肝豆湯通過肝激酶 B1/AMP 活化蛋白激酶途徑改善高脂攝入引起的小鼠肝臟脂肪變性

董璐 ，劉皎皎 ，何瑾瑜 ，李瀚旻

作者單位：1 陜西省中醫(yī)醫(yī)院肝病科，陜西 西安 710003；2 湖北中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，湖北 武漢 430061

肝臟脂肪變性是一種世界范圍內流行的慢性病，近年來已成為一種新的健康威脅。流行病學調查表明，肝臟脂肪變性是引起非酒精性脂肪肝發(fā)病的主要因素，多由于攝入高脂飲食或脂肪代謝紊亂導致脂肪在肝臟中異常積累所致。因此主要治療策略包括生活方式調整和改善脂質穩(wěn)態(tài)的藥物治療，然而，現有藥物存在較大的副作用，如體質量增加或長期使用導致死亡率增高等。因此，尋找新藥物對早期診斷和精確干預具有重要意義。近年來研究發(fā)現中藥肝豆湯可治療肝臟銅代謝異常結所致的 Wilson 病。然而目前肝豆湯對肝臟脂肪變性的相關研究報道較少，本研究自 2018年 3—12月以高脂攝入為誘導肝臟脂肪變性，并以東寶肝泰為陽性對照，探究肝豆湯對高脂攝入引起的小鼠肝臟脂肪變性的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5～6周齡健康 C57BL∕6 小鼠 60 只，SPF 級，雌雄各半，體質量范圍為 18～20 g，濕度為（49±6）%，購自上海邦耀生物公司，許可證號：SCXK（滬）-2015-0002。所有實驗動物均常規(guī)飼養(yǎng)，在 12 h 光照 12 h 黑暗條件下自由飲水，飲食，適應 1周后進行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

東寶肝泰沖劑（批號H22024764，批次 20070608）購于通化東寶藥業(yè)股份有限公司，高脂飼料（貨號 D12492）協同生物有限公司，肝豆湯包括大黃、黃連、姜黃、澤瀉、金錢草、三七等 6 味藥材，購于安徽合肥市同仁堂大藥房，丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（貨號 MAK052）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（貨號 MAK055）購于美國 Sigma 公司，RIPA 裂解液（貨號 R0020）購于北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗 LKB1 單克隆抗體（貨號 3050）、磷酸化兔抗 LKB1 單克隆抗體（貨號3055）、兔抗 AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）多克隆抗體（貨號 9158）、磷酸化兔抗 AMPK 多克隆抗體（貨號）均購于美國 Cell Signaling Technology，兔抗尼曼匹克 C1 型類似蛋白（Niemann-Pick C1-Like 1，NPC1L1）單克隆抗體（貨號 ab124801）、兔抗 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原 酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）單克隆抗體 、兔抗乙酰輔酶羧化酶（Acetyl coenzyme A carboxylase，ACC）單克隆抗體（貨號 ab68191）、兔抗固醇調節(jié)元件結合蛋白 1（Sterol regulatory element-binding protein，SREBP1）多 克隆抗體（貨號 ab3259）均購于美國 abcam 公司。酶標儀（型號 TECAN spark）購于上海帝肯貿易有限公司 ，蛋白電泳儀（型號 1659001）購于美國 Bio-Rad公司。

1.3 模型建立與給藥

參考文獻［6］造模，具體步驟為：小鼠按隨機數字表法分為兩組，正常飲食組（10 只）和高脂飲食組（50 只），正常飲食組每日飼喂基礎飼料，高脂飲食組每日飼喂高脂飼料，小鼠自由攝食及飲水，喂養(yǎng) 8周后構建高脂飲食模型小鼠。將 50 只高脂飲食模型小鼠，按隨機數字表法分組：模型組，東寶肝泰組，肝豆湯低、中、高劑量組，每組10 只，根據文獻［7］及預實驗結果進行給藥：東寶肝泰組、肝豆湯低、中、高劑量組分別給東寶肝泰沖劑0.225 g∕kg、肝豆湯（22，44，66 g∕kg）各 2 mL·kg·d處理，同時正常飲食組和模型組各灌胃給予生理鹽水 2 mL·kg·d，每日 1 次，連續(xù)給藥 6周 后，禁食24 h 后用于后續(xù)實驗，給藥期間正常組小鼠飼喂基礎飼料，其余各組飼養(yǎng)高脂飼料養(yǎng)。

1.4 組織樣品采集

對“1.3”中各組小鼠頸椎脫臼法處死后立即眼球取血并置于離心管中，4 ℃冷凝過夜后，取上清于 4 ℃，12 000 r∕min 離心 15 min，取血清置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。取出各組小鼠肝臟，用預冷的生理鹽水沖洗至無血絲，濾紙擦干，一部分用 4% 多聚甲醛固定 ，另一部分置于- 80 ℃ 保 存?zhèn)溆谩?p>1.5 肝組織形態(tài)學分析

