微溫、味辛[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，荊芥主要具有抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗菌、止血等作用，且常被加入到具有清熱解毒功效的中藥復(fù)方制劑中[2]。荊芥的主要有效成分為胡薄荷酮，其可降低白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、γ干擾素（IFN-γ）等炎性細(xì)胞因子水平，具有較強(qiáng)的抗炎作用[3-4]。目前，胡薄荷酮常用的定量分析方法為高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法[5-6]。對(duì)于荊芥飲片及成分更為復(fù)雜的復(fù)方制劑而言，測(cè)定其中胡薄荷酮的含量時(shí)，需先進(jìn)行樣品的前處理，而采用傳統(tǒng)的液液萃取法進(jìn)行前處理存在有機(jī)溶劑用量大、提取耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣、對(duì)儀器靈敏度要求相對(duì)較高等不足[6-7]。因此，建立一種操作簡(jiǎn)便、純化與富集能力強(qiáng)的樣品前處理方法是很有必要的。

近年來，中空纖維液相微萃?。℉F-LPME）技術(shù)因適用于復(fù)雜樣品的萃取、濃縮、純化而得以廣泛應(yīng)用[8-9]。中空纖維是一種中空、多孔的高分子材料，無毒且具有很好的生物相容性，其微米級(jí)壁孔可使小分子化合物自由通過。中空纖維不僅可以作為保護(hù)萃取相的載體和純化樣品的過濾器，克服單滴液相微萃取液滴不穩(wěn)定、分散液相微萃取純化效果差和重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，而且還有助于分析物的富集[10-13]。目前，尚未有研究采用HF-LPME技術(shù)結(jié)合HPLC法對(duì)荊芥飲片及其復(fù)方制劑中胡薄荷酮進(jìn)行分離、富集和定量分析。鑒于此，本研究以荊芥飲片和本實(shí)驗(yàn)室自制的復(fù)方荊芥顆粒為檢測(cè)樣品，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化胡薄荷酮的HF-LPME條件，并建立含量測(cè)定的HPLC方法，以期為荊芥飲片及其復(fù)方制劑的分析提供一種純化能力強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的樣品前處理方法和靈敏度高的含量測(cè)定方法。

1 材料

1.1 主要儀器

1200 Series型HPLC儀購自美國(guó)Agilent公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵購自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;KQ-50DE型超聲波清洗機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司;XS205DU型電子天平購自瑞士Mettler Toledo公司;HJ-6B型數(shù)顯多頭磁力恒溫?cái)嚢杵髻徸越饓邪姿鸩龑?shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 主要藥品與試劑

荊芥飲片（批號(hào)分別為20170524、20180721、20190521）購自運(yùn)城市神農(nóng)中藥材有限公司，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)白云娥教授鑒定為唇形科植物荊芥S. tenuifolia Briq.的干燥地上部分;胡薄荷酮對(duì)照品（批號(hào)Z05J9H63054，純度≥95%）購自上海源葉生物科技有限公司;復(fù)方荊芥顆粒（批號(hào)分別為20200908、20200909、20200910，規(guī)格為每袋10 g）由山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制;聚偏氟乙烯中空纖維（內(nèi)徑0.5 mm，孔徑0.2 μm）購自天津膜天膜科技股份有限公司;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 稱取胡薄荷酮對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度為1.12 mg/mL的對(duì)照品貯備液，4 ℃下保存，備用。臨用時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)所需用甲醇稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取荊芥飲片粉末（過二號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲（功率為400 W）處理20 min，然后以8 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀物再加甲醇10 mL，同法超聲處理并離心1次。合并2次上清液并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液①。精密稱定復(fù)方荊芥顆粒5.0 g，研磨后，置于具塞錐形瓶中，其余與荊芥飲片同法操作，即得供試品溶液②。

2.1.3 基質(zhì)溶液 按處方比例稱取復(fù)方荊芥顆粒的輔料（糊精和糖粉），同“2.1.2”項(xiàng)下“供試品溶液②”方法操作，即得基質(zhì)溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇（A）-0.3%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，60%A→65%A，8～18 min，65%A→70%A，18～19 min，70%A→60%A）;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為252 nm;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。

