基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接法探索化濕敗毒方治療COVID-19的分子機制研究＊

郭鵬飛，方堅松，許律捷，張寶月，趙 君，劉艾林＊＊，杜冠華＊＊

(1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所 北京 100050；2.廣州中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新中心 廣州 510405)

目前，新型冠狀病毒肺炎COVID-19正在全球暴發(fā)且傳播迅速、傳染性強、各類人群普遍易感[1]。臨床尚未出現(xiàn)針對COVID-19的有效且特異性藥物與疫苗。

在國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》試行第6、7版中，化濕敗毒方是作為重型疫毒閉肺證的推薦方?；瘽駭《痉接陕樾邮蕼⑤闼灤髼棡a肺湯、宣白承氣湯和藿樸夏苓湯4方組合化裁而制。研究表明，麻杏甘石湯能較顯著地抑制流感病毒誘導細胞產(chǎn)生的細胞因子，提高機體免疫功能，從而起到治療病毒性肺炎的作用[2]；體外實驗證明宣白承氣湯對急性肺損傷大鼠肺組織具有保護作用[3]；臨床試驗表明宣白承氣湯加減能減少動脈血氧酸含量和機械通氣時間而改善痰熱壅肺型重癥肺炎患者的癥狀[4]。宣白承氣湯能夠改善血流動力學治療痰熱腑實證重癥肺炎患者[5]。2020年3月，化濕敗毒方分別選擇在金銀潭醫(yī)院、東西湖方艙醫(yī)院、將軍街社區(qū)衛(wèi)生院開展臨床療效觀察，通過對75例重癥病人使用效果觀察發(fā)現(xiàn)，化濕敗毒方相比純西醫(yī)治療在核酸轉陰和癥狀的改善方面有顯著差異。在方艙醫(yī)院452例、將軍路衛(wèi)生院124例的隨機對照治療中顯示，本方對核酸轉陰和癥狀改善有顯著的療效[6]。但化濕敗毒方對COVID-19的作用機制尚未闡明。

中藥復方成分復雜，傳統(tǒng)“1個藥物、1個基因、1種疾病”的模式很難系統(tǒng)地闡明復方各組分及其在疾病中的作用機理。而網(wǎng)絡藥理學通過大數(shù)據(jù)挖掘、高通量篩選、網(wǎng)絡分析等多種技術來揭示“藥物(復方)-靶標(基因)-疾病”相互作用的復雜體系，成為藥物研究的一種新模式[7,8]。分子對接技術通過預測受體分子和配體分子之間的結合模式和親和力從而達到輔助藥物篩選的目的，現(xiàn)已廣泛用于特定靶標的中藥及中藥復方活性成分研究[9]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術探索化濕敗毒方治療COVID-19的物質基礎及分子機制，并預測候選化學成分對SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2受體的親和力，以期為后續(xù)的實驗研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 藥物-歸經(jīng)網(wǎng)絡的構建

從ETCM[10]數(shù)據(jù)庫中檢索化濕敗毒方所含14味中藥的歸經(jīng)，藥物-歸經(jīng)網(wǎng)絡通過可視化工具Circos Tableviewer(http://mkweb.bcgsc.ca/tableviewer/visualize/)進行繪制。

1.2 化濕敗毒方中藥化學成分的篩選和分析

從ETCM、TCMSP[11]和TCMID[12]、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、BATMAN-TCM[13]數(shù)據(jù)庫中獲取復方化濕敗毒方所含14味中藥包含的化學成分，把所有的化學成分輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫進行進行口服生物利用度(OB)，藥物分子的類藥性(DL)和人腸細胞株滲透性(Caco-2)的篩選并使用R語言(Rx 64 3.2.5)繪制UpSet維恩圖進行可視化分析。

1.3 藥物-靶標網(wǎng)絡模型的構建

根據(jù)中藥名稱從ETCM、TCMID、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進行藥物靶標的預測，其中礦物藥生石膏(CSD：calcium sulfate dihydrate)的靶標從PubChem數(shù)據(jù)庫獲得。藥物-靶點網(wǎng)絡通過Cytoscape 3.2.1軟件構建。

1.4 COVID-19靶點的收集

從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中(COVID-19 data available)來獲取COVID-19的部分靶標，并結合近期文獻驗證和預測的靶標來確定COVID-19的靶標集，主要預測的方法有親和純化質譜和基于靶標的虛擬配體篩選預測[14-20]。

