急性腎損傷模型大鼠血清及尿白蛋白的變化及其相關機制的研究＊

王木蘭，龔 琴，，查晨亮，許 嵩，左沙沙，蔣 亞，馮育林，，杜力軍，4，李 俊，＊＊

(1.江西中醫(yī)藥大學藥學院 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設備國家重點實驗室南昌 330006；3.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006；4.清華大學生命科學學院 北京 100084)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)可見于多種疾病的進程中[1-6]，為臨床所常見。在藥物研究中急性腎損傷模型血清及尿TP和ALB是觀察腎小球濾過及其腎小管吸收功能的重要指標，同時也是評判藥物對損傷腎臟相關作用的重要指標。但是從蛋白合成到排泄角度對于這種血清蛋白變化的機制及其與腎損傷之間的關系尚未見有深入研究。

本課題組曾對多種急性腎損傷動物模型腎臟炎癥壞死因子及其特點、以及其AKI的機制進行了探討[7,8]。研究過程中我們發(fā)現(xiàn)各模型動物均在出現(xiàn)尿蛋白明顯升高的同時，血清ALB卻明顯降低。己知血清蛋白的生成分泌主要在肝臟，因此AKI這種血清蛋白含量的下降是否與肝臟有關，同時在由于腎損傷影響濾過率進而導致蛋白丟失的病理基礎上是否還與其它機制有關，另外常見AKI模型中這種形成血清蛋白下降的機制是否相同等等，對此進行研究，將有助于解釋不同原因所致AKI中的血清蛋白變化，以及更準確的評價相關中藥。為此，本文就順鉑、RIR和慶大霉素所致的3種AKI模型，對其肝臟ALB生成及影響腎臟相關蛋白濾過的因子進行研究，以期為急性腎損傷中藥研究中提供相關作用靶點及其實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠48只，體重180-200 g(用于順鉑和慶大霉素實驗)；SPF級SD雄性大鼠40只，體重260-280 g，(用于腎動靜脈結扎實驗，)上述實驗動物均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：【SCXK(湘)2016-0002】。依據(jù)應用實驗動物的3R原則給予人道的關懷。飼養(yǎng)及無菌手術實驗在江西本草天工科技有限責任公司屏障環(huán)境實驗室完成，使用許可證號：【SYXK(贛)2018-0002】，飼養(yǎng)條件：室溫21℃-25℃，相對濕度50%-65%，光暗循環(huán)12 h/12 h，自由飲食飲水。本實驗研究方案獲得江西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，審查號為：JXLLSC-2018-33，且實驗過程嚴格遵守實驗動物福利與倫理委員會相關指南。

1.2 藥物與試劑

順鉑(Cisplatin)，規(guī)格5 mg·mL-1，江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司生產，批號：170503，臨用前用生理鹽水配成1.5 mg·mL-1溶液備用。硫酸慶大霉素(Gentamicin)注射劑，河南潤弘制藥股份有限公司，批號：1610202，規(guī)格40 mg·mL-1。TP、ALB生化試劑盒，購自日本純藥工業(yè)株式會社，批號：TR368/DF774。G250染色液(檢測勻漿中TP)，碧云天，批號：102518190429。ALB試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20191205。肌酐(Cre)，批號：19051012，北京利德曼生化股份有限公司；尿素氮(BUN)，批號：AR771/AR772；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，批號：AR794、TH622；天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)，批號：ER372/ER373，均購自日本純藥工業(yè)株式會社。Realtime PCR Super mix，北京全式金生物技術有限公司，批號：N10822。TRIzol，ambion公司，批號:229010。RIPA Lysis Buffer(Strong)，CWBIO，批 號：01408/20425；5×蛋白上樣緩沖液，Solarbio，批號：20191129。糖原PAS染色試劑盒，LEAGENE，批號：1022A19。

1.3 實驗儀器

7100型全自動生化分析儀(日立公司)。TDZ4型臺式低速離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司)。7500型熒光定量PCR儀(AB公司)。ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司)。5810R型冷凍離心機(Eppendorf公司)。MDF-392型超低溫冰箱(日本SONY)。Olympus CKX41光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組和造模