2.3 HF-LPME樣品前處理方法

先將中空纖維剪成長(zhǎng)約7 cm的小段，依次用丙酮、甲醇、水超聲（功率為400 W）清洗10 min，去除纖維表面及管腔內(nèi)的雜質(zhì)后，于室溫下自然晾干，備用。

按照各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)要求取規(guī)定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液或供試品溶液70 μL，以一定濃度的鹽溶液稀釋至7 mL，得到一定pH的樣品相溶液。把處理好的中空纖維浸泡于萃取劑中，至纖維壁孔充滿萃取劑后，取出，擦去纖維外表面多余的萃取劑，并用萃取劑將管腔注滿，兩端封口，彎成“U”型，然后浸入上述樣品相溶液中，于室溫下以一定轉(zhuǎn)速攪拌萃取一定時(shí)間。萃取結(jié)束后，將纖維管內(nèi)的萃取劑轉(zhuǎn)移到EP管中，用甲醇40 μL沖洗纖維內(nèi)壁，將沖洗液與EP管中的萃取劑合并，渦旋30 s，混勻后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。HF-LPME-HPLC法測(cè)定胡薄荷酮含量的操作流程示意圖見圖1。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化HF-LPME萃取條件

本研究以胡薄荷酮的富集倍數(shù)（EF，評(píng)價(jià)萃取方法對(duì)分析物富集能力的參數(shù)）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)影響HF-LPME的各條件（萃取劑、樣品相溶液pH、鹽種類及濃度、萃取時(shí)間、攪拌速度）進(jìn)行單因素考察[14]。EF計(jì)算公式為：EF=C1/C0。式中，C1指當(dāng)萃取達(dá)到平衡時(shí)萃取劑中胡薄荷酮的質(zhì)量濃度，C0指胡薄荷酮在樣品相溶液中的初始質(zhì)量濃度[15];胡薄荷酮質(zhì)量濃度根據(jù)“2.6.2”項(xiàng)下建立的回歸方程計(jì)算。

2.4.1 萃取劑的篩選 固定胡薄荷酮初始質(zhì)量濃度為0.5 ?g/mL、NaCl溶液濃度為10%、樣品相溶液pH為7、轉(zhuǎn)速為800 r/min、萃取時(shí)間為30 min，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別考察不同萃取劑（正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇）對(duì)胡薄荷酮EF的影響。結(jié)果顯示，以正壬醇為萃取劑時(shí)所得EF較大，故本研究選擇正壬醇作為萃取劑，詳見圖2。

2.4.2 鹽種類和鹽濃度的考察 固定胡薄荷酮初始質(zhì)量濃度為0.5 ?g/mL、鹽濃度為10%、樣品相溶液pH為7、萃取劑為正壬醇、轉(zhuǎn)速為800 r/min、萃取時(shí)間為30 min，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別考察不同鹽種類（NaCl、KCl、CaCl2、BaCl2、Na2SO4）對(duì)胡薄荷酮EF的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)樣品相溶液中加入NaCl溶液時(shí)，鹽析效應(yīng)較強(qiáng)，EF最大。在此基礎(chǔ)上，固定其他條件不變，進(jìn)一步考察NaCl不同濃度（0、5%、10%、15%、20%）對(duì)EF的影響。結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的增加，EF呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)NaCl濃度為10%時(shí)，EF最大，故本研究選擇NaCl濃度10%為中間值進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，詳見圖3。

2.4.3 樣品相pH的考察 固定胡薄荷酮初始質(zhì)量濃度為0.5 ?g/mL、NaCl濃度為10%、萃取劑為正壬醇、轉(zhuǎn)速為800 r/min、萃取時(shí)間為30 min，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別考察不同pH（5、6、7、8、9）樣品相溶液對(duì)胡薄荷酮EF的影響。結(jié)果顯示，隨著樣品相溶液pH的升高，EF呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)pH為7時(shí)，EF最大，故本研究確定樣品相溶液的pH為7，詳見圖4。

