腎陽虛證動物模型造模方法及模型評價＊

唐維我，張會永，李 芹，李 佳，楊關林

(1.遼寧中醫(yī)藥大學研究生院 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 沈陽 110032)

腎陽虛證是中醫(yī)常見證候之一，又稱作元陽虧虛證、命門火衰證，是由于腎陽虧虛、機體失于溫煦所致，臨床以畏寒肢冷，腰膝以下尤甚，面色晄白或黧黑，小便清長，夜尿多，舌淡苔白，脈弱等為主要表現(xiàn)[1]。目前的動物實驗中對比《中醫(yī)虛證辨證參考標準》中的臨床腎陽虛癥狀作為造模成功與否的標志[2]。腎陽虛證臨床表現(xiàn)中的畏寒、小便清長、夜尿多，在動物行為中表現(xiàn)為蜷縮喜堆，小便清長、量多；肢冷可通過測量體表溫度得知；喜溫、倦怠可通過觀察動物的行為學表現(xiàn)獲得，表現(xiàn)為蜷縮聚堆、精神不振、反應遲鈍、活動減少、肢體力量下降等；舌脈可在動物體直接觀察。腎陽虛證在呼吸、循環(huán)、內分泌、消化等系統(tǒng)的疾病中均有表現(xiàn)，為了更好的治療腎陽虛所引起的疾病，學術界一直致力于腎陽虛證本質的研究，并探索出多種復制腎陽虛動物模型的方法。但由于動物種類、造模方法繁多，用藥種類、給藥方式均不相同，造模時間也長短不一，且造模后動物出現(xiàn)的宏觀表征各不相同，并且評價模型所用的微觀指標也各有差異，暫無模型成功的系統(tǒng)評判標準，因此如何選取適合的動物模型以及造模方式為臨床治療此類病癥具有重大意義。本文于CNKI、維普、萬方數(shù)據(jù)庫中，以“腎陽虛證”“腎陽虛模型”“溫腎助陽”等為檢索詞，查閱自1959年至2020年4月有關腎陽虛及腎陽虛相關疾病動物實驗的文獻共567篇，總結其造模方法及評價標準，并對其進行分析與探討。

1 模型動物

在腎陽虛動物模型的選取中以大鼠小鼠為主，也有少部分實驗應用了家兔[3]、豚鼠[4]與小型豬[5]，但大型的哺乳動物，例如猴、狗等應用較少。雖然小型哺乳動物有易操作、成本低的優(yōu)點，但大型哺乳動物的生理生化指標與人類更加接近[6]，因此現(xiàn)在的造模方式依然存在著一些局限。

2 造模方法

2.1 現(xiàn)代醫(yī)學病理造模

2.1.1 藥物造模

應用藥物造模的方法中多使用糖皮質激素、抗甲狀腺藥、性激素、羥基脲、腺嘌呤。1963年鄺安堃等[7]首次通過氫化可的松肌注的方法，使小鼠出現(xiàn)體質量降低、尿量增加、蜷縮萎頓、毛發(fā)萎黃無光澤等類似腎陽虛的癥狀；1984年，夏宗勤等[15]首次使用他巴唑在小鼠上建立了腎陽虛模型，發(fā)現(xiàn)小鼠的cAMP/cGMP比值下降，耗氧率明顯降低，但未對小鼠的行為學進行評價；隨后還有學者利用雌二醇或睪酮在動物體復制腎陽虛模型[16]，出現(xiàn)了皮毛無光澤、豎毛，背腹部潮濕出汗，蜷縮，精神萎靡，反應遲鈍，體重降低等表現(xiàn)。此3種方法都是通過模擬下丘腦-垂體-靶腺軸受抑制的病理狀態(tài)，使動物表現(xiàn)出“腎陽虛”的表現(xiàn)。

此外，常用的方法還有羥基脲灌胃[17]，這是因為羥基脲可抑制核苷酸的代謝與DNA的合成，使蛋白質代謝發(fā)生相應的改變，導致動物出現(xiàn)毛發(fā)枯槁疏松、脫落，攝食及活動明顯減少，精神萎靡，蜷縮、消瘦，呼吸急促等虛損癥狀，甚至死亡。南亞昀等[18]給予大鼠150 mg·kg-1腺嘌呤混懸液灌胃，30天后大鼠出現(xiàn)體重下降、弓背蜷縮、反應遲鈍、體毛稀疏、畏寒、并失去光澤等表現(xiàn)。這是因為腺嘌呤的代謝產(chǎn)物會引起腎衰，其產(chǎn)物毒性還會影響腎組織的能量代謝，進而出現(xiàn)一系列的陽虛表現(xiàn)。現(xiàn)將各種藥物造模的機制、具體應用方法、模型表現(xiàn)及特點與不足整理(表1)。