取“1.4”中 4% 多聚甲醛固定的肝臟組織，在肝左葉中部橫切面取材，脫水后石蠟包埋，用切片機制成厚度 5 μm 的切片，并進行 HE 染色，顯微鏡觀察染色結果。取出保存在-80 ℃的肝臟組織，制成厚度 5 μm 的冰凍切片，采用油紅 O 染色，鏡下觀察。

1.6 肝臟組織中總膽固醇、三酰甘油含量測定

取“1.4”中肝臟組織 200 mg，加入氯仿∶甲醇（2∶1）萃取液 2 mL，勻漿器研磨制備勻漿，4 ℃，12 000 r∕min 離心 10 min。取上清液，按照試劑盒說明書對各組小鼠肝臟組織中總膽固醇、三酰甘油含量測定。

1.7 各組小鼠血清中 AST、ALT 活性測定

取出“1.4”中保存的血清，按照 AST、ALT 檢測試劑盒說明書，對各組小鼠血清中 AST、ALT 含量檢測。

1.8 蛋白質印跡法（Western blotting）各組小鼠肝臟組 織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、ACC、p-ACC 蛋白相對表達

取“1.4”中凍存的每組小鼠的肝臟組織，加入含 PMSF 的 RIPA 裂解液，在勻漿器中破碎，離心，提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白的濃度，按照 4∶1 在蛋白中加 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱 3～5 min，放于-20 ℃保存。嚴格按照十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）配方表制 備 8%、10% 分離膠和 5%濃縮膠，上樣量 30 μg，上樣后進行蛋白凝膠電泳，根據蛋白 marker 切膠 ，轉膜 ，加入抗體 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、ACC、p-ACC（均 1∶500 稀釋）孵育，放置 4 ℃過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）清洗，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育 1 h，TBST 清洗后，采用 ECL發(fā)光液對條帶孵育后，曝光、顯影，Image J 對條帶灰度值分析。

2 結果

2.1 小鼠肝臟組織形態(tài)學變化

與正常組小鼠肝組織相比，模型組出現脂肪變性，肝細胞腫大，細胞質內含有大量脂肪滴空泡，且橘紅色的脂肪滴增多，紅染區(qū)域顏色較深；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝細胞腫大依次減輕，細胞質中脂肪滴空泡依次減少，且橘紅色的脂肪滴數量依次減少，東寶肝泰組小鼠肝細胞腫大減輕，細胞質中脂肪滴空泡減少，且橘紅色的脂肪滴數量減少，其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組比較，無明顯變化。見圖1，2。

圖1 各組小鼠肝臟組織顯微鏡圖片（HE染色×200）：A為正常組；B為模型組；C為東寶肝泰組；D為肝豆湯低劑量組；E為肝豆湯中劑量組；F為肝豆湯高劑量組 圖2 各組小鼠肝臟組織顯微鏡圖片（油紅O染色×200）：A為正常組；B為模型組；C為東寶肝泰組；D為肝豆湯低劑量組；E為肝豆湯中劑量組；F為肝豆湯高劑量組

2.2 肝豆湯對高脂攝入小鼠血清肝功能指標 AST，ALT 的活性影響

與正常組相比，模型組小鼠血清中 AST、ALT 的 活性均升高（

P

＜0.05）；與模 型組 相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠血清中 AST、ALT 的活性依次降低（

P

＜0.05），東寶肝泰組小鼠血清中AST、ALT 的活性均降低（

P

＜0.05），其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組組比較，差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清肝功能指標天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）的活性的比較

2.3 肝豆湯對高脂攝入小鼠肝組織總膽固醇、三酰甘油含量的影響

與正常組相比，模型組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量均升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量依次降低（

P

＜0.05），東寶肝泰組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量均降低（

P

＜0.05），其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組組比較，差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表2。

2.4 肝豆湯對高脂攝入小鼠肝臟組織中總膽固醇和三酰甘油合成相關蛋白的影響

與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對表達量均升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，肝豆湯低 、中 、高劑量組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對表達量依次降低（

P

＜0.05），東寶肝泰組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對表達量均降低（

P

＜0.05），其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組組比較，差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表3。

表2 各組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量的比較∕（mmol∕L，）

表3 各組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1相對表達量比較∕

2.5 肝豆湯對各組小鼠肝臟 LKB1/AMPK 通路相關蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC 蛋白相對表達量均降低（

P

＜0.05）；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中 p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相對表達量依次升高（

P

＜0.05），東 寶肝泰組小鼠肝組織中 p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相對表達量均升高（

P

＜0.05），其中肝豆湯中 劑 量 組與東寶肝泰組組比較，差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05）。見表4。