1.5 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡的構建

將篩選出來的藥物靶點和COVID-19潛在的靶標導入STRING[21]網(wǎng)絡平臺，設置置信度≥0.9作為條件篩選候選靶標，最終獲得藥物靶標與COVID-19潛在靶標的互作關系，并利用Cytoscape 3.2.1軟件構建PPI網(wǎng)絡。

1.6 候選靶點的富集分析

將篩選得到靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫[22]，通過限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為(Official Gene Symbol)，設定閾值P＜0.05，進行GO和KEGG信號通路富集分析；運用FunRich[23]數(shù)據(jù)庫進行候選靶標的分子功能、靶標歸經(jīng)、臨床表型等富集分析。以上分析數(shù)據(jù)都以在線繪圖網(wǎng)站Omishare Tools(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)和Circos Tableviewer進行可視化。

1.7 SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性化學成分的篩選

從PDB數(shù)據(jù)庫下載SARS-CoV-2 3CL水解酶Mpro和ACE2 3D結構*PDB格式。為了更好實現(xiàn)對接效果，選擇SARS-CoV-2受體結合域(RBD和細胞的受體ACE2的分辨率為2.45A[24]。通過CB-Dock網(wǎng)站[25]進行分子對接，執(zhí)行AutoDock Vina(1.1.2版本)。

2 結果

2.1 化濕敗毒方中的中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡

根據(jù)ETCM數(shù)據(jù)庫檢索復方的中藥的歸經(jīng)信息，構建復方的中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(圖1)。網(wǎng)絡中中藥連接度(Degree)最大的是肺經(jīng)(Lung meridian)，方中有10味中藥相對特異性的歸于肺經(jīng)，分別是麻黃、杏仁、甘草、藿香、厚樸、半夏、茯苓、黃芪、葶藶子、石膏。

2.2 化濕敗毒方中的藥物成分的分析

通過多個在線數(shù)據(jù)庫的檢索和收集，最后獲得化濕敗毒方中14味中藥共1614個化學成分。麻黃(MH)、杏仁(XR)、甘草(GC)、厚樸(HP)、蒼術(CZ)、草果(CG)、半夏(BX)、茯苓(FL)、黃芪(HQ)、葶藶子(TLZ)、赤芍(CS)、藿香(HX)、大黃(DH)和石膏(SG)中所含的化學成分分別有363、113、280、139、49、59、116、34、87、68、119、94、92、1個。以OB≥30%，DL≥0.18，Caco-2＞-0.4為標準篩選出化學成分240個，其中21個來自麻黃，18個來自杏仁，88個來自甘草，2個來自厚樸，9個來自蒼術，8個來自草果，11個來自半夏，15個來自茯苓，16個來自黃芪，7個來自葶藶子，20個來自赤芍，9個來自藿香，16個來自大黃。生石膏的化學成分是calcium sulfate dihydrate(CSD)。化濕敗毒方中篩選的14味中藥中化學成分之間相互關系的基本信息(圖2)。

圖2 化濕敗毒方14味中藥的成分分布及其協(xié)同作用

2.3 化濕敗毒方中的藥物-靶標網(wǎng)絡圖的構建

把收集到的14味中藥的1412個靶標導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，最后得到159條通路，將159條通路手動導入KEGG數(shù)據(jù)庫進行系統(tǒng)歸類，最后得到14條通路144個藥物靶標參與人體傳染病系統(tǒng)。將復方中的藥物和靶點分類數(shù)據(jù)構建成屬性表格，導入Cytoscape 3.2.1軟件中構建藥物-靶點網(wǎng)絡圖(圖3)。圖中紅色的節(jié)點代表相對特異性參與人體感染性疾病系統(tǒng)的靶標，綠色的節(jié)點代表藥物。網(wǎng)絡中共有334條邊，158個節(jié)點。在網(wǎng)絡圖中對應中心度值的變化與此節(jié)點的邊所連接的等級值(Degree)值呈正相關，Degree值越大，表明(Betweenness Centrality)中心度值越高。藥物可以同時靶向多個靶標，而一個靶標又可以和多個藥物作用起到治療疾病的作用。比如，本研究藥物靶標預測到麻黃、半夏、藿香和杏仁可以靶向TNF；臨床研究表明，與正常人相比，COVID-19感染病人血清當中的IL-6、IL-8和IL-1A顯著增加。同時，與已知的MERS-CoV感染患者(已知Th1/Th17反應)相比，COVID-19患者血清的細胞因子IL-4和TNF-α急劇升高[26]。同時，半夏、麻黃可以靶向IL2；茯苓、藿香和杏仁可以靶向IL1B；藿香可靶向IL13；草果可靶向IL10。Ruan Q對金銀灘醫(yī)院和同濟醫(yī)院確診的SARS-COV-2感染的68例死亡病例和82例出院病例進行了回顧性研究，最后表明COVID-19死亡率可能是由于病毒激活的“細胞因子綜合癥”所致[27]。說明化濕敗毒方中的中藥活性成分可能通過作用于細胞因子而達到治療COVID-19的目的。

