黎藥裸花紫珠散劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

侯 杰，周欣欣，張俊清，2，賴偉勇，2

（1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?71199；2.海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?71199；3.哈爾濱工商大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150076）

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook.ex Arn.）是馬鞭草科紫珠屬植物，主要分布于我國(guó)廣東、廣西和海南等地?，F(xiàn)代藥理活性研究表明裸花紫珠中黃酮類和三萜及其苷類、苯丙素苷和環(huán)烯醚萜苷為其主要成分［1］。裸花紫珠具有止血、抗炎、抑菌、增強(qiáng)免疫、細(xì)胞毒等作用［2-5］。裸花紫珠的止血抗炎功效被得到了廣泛研究，利用裸花紫珠研制止血膏劑、噴霧劑等［4，6］，并對(duì)不同止血?jiǎng)┬瓦M(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本研究從裸花紫珠散劑的鑒別（薄層色譜）、重金屬及有害元素限量檢查、主要有效成分含量檢測(cè)（高效液相色譜）等方面較系統(tǒng)研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為裸花紫珠散劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸花紫珠散劑（課題組制備），甲醇、乙酸乙酯、三氯化鋁、乙醇、鹽酸、硫脲、抗壞血酸、高氯酸、硝酸、鐵氰化鉀均為分析純，甲酸、乙腈為色譜純。木犀草苷對(duì)照品、毛蕊花糖苷對(duì)照品；砷（As）、鉛（Pb）、汞（Hg）、鎘（Cd）、銅（Cu）元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；砷、鉛、汞、鎘、銅元素?zé)簟?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

原子吸收光譜儀（ICE3000賽默飛美國(guó)）、原子熒光光譜儀（AFS-830北京）、高效液相色譜儀（waterse2695美國(guó)）

1.3 方法

1.3.1 裸花紫珠散劑薄層鑒別項(xiàng)的建立 供試品溶液的制備：取三批裸花紫珠散劑各1 g，分別放入25 mL容量瓶中，加甲醇定容至25 mL，超聲30 min。放冷，用甲醇補(bǔ)足。搖勻，濾過(guò)，取濾液，即得。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取木犀草苷對(duì)照品，加甲醇配置成0.2 mg/mL的木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為木犀草苷對(duì)照品溶液。精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品，加甲醇配置成1.0 mg/mL的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液。

薄層鑒別方法：取上述方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別點(diǎn)于同一0.5%NaOH硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯∶甲酸∶水（28∶2∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱5 min，于紫外光（365 nm）下檢視。

專屬性實(shí)驗(yàn)：取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對(duì)照品溶液，空白溶液（甲醇），按照上述方法做薄層鑒別實(shí)驗(yàn)兩次，記錄薄層色譜圖。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對(duì)照品溶液，由兩名實(shí)驗(yàn)人員照A和B按照上述方法做薄層鑒別實(shí)驗(yàn)，記錄薄層色譜圖。

耐用性實(shí)驗(yàn)：取3批裸花紫珠散劑供試品溶液、對(duì)照品溶液，按照上述方法但使用兩批不同批次的薄層色譜板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄薄層色譜圖

薄層鑒別項(xiàng)檢驗(yàn)：分別吸供試品溶液、對(duì)照品3種溶液各10～20μL，依次點(diǎn)于同一薄層色譜板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄薄層色譜圖。

1.3.2 重金屬及有害元素檢查項(xiàng)的建立 對(duì)照品溶液的制備：取砷、鉛、汞、鎘、銅元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別于100 mL容量瓶中制得到各含元素1、1、0.1、0.1、100μg/mL的母液。測(cè)定砷含量時(shí)取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分別加入5 mL鹽酸、2%硫脲與1%抗壞血酸后加純水定容至100 mL；測(cè)定鉛含量時(shí)取母液0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL，分別加入1.5 mL鹽酸后加純水至100 mL；測(cè)定汞含量時(shí)取母液0.0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分別加入5 mL鹽酸后加純水至100 mL；測(cè)定鎘、銅含量時(shí)取母液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，分別加入1.5 mL鹽酸后加純水定容至100 mL。即得各元素的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：3批次裸花紫珠散劑各取1 g，分別加10 mL純水、1.5 mL高氯酸、15 mL硝酸后置于電熱板上消化。消化后測(cè)定砷含量時(shí)加2.5 mL鹽酸、2%硫脲和1%抗壞血酸后加純水定容至50 mL，測(cè)定鉛含量時(shí)加1.5 mL硝酸后加純水定容至50 mL，測(cè)定汞含量時(shí)加2.5 mL鹽酸后加純水定容至50 mL、測(cè)定鎘含量時(shí)加1.5 mL鹽酸后加純水定容至50 mL、測(cè)定銅含量時(shí)加1.5 mL鹽酸后純水定容至50 mL。即得各元素的供試品溶液。