2.4.4 萃取時(shí)間的考察 固定胡薄荷酮初始質(zhì)量濃度為0.5 ?g/mL、NaCl濃度為10%、樣品相溶液pH為7、萃取劑為正壬醇、轉(zhuǎn)速為800 r/min，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別考察不同萃取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)胡薄荷酮EF的影響。結(jié)果顯示，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，EF呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)萃取時(shí)間為30 min時(shí)，EF最大，故本研究選擇萃取時(shí)間30 min為中間值進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，詳見圖5。

2.4.5 攪拌速度的考察 固定胡薄荷酮初始質(zhì)量濃度為0.5 ?g/mL、NaCl濃度為10%、樣品相溶液pH為7、萃取劑為正壬醇、萃取時(shí)間為30 min，其余按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別考察不同攪拌速度（500、700、850、1 000、1 300、1 600 r/min）對(duì)胡薄荷酮EF的影響。結(jié)果顯示，隨著攪拌速度的增大，EF呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì);當(dāng)攪拌速度為850 r/min時(shí)，EF最大，故本研究選擇攪拌速度850 r/min為中間值進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，詳見圖6。

2.5 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化HF-LPME萃取條件

2.5.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以EF為響應(yīng)指標(biāo)，選擇對(duì)EF影響較大的連續(xù)性因素[鹽（NaCl）濃度（A）、萃取時(shí)間（B）、攪拌速度（C）]進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。具體的因素與水平表見表1，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

2.5.2 模型建立與方程擬合 采用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合分析，得到二次多元回歸模型的方程式為EF=89.45+1.63A+6.15B+0.31C+0.20AB-0.56AC-4.00BC-4.89A2-7.32B2-2.85C2（R 2=0.996 9，P<0.000 1）。計(jì)算得模型EF失擬項(xiàng)的平方和為0.93（P=0.822 3>0.05），說明模型失擬項(xiàng)不顯著，擬合度良好，可用于分析和預(yù)測(cè)胡薄荷酮的含量變化。具體的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，此模型的F為612.48（P<0.000 1），表明模型具有顯著性。同時(shí)，一次項(xiàng)A、B，二次項(xiàng)A 2、B 2、C 2以及交互項(xiàng)BC對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響（P<0.000 1），交互項(xiàng)AC對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P<0.05），表明所選取的3個(gè)因素對(duì)胡薄荷酮EF的影響較大。

2.5.3 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert V 8.0.6軟件繪制各因素兩兩交互的響應(yīng)面圖和等高線圖，通過響應(yīng)面曲線的變化情況和等高線的稀疏程度以直觀反映出各因素對(duì)EF的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，EF與鹽濃度（A）、萃取時(shí)間（B）、攪拌速度（C）的關(guān)系密切。各響應(yīng)面圖均為開口向下的凸形曲面，所以隨著鹽濃度、萃取時(shí)間、攪拌速度的增加，EF均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，因此在較優(yōu)的鹽濃度、萃取時(shí)間與攪拌速度下，EF有極大值，且應(yīng)位于響應(yīng)曲面的頂部。

2.5.4 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design-Expert V 8.0.6軟件擬合分析，得到最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為萃取時(shí)間35.9 min、鹽濃度11.13%、攪拌速度793.86 r/min?？紤]到實(shí)際操作的可控性，最終確定最優(yōu)條件為萃取時(shí)間36 min、鹽濃度11%、攪拌速度800 r/min，并在此條件下平行進(jìn)行6次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，6次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的EF分別為88.5、93.0、88.4、92.2、90.6、91.1（RSD=2.1%，n=6），與模型預(yù)測(cè)值（91.1）比較，偏差的絕對(duì)值低于2.9%，說明該模型擬合結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。同時(shí)，分別取萃取前后的供試品溶液①（批號(hào)20170524），分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，經(jīng)HF-LPME處理后的樣品再經(jīng)HPLC分析可表現(xiàn)出明顯的濃集和純化效果，而僅采用HPLC法則無此優(yōu)勢(shì)。HF-LPME萃取前后樣品中胡薄荷酮測(cè)定的HPLC圖見圖8。