圖3 化濕敗毒方藥物-靶標網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建和候選靶標的篩選

為了說明藥物靶標和COVID-19靶標的關系，運用STRING工具進行化學成分靶標和COVID-19靶標相互作用的PPI構建。選擇最高的置信度(Highest_confidence)≥0.9作為篩選的標準，最后獲得200個靶標。選擇其中置信度(confidence)≥0.95的72個靶標作為候選靶標，打分函數(shù)(Combined_score)見附錄1。其中，COVID-19靶標29個，藥物的靶標有51個，其中有8個靶標是COVID-19和藥物共有的靶標，包括COMT、DNMT1、IMPDH2、PRKACA、HDAC2、ITGAL、SMAD3、RIPK1(圖4)。COVID-19靶標和藥物靶標相互作用打分前10的靶標對分別是PHB-PHB2、RAE1-NUP98、DDX1-RTCB、PRKACA-PRKAR2B、RAENUP54、ITGAL-ICAM1、NUP62-NUP214、NUP62-NUP88、NUP62-NUP54和NUP88-NUP214。靶標相互作用打分越高，COVID-19靶標和藥物靶標相互作用越強。因此，選擇以上72個候選靶標作為化濕敗毒方預防和治療COVID-19的關鍵靶點，見附錄2。

附錄1 藥物靶標和COVID-19靶標之間的PPI網(wǎng)絡打分值

附錄2 72個候選靶標信息

圖4 藥物靶標和COVID-19靶標的蛋白-蛋白(PPI)相互作用網(wǎng)絡

2.5 候選靶標的GO和KEGG富集分析

為了更進一步探討化濕敗毒方通過調(diào)控候選靶標來預防和治療COVID-19的具體機制，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對72個候選靶點進行GO生物學過程、細胞組成和KEGG通路富集分析(圖5)。GO分析結果集中于：①生物學過程，涉及細胞過程、代謝、信號傳導、細胞增值、免疫等；②細胞組分中所涉及各種細胞器、突觸、突觸酶、封閉膜的發(fā)光體、細胞連接等；③分子功能集中于蛋白的結合、催化、轉錄傳導等活性；④通路富集分析集中于細胞對有機物的應答、pri-miR的正調(diào)控、凋亡信號通路、調(diào)節(jié)核質等。

圖5 化濕敗毒方候選靶標的富集分析

KEGG通路富集分析最后得到68條信號通路(P＜0.05)，涉及傳染病的通路有15條：Hepatitis B(hsa05161：P-Value=2.09×10-10)、HTLV-I infection(hsa05166：P-Value=2.60×10-10)、Epstein-Barr virus infection(hsa05169：P-Value=3.82×10-10)、Herpes simplex infection(hsa05168：P-Value=3.85×10-7)、Chagas disease(American trypanosomiasis)(hsa05142：P-Value=2.78×10-6)、Influenza A(hsa05166：PValue= 1.68× 10-5)、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection(hsa05120：P-Value=2.25×10-5)、Leishmaniasis(hsa05140：P-Value=3.15×10-5)、Measles(hsa05162：P-Value=1.42×10-4)等。說明富集到的候選靶標在傳染病系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要的作用。涉及的基因有ATP6V1A、ATP6AP1、RELA、JUN、NFKBIA、NFKB1、IKBKB等。將富集到的68條通路輸入到KEGG數(shù)據(jù)庫進行通路的系統(tǒng)分類，最后發(fā)現(xiàn)，候選靶標富集的通路歸屬于免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等。富集的結果見附錄3。