表1 藥物造模的方法、機制、模型表現(xiàn)及特點與不足

2.1.2 手術造模

手術造模的機制均為切除器官以抑制相應的下丘腦-垂體-靶腺軸，使動物體表現(xiàn)出腎陽虛的癥狀。

例如，呂銀娟等[19]切除了大鼠雙側3/4腎上腺，4周后出現(xiàn)精神不振、活動減少、體毛稀疏、干枯無光澤等表現(xiàn)，且體溫和尿17-羥皮質類固醇(尿17-OHCS)含量均顯著降低；盧德趙等[20]通過切除雙側甲狀腺，使大鼠表現(xiàn)出腎陽虛的癥狀，且有甲狀腺激素水平的下降；吳月國等[21]切除了大鼠的雙側睪丸，大鼠出現(xiàn)活動量減少，體重明顯減輕等表現(xiàn)，并伴有性激素的水平下降。將手術造模的機制、具體應用方法、模型表現(xiàn)及特點與不足整理(表2)。

表2 手術造模的方法、機制、模型表現(xiàn)及特點與不足

2.1.3 多因素造模

除單因素造模的方法外，還有學者利用多因素聯(lián)合的方法建造腎陽虛模型。例如王郭琦等[22]利用1%腺嘌呤+1%地塞米松飼料喂養(yǎng)的方法建造模型，30天后出現(xiàn)了怕冷畏寒喜暖，生殖減退，體溫降低，小便清長，蜷縮弓背，精神萎靡；血清睪酮(T)含量升高，游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(FT4)、總三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)明顯降低，尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)升高的特點；楊鑒冰等[23]利用地塞米松肌注+雙側卵巢切除的方法，誘導腎陽虛子宮發(fā)育不良模型；董興剛等[24]通過切除單側腎并注射阿霉素2次的方法建造腎陽虛的模型，但并未提及模型的表現(xiàn)。

2.2 中醫(yī)病因造模

2.2.1 房勞模型

房勞過度，又稱“腎勞”。是指房事太過耗傷腎精、腎氣而致病。由于腎藏精，為封藏之本，腎精不宜過度耗泄。據(jù)此，有學者制備出“勞倦過度、房勞不節(jié)”腎陽虛雄性小鼠模型。李震等使小鼠頻繁交配并強迫小鼠游泳，模擬房事不節(jié)、勞倦過度，誘發(fā)腎陽虛[25]。小鼠出現(xiàn)萎靡不振、畏寒怕冷、拱背少動等表現(xiàn)，其睪丸、胸腺重量、睪丸組織乳酸脫氫酶(LDH)總活性及乳酸脫氫同工酶X(LDH-X)相對活性都明顯降低。

2.1.2 老年大鼠模型

也有學者選擇年老的大鼠等作為腎陽虛模型?！秾嶒瀯游锱c實驗動物模型》中提出，若將人類的60歲作為老年的標準，老年大鼠應為1.7歲，小鼠為1.3歲，狗為10歲，豚鼠則為4.8歲。例如丁克祥等人利用2-3月齡的小鼠模擬年老模型進行實驗[26]。

2.1.3 恐傷腎模型

在中醫(yī)理論中，肝在志為怒，心在志為喜，脾在志為思，肺在志為憂，腎在志為恐。根據(jù)七情內傷的理論，沈雁等用貓嚇鼠、人嚇貓、爆竹嚇狗的方法進行造模[27]。

3 評價標準

3.1 宏觀表征

腎陽虛證臨床以畏寒肢冷，腰膝以下尤甚，面色晄白或黧黑，小便清長，夜尿多，舌淡苔白，脈弱等為主要表現(xiàn)。文獻中當實驗動物出現(xiàn)爪甲與耳廓顏色變淡、體毛枯疏并失去光澤、活動減少、反應遲鈍、弓背蜷縮、喜扎堆等畏寒怕冷表現(xiàn)，食量及飲水量減少，體溫及體質量顯著下降等表現(xiàn)時[19,28-30]，即評價造模成功。

3.2 微觀指標

腎陽虛動物模型中常有以下指標的改變，如：環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量下降，環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量升高，cAMP/cGMP比值降低[28,31]；血清三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)水平明顯下降，促甲狀腺激素釋放激素(TSH)含量減少[32,33]；雄鼠血清T含量減少、雌鼠血清雌二醇(E2)含量減少，精子計數(shù)明顯減少，活動精子百分率顯著降低，且畸形精子百分率明顯升高[34]；尿17-OH-CS含量減少[19]；睪丸、附睪、胸腺、脾等臟器指數(shù)降低，腎臟、睪丸等組織也會出現(xiàn)相應的病理改變，例如腎小球及間質內炎細胞浸潤、腎小球壞死、睪丸中生精細胞變性或壞死脫落等[35]?，F(xiàn)將腎陽虛模型動物常見的微觀指標整理(表3)。這些微觀指標的變化雖表現(xiàn)在不同動物中，但仍不能全面概括腎陽虛本質的表現(xiàn)。