2.6 胡薄荷酮含量測(cè)定方法的建立及應(yīng)用

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液（30 μg/mL）、基質(zhì)溶液、供試品溶液①（批號(hào)20170524）、供試品溶液②（批號(hào)20200908）適量，根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，按“2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，在胡薄荷酮的保留時(shí)間處，基質(zhì)對(duì)其測(cè)定無干擾;且供試品溶液①與供試品溶液②中胡薄荷酮的色譜峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，表明該方法的專屬性較好，詳見圖9。

2.6.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下的胡薄荷酮對(duì)照品貯備液適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、9、30、50、70、90、300、500 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，分別按 “2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以樣品相溶液中胡薄荷酮質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=2 034.3x+32.3（r=0.999 0）。結(jié)果表明，胡薄荷酮在質(zhì)量濃度0.05～5 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6.3 檢測(cè)限和定量限考察 精密量取“2.6.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（5 μg/mL）適量，用甲醇進(jìn)行倍比稀釋，根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，按 “2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，以信噪比為3 ∶ 1得到的檢測(cè)限為0.4 ng/mL，以信噪比為10 ∶ 1得到的定量限為1.3 ng/mL。

2.6.4 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.6.2”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為9、50、300 μg/mL的對(duì)照品溶液各70 ?L，根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，分別按“2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)樣分析，記錄峰面積。通過每天檢測(cè)3次、連續(xù)檢測(cè)3天，分別得到日內(nèi)、日間精密度的RSD分別為1.8%～4.0%、1.5%～4.1%（n=3）。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備一批供試品溶液①（批號(hào)20170524）和供試品溶液②（批號(hào)20200908），于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)，根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，分別按“2.3”項(xiàng)下步驟操作并分析測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液①和供試品溶液②中胡薄荷酮峰面積的RSD分別為4.6%、7.2%（n=6），表明兩種供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取荊芥飲片（批號(hào)20170524）和復(fù)方荊芥顆粒（批號(hào)20200908）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液①和供試品溶液②，每個(gè)樣品均制備6份，根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，分別按“2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)樣分析，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算胡薄荷酮含量。結(jié)果顯示，供試品溶液①和供試品溶液②中胡薄荷酮含量的RSD分別為3.7%、5.8%（n=6），表明該方法的重復(fù)性較好。

2.6.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取已知含量的供試品溶液①（批號(hào)20170524）和供試品溶液②（批號(hào)20200908）各35 ?L，按已知成分含量的50%、100%、150%加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的胡薄荷酮對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份。根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，分別按“2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，荊芥飲片低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液中胡薄荷酮的平均加樣回收率分別為105.1%、102.6%、102.7%，RSD≤4.1%（n=3）;復(fù)方荊芥顆粒低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液中胡薄荷酮的平均加樣回收率分別為97.2%、98.6%、102.3%，RSD≤6.2%（n=3），說明該方法準(zhǔn)確度較好，詳見表4。

2.6.8 樣品含量測(cè)定 精密稱取3批荊芥飲片和復(fù)方荊芥顆粒適量，分別按 “2.1.2”項(xiàng)下方法制備3批供試品溶液①和供試品溶液②，根據(jù)“2.5.4”項(xiàng)下最優(yōu)萃取條件，按“2.3”項(xiàng)下步驟操作并進(jìn)樣分析，記錄峰面積并代入回歸方程計(jì)算出各樣品中胡薄荷酮含量。結(jié)果顯示，3批荊芥飲片和復(fù)方荊芥顆粒中胡薄荷酮的平均含量分別為0.87、0.063 mg/g，RSD分別為5.5%、8.0%（n=3）。

2.7 方法可行性評(píng)價(jià)