三種模型實驗均分為對照組、模型組。順鉑模型采用尾靜脈注射順鉑5 mg·kg-1，對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水[11]。結扎腎動靜脈模型[10]，將大鼠麻醉固定，以手術剪剪開腹部皮膚，并打開腹腔，分離右腎腎門，用手術線進行結扎后，分離右腎與腎包膜，切除右腎。用手術線將腎門動靜脈打活結結扎，40 min后松開活結以使腎臟血液復灌，取血流復灌通暢，腎臟顏色由暗漸紅者為手術成功?？p合腹壁及皮膚，以碘酒消毒手術創(chuàng)口，腹腔注射青霉素以防感染，手術完成后送入籠內觀察飼養(yǎng)。對照組為假手術組，其不切除腎和結扎腎動靜脈其余程序同模型組大鼠。慶大霉素所致大鼠急性腎損傷實驗[9]，大鼠腹腔注射硫酸慶大霉素劑量140 mg·kg-1，連續(xù)注射7天，對照組腹腔注射等體積生理鹽水。實驗結束時，大鼠眶上靜脈竇取血，室溫靜置1 h，3500 r/min，離心10 min，取血清，-20℃保存，以備測血清生化。順鉑及慶大霉素模型取左腎臟、肝臟保存至-80℃冰箱凍存，用于表達mRNA及其他指標檢測，取右腎10%福爾馬林固定，以備觀察組織形態(tài)學變化；RIR模型肝臟、左腎從中間縱切，一半保存至-80℃冰箱凍存，用于表達mRNA及其他指標檢測，另一半10%福爾馬林固定，以備觀察組織形態(tài)學變化。

1.4.2 生化檢測指標

①血清相關指標檢測：順鉑、結扎腎動靜造模5天后，慶大霉素造模7天后，動物異氟烷麻醉，眼眶靜脈采血，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清中BUN，Cre，ALT，AST，TP，ALB。②尿TP，ALB檢測：采血前1晚禁食不禁水，并將動物放入代謝籠中，收集過夜尿，量尿量，全自動生化儀檢測尿總蛋白(UTP)和尿微量白蛋白(UmALB)，最后乘以尿量，得到尿TP和ALB的量。

1.4.3 肝臟組織中TP、ALB檢測

①稱取約50 mg組織，加入1 mL RIPA裂解，研磨至無組織塊，定量取800μL裂解液，加200μL5×蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水中煮30 min，冷卻后，冷凍離心機12000 r/min，離心15 min，取上清，制備蛋白樣品。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，直接進行考馬斯亮藍染色，經過洗脫后，拍照分析，得出各樣品的總蛋白灰度值，并除以加入的液體量和所秤肝臟的重量[12]。②稱取100 mg組織，用9倍體積的生理鹽水制備勻漿，3500 r/min，離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書檢測勻漿中TP、ALB的含量。

1.4.4 腎組織形態(tài)學檢查

腎組織經4%甲醛固定后，常規(guī)切片，脫蠟后，過碘酸溶液10 min，蒸餾水漂洗4次，Schiff溶液保濕盒中避光30 min，漂洗，蘇木精染色3 min，自來水沖洗3 min，鹽酸酒精分化5 s，自來水沖洗15 min，逐級脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍片。

1.4.5 mRNA表達

按照試劑盒操作說明及其相關文獻[13]制備mRNA，并進行Real time PCRmRNA表達分析。所用引物均由南京金斯瑞生物公司合成。引物序列參考NCBI GenBank設計，以β-actin作內參。引物序列如下：大鼠，β-ɑctin，sense(正向)：5'-CTCTGTGTGGATTGGTGGCT-3'，antisense(反向)：5'-GCTCAGTAACAGTCCGCCT-3'；Cebp-α(CAAT enhancer-binding proteinα)，sense：5'-TACCGAGTAGGGGGAGCAAA-3'，anti-sense：5'-AAGCAAGGGGCTAAGAACCC-3'；Hnf(hepatic nuclear factor)，sense:5'-GAGCTGCCAACCAAAAAGGG-3，antisense:5'-CCAGTTGTAGACACGCACCT-3'；Nfy(nuclear factor Y)，sense:5'-GATCGTTCAGACAGGAGCCA-3'，anti-sense:5'-TGGCATTCACATACAACGGC-3；Alb(albumin)，sense：5'-GTGAGCGAGAAGGTCACCAA-3'，anti-sense:5'-TTTCACCAGCTCAGCGAGAG-3'。