3 討論

隨著社會發(fā)展 ，人們生活水平日益提高 ，由于高脂膳食攝入誘導的機體肥胖及代謝紊亂等相關疾病日益增多。已有研究報道高脂膳食可導致肝脂肪變性，且通過高脂飼料造模費用低，時間相對短，期間小鼠不易發(fā)生死亡，因此本實驗以高脂飼料飼喂小鼠，結果發(fā)現，與正常組相比，模型組小鼠肝組織出現脂肪變性，肝細胞腫大，細胞質內含有大量脂肪滴空泡，且橘紅色的脂肪滴增多，紅染區(qū)域顏色較深，提示高脂攝入可引起小鼠肝臟脂肪變性，脂肪空泡增多。

表4 各組小鼠肝組織中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC相對表達量比較∕

研究發(fā)現中藥具有多層次、多靶點、不良反應少等特點，在防治肝臟疾病中應用越來越廣泛。耿昊等在對肝豆狀核變性研究發(fā)現，肝豆湯可促進損傷區(qū)的肝組織代償性自愈，促進銅的排出從而減輕高銅所致肝臟組織損傷。本研究發(fā)現，與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝細胞腫大依次減輕，脂肪滴空泡依次減少，提示肝豆湯可劑量依賴地減少高脂飲食小鼠肝組織中脂肪脂滴數量，減少脂肪積累，且中劑量肝豆湯組與東寶肝泰藥效一致。肝臟中含有多種酶類，肝臟損傷可引起血清中多種酶活性發(fā)生改變，其中 AST、ALT 是臨床常用肝功能評價指標。 此外肝臟脂肪積累與肝臟中總膽固醇、三酰甘油含量相關。總膽固醇、三酰甘油與低密度脂蛋白結合后，可被排出肝細胞，當該過程發(fā)生障礙時，大量總膽固醇、三酰甘油在肝臟中堆積，引起肝臟脂肪變性。本研究發(fā)現，與正常組相比，模型組小鼠血清中 AST、ALT 的活性及肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量均升高，與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠血清中 AST、ALT 的活性及肝組織中總膽固醇、三酰甘油的含量依次降低，且中劑量肝豆湯與東寶肝泰組效果接近，肝豆湯高劑量效果最優(yōu)，提示肝豆湯可降低高脂飲食誘導的小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量，減輕肝功能損傷。

研究發(fā)現調控核轉錄的激活因子 SREBP 可直接激活總膽固醇、三酰甘油合成相關基因及調節(jié)還原型輔酶Ⅱ（NADPH）表達。SREBP-1 可調節(jié)總膽固醇合成途徑中限速酶 HMGCR 基因表達，調控總膽固醇合成，進而調節(jié)機體內脂質代謝平衡，同時 SREBP-1 與總膽固醇、三酰甘油合成相關基因表達密切相關。此外 NPC1L1 作為一種固醇轉運體，位于腸上皮細胞的頂端膜和肝 細胞的小管膜上 ，可介導腸道總膽固醇吸收和肝總膽固醇排泄。研究發(fā)現，NPC1L1 缺乏可降低肝組組中總膽固醇含量，還可預防飲食誘導的肝脂肪變性和肥胖。本研究發(fā)現，與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對表達量均升高；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對表達量依次降低，其中肝豆湯中劑量組小鼠肝組織中HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對表達量與東寶肝泰組比較，差異無統(tǒng)計學意義。提示肝豆湯可能通過下調 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白表達，調節(jié)高脂飲食小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油合成代謝，影響脂肪合成，以高劑量肝豆湯效果最顯著。

近年 LKB1-AMPK 信號途徑在脂代謝過程中作用成為研究熱點，LKB1 作為 AMPK 的上游激酶，其磷酸化可激活 AMPK，活化的 AMPK 可通過進一步催化 ACC 磷酸化，進而抑制三酰甘油、總膽固醇合成，調節(jié)脂質代謝平衡；另外活化的 AMPK 還可促使HMGR 磷酸化，進而抑制總膽固醇合成，同時促進三酰甘油、總膽固醇水解。研究報道印度東北部發(fā)酵大豆提取物可通過調節(jié) AMPK∕sREBP∕PPARα信號通路，減輕肝脂肪變性，此外還有報道厚樸酚可通過激活 AMPK，抑制 SREBP-1 c 和成脂基因表達，從而減輕肝臟脂肪堆積和肝細胞損傷。本研究發(fā)現 ，與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC 蛋白相對表達量均降低；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相對表達量依次升高，提示肝豆湯可能通過激活 LKB1-AMPK 信號途徑，下調 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白表達，進而減輕肝臟脂肪變性。

綜上所述，肝豆湯可減輕高脂攝入引起的小鼠肝臟脂肪變性、保護肝功能，可能通過激活 LKB1-AMPK 信號途徑 ，下調 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白表達，降低肝臟總膽固醇、三酰甘油含量實現。而本研究還存在一定局限性，肝豆湯改善高脂攝入所致肝臟脂肪變性的具體機制尚需進一步深入探究。