為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性，筆者分別采用2020年版《中國(guó)藥典》（一部）（后文簡(jiǎn)稱“藥典”）荊芥項(xiàng)下的HPLC法和本研究建立的HF-LPME-HPLC法對(duì)荊芥飲片（批號(hào)20170524）中胡薄荷酮的含量進(jìn)行測(cè)定[1]。結(jié)果顯示，采用藥典方法和本研究建立方法測(cè)得荊芥飲片中胡薄荷酮的平均含量分別為0.84 mg/g（RSD=4.3%，n=3）和0.87 mg/g（RSD=5.5%，n=3）。采用SPSS 20.0軟件經(jīng)t檢驗(yàn)分析可知，兩種方法測(cè)定結(jié)果在95%置信區(qū)間內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.374>0.05），表明本研究建立的方法可行，測(cè)定結(jié)果可靠。

3 討論

本研究建立了基于HF-LPME-HPLC的胡薄荷酮含量測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)荊芥飲片及其復(fù)方制劑中胡薄荷酮的濃集與純化。HF-LPME的作用機(jī)制為：聚偏氟乙烯中空纖維結(jié)構(gòu)中的多個(gè)氟原子具有強(qiáng)電負(fù)性，易于形成偶極大分子;胡薄荷酮結(jié)構(gòu)中因羰基氧的電負(fù)性較強(qiáng)，故而羰基碳帶有部分正電性，易形成偶極分子。因此，兩個(gè)分子可通過偶極-偶極靜電作用形成過渡狀態(tài)的復(fù)合物;抑或通過氟原子的富電子性，與胡薄荷酮結(jié)構(gòu)中的羰基和雙鍵共軛結(jié)構(gòu)缺電子的部分形成電荷轉(zhuǎn)移超分子，從而使樣品相中的胡薄荷酮富集于中空纖維表面，最終實(shí)現(xiàn)濃集[16]。此外，中空纖維的壁孔（0.2 μm）起到了良好的濾過與純化作用，使得經(jīng)該方法萃取后的溶液可直接進(jìn)行HPLC分析，無需再進(jìn)行濾過操作。

HF-LPME方法濃縮與富集的過程是將目標(biāo)分析物從樣品相溶液遷移到纖維壁孔內(nèi)的萃取劑中，然后再轉(zhuǎn)移到纖維腔內(nèi)的接受相中[15]。萃取劑是影響萃取結(jié)果的關(guān)鍵因素，本研究發(fā)現(xiàn)胡薄荷酮可較好地溶解于正壬醇中，且正壬醇與纖維有良好的親和力且不溶于水，加之黏度適當(dāng)，從而避免了萃取過程中試劑的擴(kuò)散和揮發(fā)[17]。同時(shí)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究采用中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)萃取條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果顯示，萃取時(shí)間是影響萃取的重要因素，當(dāng)萃取時(shí)間為36 min時(shí)，樣品相溶液與萃取相達(dá)到分配平衡;適當(dāng)?shù)柠}種類和鹽濃度（NaCl濃度為11%）可以降低胡薄荷酮在水相中的溶解度，促進(jìn)其進(jìn)入有機(jī)相，進(jìn)而被較好地萃取;在萃取過程中采用800 r/min的速度進(jìn)行攪拌，可縮短分配平衡時(shí)間、提高萃取效率[18]。筆者將本研究建立的HF-LPME-HPLC法與藥典荊芥項(xiàng)下HPLC法進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該方法測(cè)得結(jié)果與藥典方法測(cè)定結(jié)果無顯著差異，表明本研究建立方法的可信性較好。此外，經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)比，本研究建立方法的定量限僅為其他文獻(xiàn)報(bào)道的1/100～1/10[5-6，19-20]，具有較高的靈敏度。

綜上所述，本研究建立的HF-LPME-HPLC法實(shí)現(xiàn)了荊芥飲片及其復(fù)方制劑中胡薄荷酮的純化、濃集與含量測(cè)定，具有純化能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，可為建立更為便捷、高效的胡薄荷酮樣品前處理及含量測(cè)定方法以及后續(xù)體內(nèi)代謝研究奠定基礎(chǔ)。然而，該方法目前僅用于兩種樣品中胡薄荷酮的分析與測(cè)定，而關(guān)于該法在其他復(fù)雜樣品中的廣泛適用性還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-01-24 修回日期：2021-05-18）

（編輯：林 靜）