1.4.6 蛋白表達

按照試劑盒操作說明及其相關文獻[14]制備蛋白樣品，采用Western blot法檢測肝臟ALB，腎臟ALB、Nephrin、Podocin蛋白表達水平。所用產品如下：一抗：內參β-actin(TA-09)，批號：19C0508，北京中杉金橋；ALB，兔抗多克隆抗體，16475-1-AP，Proteintech，美國；Nephrin，兔抗單克隆抗體，ab216341，Abcam，英國；Podocin，兔抗多克隆抗體，TA351459，ORIGENE，美國。IL-6，ab9324，鼠抗單克隆抗體，Abacm，英國。TNFα，SC-52746，小鼠抗單克隆抗體，SANTA CRUZ BioTECHNOLOGY。二抗：山羊抗小鼠IgG-HRP(ZB2305)，批號：140193；山羊抗兔IgGHRP(ZB2301)，批號：141987，均購于北京中杉金橋。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。以SPSS22.0軟件或GraphPad8.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理。采用單因素方差分析(ANOVA)，具有顯著性差異后，再進行兩兩t檢驗。以P＜0.05為統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 血清及尿相關生化指標的變化

與正常組比較，3種急性腎損傷模型血清TP均有下降趨勢(P=0.125，0.181，0.105)，尿TP顯著升高；血清ALB較正常組均有顯著降低，尿ALB顯著升高，模型組大鼠血清BUN和Cre均明顯高于對照組，表明3種模型大鼠均出現(xiàn)不同程度的腎臟損傷(圖1)。

圖1 三種急性腎損傷大鼠腎功能相關指標及其蛋白的變化

2.2 腎小球及腎小管組織形態(tài)學變化

圖2可見，正常對照組可見腎小球及腎小管基底膜完整，清晰可見。順鉑模型組可見蛋白管型，腎小管基底膜損傷，管壁細胞壞死。RIR模型組腎小管擴張，基底膜損傷。慶大霉素模型組腎小管可見蛋白管型，腎小管管壁細胞壞死，基底膜損傷。

2.3 肝組織中TP和ALB的變化

已知蛋白主要合成臟器是肝臟，為了觀察這種血清中TP和ALB的降低是否與肝臟的合成減少有關，本研究檢測了勻漿中TP及ALB量，并采用凝膠電泳及考馬斯亮藍染色(簡稱考染)且對全部條帶灰度掃描積分方法檢測肝組織中總蛋白變化。考染結果顯示，與正常組比較，順鉑模型總蛋白顯著下降；RIR模型顯著升高；慶大霉素有升高趨勢(P=0.076)(圖3A、B)。順鉑組肝臟總蛋白無明顯變化，但是ALB表達明顯下降；慶大霉素組肝臟總蛋白及ALB表達均明顯增加；RIR組無論肝總蛋白還是ALB表達均無明顯變化(圖3C、D)，提示了3種模型對肝臟蛋白及ALB合成的特點及其復雜性。同時各組血清AST，ALT無明顯變化(圖3E、F)，順鉑組ALT有一定升高，但無統(tǒng)計學意義，表明各組大鼠肝功能無明顯差異，由此提示這種肝臟ALB的變化與肝細胞損傷無明顯關系。

圖3 肝臟組織中TP和ALB的變化.