表3 腎陽虛動物模型微觀指標的評價

3.3 反證方劑

方劑反證是驗證模型成功與否的必要條件，用來反證腎陽虛模型主要有藥物和方劑2種。藥物主要包括白附子[36]、菟絲子[37]、淫羊藿[38]、覆盆子[39]、山茱萸[40]等；反證方劑主要有加味五子衍宗丸[41]、金匱腎氣丸[28]、右歸丸[25]、七寶美髯丹[43]、二仙湯[38]等；反證的方式還包括針刺[44]與艾灸[45]。這些藥物與方劑均有溫腎助陽的作用，因此可以改善模型動物的腎陽虛癥狀，以及實驗室指標，進而判定模型建造成功。

4 討論

4.1 造模方法

現(xiàn)今學術界常用的腎陽虛造模方法可分為病因造模與病理造模兩方面，病理造模主要分為藥物造模、手術造模與多因素聯(lián)合造模；病因造模主要為根據(jù)中醫(yī)病因模擬腎陽虛，包括房勞模型、恐傷腎模型、老年動物模型。

藥物造模中包括糖皮質激素、抗甲狀腺藥物、性激素、腺嘌呤、羥基脲等，其中糖皮質激素、抗甲狀腺藥物、性激素3種藥物的作用機制為模擬下丘腦-垂體-靶腺軸(腎上腺、甲狀腺、性腺)受抑制時的病理狀態(tài)，從而使動物產(chǎn)生類似“腎陽虛”的虛損癥狀。其優(yōu)點在于操作簡單且易于控制，成本低，成模時間短，多為1周至3周。而且應用此類藥物時能良好的相應靶腺軸受抑制的疾病狀態(tài)，特異性強。例如當研究與生殖相關疾病時，蘇潔等[46]通過雌二醇腹腔注射的方法，使大鼠表現(xiàn)出明顯的生殖機能下降。張文釗等[47]以25 mg·kg-1的劑量給予大鼠肌肉注射，15天后大鼠出現(xiàn)肛溫降低、大便溏薄等“寒象”以及腎上腺、下丘腦、垂體臟器指數(shù)的降低；但其不足也在于只能反映單一靶腺軸受抑制的病變，例如，歐陽軼強等[48]在應用他巴唑這種抗甲狀腺藥物造模的時候，大鼠出現(xiàn)了明顯的體溫下降和血清中T3、T4的下降，但腎上腺軸、性腺軸的改變不明顯。且在使用糖皮質激素肌注造模時，經(jīng)常出現(xiàn)注射部位的潰爛[49]，動物體的損傷也會對動物的狀態(tài)以及機能造成影響。并且，氫化可的松也是建造腎陰虛模型的常用藥物[50]，在兩種模型造模方法中的不同通常在于腎陰虛的給藥時間更長，但兩種模型的給藥時間沒有明確的界限。因此雖然糖皮質激素肌注造模是現(xiàn)今最常用的模型，但仍然有許多需要解決的問題。腺嘌呤灌胃造模也是經(jīng)常使用的造模方法，但其存在著藥物劑量大、造模時間長的問題，而且腺嘌呤在體內黃嘌呤氧化酶的作用下轉變成極難溶解于水的2,8-二羥基腺嘌呤，該產(chǎn)物會沉積于腎小管引起腎衰，造成動物的死亡。

手術造模也是通過抑制靶腺軸來模擬腎陽虛的癥狀，雖然其操作簡單，但對動物體傷害較大，且不可逆，容易造成動物的死亡。復合因素造模的動物模型雖然可以從多個方向復制模型，使其反應的“腎陽虛”癥狀更加全面，但操作略復雜。

中醫(yī)的病因造?？梢院芎玫膹椭埔蚰I陽虛引起的“虛寒”癥狀，與西醫(yī)的病理造模相比更符合中醫(yī)病因，且兼夾證候少。但病因造模也存在著一定的問題，例如驚恐傷腎和房勞傷腎的模型所需的動物數(shù)量太多，房勞的模型需要多只雌鼠配合，恐傷腎中的貓嚇鼠模型，每天需要老鼠喂貓，增加了動物模型的消耗，成本過高。對于老年大鼠而言，年老的動物模型至今仍無統(tǒng)一的年老標準，受客觀因素的影響也較大。生物體發(fā)展到老年的時候也伴隨著各個系統(tǒng)的老化，并不單純是腎陽虛，在中醫(yī)理論中，衰老更多屬于腎精的虧虛，因此將老年動物等同于腎陽虛并不標準。