附錄3 候選靶點KEGG富集分析

2.6 候選靶標歸經(jīng)和臨床表型的分析

中醫(yī)的辨證用藥講究歸經(jīng)，歸經(jīng)指藥物作用及藥效在人體的臟腑經(jīng)絡的定位。通過藥物-歸經(jīng)網(wǎng)絡得到化濕敗毒方中有10味中藥相對特異性的歸屬于肺經(jīng)。為了證明藥物靶向靶標的歸屬，運用FunRich數(shù)據(jù)庫進行富集分析來說明候選靶標在人體組織中表達的部位。富集結果表明，候選的72個靶標中，在肺部相對特異性表達的靶標有BRD2、DNMT1、ERC1、HDAC2、PTGES2、SMAD3、MARK2、COMT、RIPK1、ATP6AP1、ACE2等，共有62個，占候選靶標的88.9%。主要表達在肺、肺癌、支氣管、支氣管肺泡等部位。說明化濕敗毒方的候選靶標在肺部表達非常高。同時，候選靶標還在H293 cells、K-562 cells、腎、子宮內(nèi)膜、胎盤、膀胱、睪丸以及腸道等組織部位表達。為了更近一步說明候選靶標參與的機制，同時對靶標的臨床表型進行富集分析(圖6)。富集結果說明，化濕敗毒方作用的候選靶標可能參與的臨床表型有：多種癌癥、支氣管息肉、尿失禁、腸出血、舒張壓和收縮壓升高以及腦干病變等。

圖6 化濕敗毒方候選靶標的組織表達和臨床表型的富集分析

2.7 SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體對接活性化學成分的結果

研究證明，SARS-CoV-2、SARS-CoV以及MERSCoV三者同為β屬冠狀病毒，瑞德西韋及氯喹可在低濃度下能有效控制Vero E6細胞的SARS-CoV-2感染，而利托那韋、洛匹那韋及利巴韋林為抗SARS-CoV的有效藥物[28-31]。因此本研究選擇上述篩選的化學成分中類藥性≥0.8的活性成分以及陽性對照的5種化學藥與SARS-CoV-2 3CL水解酶及ACE2受體分別進行分子對接(表1、圖7)。對接結果提示，與SARS-CoV-2 3CL水解酶親和力最高的前10位依次是kanzonol F(Vinascore=-9)、xambioona(Vinascore=-8.4)、洛匹那韋(lopinavir;Vina score=-8.2)、瑞德西韋(remdesivir;Vina score=-8.2)、dehydropachymic acid(Vina score=-7.8)、eburicoic acid(Vina score=-7.7)、isoglycyrol(Vina score=-7.6)、polyporenic acid C(Vina score=-7.6)、dehydroeburicoic acid(Vina score=-7.6)、cavidine(Vina score=-7.5)。預測的12個化學成分中有11個活性成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶結合能小于-7 kJ·mol-1。而且化濕敗毒方中篩選的所有活性化合物與SARS-CoV-2 3CL水解酶結合能均小于-5 kJ·mol-1。與ACE2親和力的打分最高的是dehydroeburicoic acid(Vina score=-8.5)，分數(shù)小于親和值的閾值-7.0，且都低于5個化學藥物的分數(shù)。由此可見化濕敗毒方中的化學成分可能與受體蛋白SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2形成構象能量低，結構穩(wěn)定，結合活性較高，同時也說明化濕敗毒方可能通過與ACE2作用，進而調(diào)控多個候選蛋白或者通路預防COVID-19的進一步發(fā)展。

圖7 dehydropachymic acid、kanzonol F、xambioona與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2的分子對接模式

3 討論

中醫(yī)對疫病有非常系統(tǒng)和全面的認識。新冠肺炎屬中醫(yī)“疫”范疇，主要為“濕毒”疫氣，病位主要在肺，隨著病情的發(fā)展而出現(xiàn)其它臟器的損傷[51]。清代吳鞠通于《溫病條辨》中論述到：“溫病由口鼻而入，鼻氣通于肺，口氣通于胃，肺病逆?zhèn)鳎瑒t為心包；上焦病不治，則傳中焦，胃與脾也；中焦病不治，即傳下焦，肝與腎也。始上焦，終下焦”。疫病以溫、燥、濕為主的疫病在三焦中的傳變，并可殃及肝腎等重要臟腑[32]。目前研究也表明，新冠病毒除了造成患者最常見的肺臟損傷，還出現(xiàn)心臟損害、腎功能衰竭、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、腹瀉、結膜炎、凝血功能異常等并發(fā)癥狀[33]。