2.4 肝臟中ALB基因轉錄啟動區(qū)增強子mRNA表達的變化

為了進一步觀察ALB表達變化的機制，我們對肝臟ALB基因轉錄啟動區(qū)主要增強子mRNA的表達進行了檢測。結果表明，與正常組比，順鉑模型中Alb、Cebp-αmRNA水平顯著下調，Hnf顯著上調；RIR模型中Alb、NfymRNA水平顯著上調，Hnf顯著下調；慶大霉素模型AlbmRNA顯著升高，Cebp-αmRNA顯著降低，HnfmRNA有升高趨勢，無顯著性差異，提示3種模型的ALB基因轉錄啟動區(qū)的增強子都不同程度的出現(xiàn)了變化(圖4)。

圖4 三種急性腎損傷模型肝臟ALB基因轉錄啟動區(qū)增強子mRNA表達變化

2.5 腎臟組織中Nephrin、Podocin、ALB及其相關炎性壞死因子蛋白表達的變化

為了觀察腎小球基底膜損傷及其與尿蛋白相關性，我們對腎臟足細胞的2個重要蛋白Nephrin和Podocin，腎組織ALB蛋白及其相關炎性因子進行了表達。結果表明3種模型組大鼠腎組織ALB及Nephrin蛋白表達均有顯著上調；順鉑及RIR組的Podocin表達明顯下降，慶大霉素組無明顯變化。同時各組炎性相關因子TNFα和IL-6均明顯上調，提示腎組織中存在著炎性及其腎小球足細胞損傷的潛在病變(圖5)。

圖5 三種急性腎損傷模型腎組織中Nephrin、Podocin、ALB及其相關炎性壞死因子蛋白表達的變化

3 討論

我們在前期對白頭翁皂苷B4(B4)抗急性腎損傷作用的研究中發(fā)現(xiàn)，急性腎損傷及其損傷過程中ALB岀現(xiàn)明顯變化，且不同的造模方法對血清ALB、尿ALB及蛋白尿也不完全一致，為了更好的認識不同造模方法對ALB生成及其排泄以及其在藥物評價模型中的意義，我們進行了順鉑[15]、慶大霉素[16]、急性腎缺血再灌[10]等急性腎損傷模型ALB表達及其排泄以及可能的機制的研究。鑒于蛋白尿是腎功能損傷的重要病理指標，對此進行深入研究，對于相關新藥研究具有重要的意義。本文的工作對評價B4治療急性腎損傷作用及其對于ALB蛋白尿的作用奠定了病理生理基礎。

通常除肝病外，多數(shù)疾病白蛋白合成一般不會受到明顯影響[17]。但是我們發(fā)現(xiàn)，3種急性腎損傷均表現(xiàn)出血清ALB顯著下降，尿TP、ALB顯著升高。這種血清ALB下降降低了血漿滲透壓，是導致組織水腫的主要原因。同時這種血清ALB下降與腎損傷有關，但是對于ALB生成有無影響，對此進行考察將有助于全面深入認識相關病理變化。己知ALB生成主要在肝臟，為此我們主要對肝臟相關ALB表達，以及ALB基因轉錄進行了觀察。肝臟組織考染結果表明順鉑模型TP顯著下降，而另兩種模型TP升高，勻漿結果中，順鉑模型TP結果與考染結果不一致，RIR和慶大霉素TP變化趨勢一致，3種模型組織勻漿中ALB變化不明顯。進一步對肝臟組織中ALB的mRNA和蛋白表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)順鉑模型大鼠肝臟ALB的mRNA和蛋白水平均下調，表明順鉑模型肝臟ALB合成減少，提示這其中存在著順鉑對mRNA生成到蛋白翻譯修飾的損傷過程。因此，在ALB的合成上，順鉑模型與另兩種模型存在一定的差異性。對于肝功測試結果表明，3種造模方法對于ALB影響的同時，對于肝臟功能并沒有明顯影響，表明這種對ALB表達的影響是專屬性的，與肝臟功能無關。值得注意的是，腎損傷同時RIR組和慶大霉素組肝臟AlbmRNA均明顯升高，提示Alb基因轉錄均明顯啟動，但是其蛋白表達則不完全一致，慶大霉素組Alb基因與蛋白表達均明顯上調，表現(xiàn)出較好的一致性，但是這種蛋白的升高并沒有改變血清ALB下降的結果，提示尿蛋白的逸漏遠遠超過了肝臟的ALB合成分泌。RIR組ALB蛋白表達則升高不明顯，其原因有待于進一步探討。