4.2 評價標準

就評價標準而言，現(xiàn)有的動物實驗大多通過行為學特征、生化標準和反證方劑來判斷所造成的模型是否成功。3方面應互相結合來判斷模型是否成功，但大多文獻中只對動物的行為學表現(xiàn)做出了描述，當動物出現(xiàn)毛發(fā)豎起且無光澤，精神萎靡，飲食量下降，體質量明顯降低等癥狀時即表明造模成功，未進一步結合理化指標。這樣存在的問題在于，單從外在來看，精神萎靡、飲食量下降、畏寒等癥狀并不是腎陽虛所獨有，比如脾陽虛證和腎陽虛證的癥狀表現(xiàn)就存在較大交叉性[51]，因此評價模型成功的標準并不嚴謹。而且癥狀和體征依賴于主觀評價，難免造成主觀上的偏倚。且很少有實驗研究能夠結合中醫(yī)特色的舌脈觀察，對于小鼠此類小型動物來說觀察舌脈也具有一定困難，如何將中醫(yī)更好的結合到診斷中也是值得思考的問題。

對于微觀指標來說，現(xiàn)今評判“腎陽虛”的指標均過于普遍。例如，與腎臟功能相關的研究選取皮質醇(CORT)、肌酐(Cr)；與生殖機能相關則選取睪酮(T)、雌二醇(E2)；此外還有與甲狀腺機能減退相關的甲狀腺激素等，此類指標并未有與腎陽虛的密切關聯(lián)。除此之外，還有很多實驗將腎臟或生殖器官的病理變化作為腎陽虛的評價標準，但生物體作為一個整體，疾病的發(fā)生都會造成某些器官的病理變化。因此，這些指標的選取在某種程度上與腎陽虛并不具有特異性。而且更多的文獻中并沒有對建立的動物模型行為學表現(xiàn)的描述，或微觀指標改變的敘述，甚至沒有對動物模型進行評價[52,53]。因此，指標的選取應該更加貼近于臨床，選取在臨床試驗中具有代表性的腎陽虛指標在動物體上進行評價。

筆者在總結文獻時也發(fā)現(xiàn)，利用反證方劑來評價模型也是常用的方法，但也存在著一些問題。例如李耿[54]在驗證通過氫化可的松建立的腎陽虛模型時應用了六味地黃丸和知柏地黃丸，但這兩個方劑是用來治療腎陰虛的常用方。且應用后小鼠“腎陽虛”的癥狀有所好轉，這是否說明利用氫化可的松建造的“腎陽虛”模型不一定真的能夠反應腎陽虛的本質？因此造模方法及評價標準還需要進一步明確。

4.3 模型動物

用于腎陽虛造模的動物種類繁多，雖然大鼠小鼠因其體型小、易飼養(yǎng)、易操作的特點被廣泛應用，但模型的選擇也與所研究的疾病有一定的關聯(lián)。例如，當研究腎陽虛所致的水腫或者多尿疾病時經(jīng)常使用大鼠模型[55,56]；變應性鼻炎的腎陽虛證經(jīng)常使用豚鼠作為研究動物[57]；此外，衰老模型[58,59]也經(jīng)常被使用。小型的哺乳動物雖然存在優(yōu)勢，但仍存在問題，比如中醫(yī)體系中特有的舌象、脈象信息很難收集，但這些資料在大型的哺乳動物上采集就較為容易，而且大型的哺乳動物與人類更為接近，因此可以嘗試在小型豬等大型的哺乳動物上進行腎陽虛相關的研究。

5 總結

綜上所述，雖然目前的腎陽虛造模方法各異，但均存在著一些問題。病理造模簡單易行，但未能反應腎陽虛的中醫(yī)病因。病因造模雖能反映本質，但不易操作，且所需時間較長。對于模型的評價也大多只體現(xiàn)了動物的宏觀表征，以微觀指標佐證模型建造成功的實驗較少，且也未能從微觀層面揭示腎陽虛的本質。

因此，若能將中醫(yī)病因做為前提，與病理造模結合在一起，吸取雙方的優(yōu)勢，可以建造出短時高效又符合中醫(yī)病因的模型；同時，評價標準應該將宏觀表征與能夠良好的反應腎陽虛“耗竭”狀態(tài)的微觀指標相結合，建造出更加完善的模型建造體系。