網(wǎng)絡藥理學分析結果可知，候選靶標參與特定種類的癌癥的多條信號通路、多種炎癥因子的表達、神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控、機體免疫反應等。近期的研究表明，患者感染病毒后會出現(xiàn)癌癥的易感性[34]、具有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、免疫力的底下等癥狀。DAVID富集分析表明，候選靶標參與多條癌癥的通路，包括hsa05200、hsa05202、hsa05203等，參與的基因有SIN3A、CEBPB、HDAC2、SP1、HDAC1、RELA、TP53、NFKB1、NCOR1等；多條免疫的通路包括hsa04620、hsa04621、hsa04660、hsa04662等，參與的基因有ATP6V1A、ICAM1、ITGAL、FOS、ATP6AP1、JUN、TGFB1等；神經(jīng)的通路包括hsa04722、hsa05016，參與的基因有RELA、JUN、MAPK3、TP53、NFKBIA、NFKB1、IKBKB等；造成皮膚感染的通路包括hsa05168、hsa05162，參與的基因有CSNK2A2、FOS、CSNK2A1、RELA、JUN、CREBBP和TP53等(表1)。其中B cell receptor signaling pathway(hsa04662)和T cell receptor signaling pathway(hsa04660)已有文獻報道。研究發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒的機體有效免疫反應的潛在靶點靶向B細胞和T細胞表位區(qū)域可能有利于機體產(chǎn)生特殊的免疫力[35]。Bohmwald K[36]等研究人員認為冠狀病毒(Cov)對神經(jīng)存在侵襲，從而導致諸如多發(fā)性硬化癥和腦脊髓炎等臨床反應。同時，研究表明，COVID-19患者可以感染皮膚引起皮損，皮損內(nèi)存在病毒、有傳染性，主要包括皮膚瘀點、融合性紫癜和麻疹樣皮損等癥狀[37]。本研究通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，候選靶標參與的兩條通路是有關皮膚感染，包括單純皰疹感染和麻疹。

分子對接技術結果表明，與化學藥相比，中藥活性成分的對接分數(shù)更優(yōu)，潛力更大。對接的12個中藥活性成分中，kanzonol F和xambioona小于Vina最低得分的化學藥物洛匹那韋；而dehydropachymic acid、eburicoic acid、isoglycyrol、polyporenic acid C等成分和洛匹那韋、瑞德西韋的得分相近。而與ACE2對接的12個中藥活性成分中，化學成分的對接效果均優(yōu)化學藥物，這說明化濕敗毒方的活性成分在治療COVID-19中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術對化濕敗毒方防治COVID-19的物質基礎和分子機制進行預測和探討，揭示化濕敗毒方治療COVID-19“多成分、多靶點、多通路”的特點，經(jīng)過查閱相關文獻，驗證了預測結果與其他實驗和臨床研究的結果有較高的一致性。但運用網(wǎng)絡藥理學方法進行研究也存在一定的局限性。雖然本文中數(shù)據(jù)庫ETCM、TCMSP、TCMID、PubChem和BATMAN-TCM均為國內(nèi)外知名專業(yè)數(shù)據(jù)庫，對于數(shù)據(jù)庫都有定期維護和更新，可以保證化學成分和作用靶點有較好的準確性和查全性。但由于中藥化學成分有些含量較低，難以分離提純和結構鑒定，這對于全面闡釋中藥化學成分的作用具有局限性。此外，有些化學成分的活性報道較少，因此其靶點和歸經(jīng)研究也具有一定的局限性。本研究中藥成分選擇的篩選標準是OB≥30%，DL≥0.18，Caco-2＞-0.4，這三個指標對藥物成分在人體吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)及排泄(excretion)過程中扮演者非常重要的作用[11,38]。同時，預測到新的化學成分和靶標仍需后續(xù)的藥理學實驗和臨床的研究和驗證。

續(xù)表

續(xù)表