ALB基因轉錄啟動區(qū)存在多個增強子序列，它們的存在與增強ALB基因表達相關[18,19]。為了更深入探討3種造模方法對肝臟ALB表達的影響，我們對這些增強子相關基因表達的變化進行了觀察。結果表明三種模型組大鼠肝臟ALB表達變化不一。其中順鉑模型ALB mRNA明顯降低，有報道[15]順鉑的腎毒性機制主要與損傷DNA有關，本研究亦表明這種抑制ALB表達的原因與其抑制ALB基因轉錄啟動區(qū)的增強子CEBP-α表達、從而抑制ALB基因表達相關；另一方面盡管增強子Hnf有顯著升高，但ALB最終是表達下調，提示順鉑可能阻礙了HNF蛋白與增強子序列結合，具體尚有待于進一步深入研究。RIR和慶大霉素組大鼠肝臟ALBmRNA表達均明顯升高，但是對增強子作用不完全一致：RIR組主要表現(xiàn)為NFY表達升高，慶大霉素組則主要為HNF表達升高。由此可見3種模型組對于Alb基因啟動區(qū)增強子作用的不一致性，表現(xiàn)出其作用的復雜性，這些均有待于進一步研究?？傊?，順鉑對血清ALB降低影響較重，不但通過腎損傷加速ALB排泄，同時還通過抑制肝臟ALB生成加重降低血清ALB。RIR和慶大霉素雖然能在一定程度上促進肝臟合成ALB，但是由于其腎損傷促進ALB排泄，而使血清ALB下低。因此在順鉑模型的藥物研究中，不僅要觀察腎損傷變化，還要觀察肝臟ALB生成變化。RIR和慶大霉素模型的藥物研究中，則重在防治腎損傷方面。

Nephrin和Podocin是構成腎小球過濾膜最后一道屏障的足細胞裂隙膜上重要的蛋白[20,21]。本實驗結果顯示，3種模型大鼠腎Nephrin表達明顯升高，順鉑組與RIR組Podocin表達明顯降低，提示存在腎小球足細胞胞損傷。近年來的研究表明大量ALB局部聚集(例如腎臟)可通過激活NFκB引發(fā)炎癥造成損傷[22-24]，炎性因子可以刺激Nephrin表達上調[25]，本研究也顯示在Nephrin異常升高的同時，IL-6和TNFα表達也明顯升高，表明其與腎損傷有關。在腎ALB表達結果中，3種模型ALB表達均明顯升高。有報道AKI時腎皮質ALB mRNA表達明顯升高[26]，提示這種升高為損傷應激所致。我們的結果所顯示的ALB蛋白表達一方面預示著腎損傷的潛在機制，另一方面也與尿蛋白升高有潛在關系，這一復雜機制有待探討。

本工作首次系統(tǒng)觀察了3種常用的急性腎損傷造模方法及其造模過程中的相關ALB生成及其排泄的變化特點，以及相關成因。并首次從ALB基因轉錄區(qū)相關增強子水平對其作用于ALB進行了較為深入的探討。其中順鉑抑制肝臟ALB合成，同時損傷腎小球基底膜，形成蛋白尿是其主要特點。而急性腎缺血再灌損傷和慶大霉素所致急性腎損傷則是促進肝臟ALB合成的同時，腎小球損傷，形成蛋白尿。三種模型腎損傷過程中Nephrin的高表達提示其損傷靶點的可能性及其潛在藥物的作用靶點。由于ALB不僅具有維持血漿滲透壓、營養(yǎng)機體等生理功能，而且又是蛋白尿的主要組成蛋白，同時腎臟過高的ALB還可以引起腎臟炎性因子表達，進而加重腎損傷。因此，在急性腎損傷時，監(jiān)測血和尿ALB具有重要的病理意義，同時也是藥物研究中的重要指標。同時提示我們在新藥研究中需要針對具體造模方法區(qū)別對待。