儀器參數(shù)設(shè)置：砷：原子熒光光譜儀，5%鹽酸載流，還原溶液為2%硼氫化鉀與0.4%KOH，負(fù)高壓290 V，燈電流75 mA；鉛：原子熒光光譜儀，1.5%硝酸與0.2%鐵氰化鉀載流，還原溶液為1%硼氫化鉀與0.2%KOH，負(fù)高壓270 V，燈電流65 mA；汞：原子熒光光譜儀，5%鹽酸載流，還原溶液為0.5%硼氫化鉀與0.1%KOH，負(fù)高壓270 V，燈電流75 mA；鎘：原子熒光光譜儀，5%鹽酸與2%硫脲載流，還原溶液為2%硼氫化鉀與0.4%KOH，負(fù)高壓270 V，燈電流60 mA；銅：原子吸收光譜儀，測(cè)定波長(zhǎng)為324.7，燈電流8 mA，火焰類型Air-C2H2。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：配制5種重金屬元素不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行檢測(cè)，建立5種重金屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度試驗(yàn)：隨機(jī)抽取一瓶供試品溶液，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算砷、鉛、汞、鎘、銅元素的平均值。

回收率試驗(yàn)：取已知重金屬及有害元素離子含量的樣品，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的各元素對(duì)照品溶液，按上述方法測(cè)定砷、鉛、汞、鎘、銅元素加標(biāo)回收率。

樣品中重金屬及有害元素含量測(cè)定：采用上述建立的方法，對(duì)3批裸花紫珠散劑樣品中5種重金屬及有害元素進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 高效液相色譜法含量測(cè)定方法的建立 色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.1%甲酸溶液-乙腈（85∶15）為流動(dòng)相，選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)，木犀草苷檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，毛蕊花糖苷檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm；柱溫為35℃；流速1.0 mL/min。

供試品溶液的制備：取三批裸花紫珠散劑，各1 g，分別放入具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，超聲40 min。放冷，用甲醇補(bǔ)足。搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取木犀草苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品，加70%甲醇配置成每1 mL含木犀草苷20 mg、毛蕊花糖苷250 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)（X），以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出木犀草苷和毛蕊花糖苷的線性回歸方程。

含量測(cè)定：采用含量測(cè)定的方法，取3批裸花紫珠局部用散劑進(jìn)行含量測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別項(xiàng)建立結(jié)果

2.1.1 專屬性、重現(xiàn)性和耐用性試驗(yàn)結(jié)果 專屬性試驗(yàn)薄層色譜圖中對(duì)照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，兩種成分分離度較好，見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照溶液無(wú)熒光斑點(diǎn)，說(shuō)明該方法專屬性良好。重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，兩名實(shí)驗(yàn)員得到的薄層色譜圖基本一致，兩份色譜圖中對(duì)照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，兩種成分分離度較好，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，不同批次薄層板得到的薄層色譜圖基本一致，對(duì)照品與供試品在相同位置上有相同顏色的熒光點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，兩種成分分離度較好，說(shuō)明該方法耐用性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果Fig 1 Specific r esults

圖2 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Reproducibility results

圖3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Fig 3 Serviceability results

2.1.2 薄層色譜鑒別項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果 3批裸花紫珠散劑供試液在薄層色譜圖上與木犀草苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。該方法熒光斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，兩種成分分離度較好，該薄層色譜鑒別項(xiàng)簡(jiǎn)單可行。見(jiàn)圖4。

2.2 重金屬及有害元素檢查項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果

圖4 裸花紫珠散劑薄層檢驗(yàn)結(jié)果Fig 4 TLC results of callicarpa nudiflora powder

2.2.1 重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線 以元素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度或者熒光值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到5種重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表1。由表可知，5種重金屬及有害元素的相關(guān)系數(shù)均在0.996以上，表明5種元素線性關(guān)系良好。

表1 重金屬及有害元素標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 1 Standard curve of heavy metals and harmful elements

2.2.2 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果 隨機(jī)抽取一瓶供試品溶液，重復(fù)測(cè)定6次，砷、鉛、汞、鎘、銅元素平均值分別為2.918、10.015、0.631、0.297、0.044 7（μg/kg），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%，表明該方法精密度良好。見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（μg/kg）Tab 2 Precision results（μg/kg）

砷、鉛、汞、鎘、銅元素加標(biāo)回收率平均值分別為96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%，表明該方法能準(zhǔn)確測(cè)定待測(cè)樣品中的5種重金屬含量及有害元素。見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Recovery results

2.2.3 重金屬及有害元素含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果 重金屬及有害元素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，3批裸花紫珠散劑中示砷含量平均值為2.745μg/kg、鉛含量平均值為10.413μg/kg、汞含量平均值為0.860μg/kg、鎘含量平均值為0.252μg/kg、銅含量平均值為0.046 7 μg/kg。以上重金屬及有害元素含量遠(yuǎn)低于《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的綠色藥材重金屬限量要求，表明本品重金屬及有害元素含量符合要求。

表4 3批散劑的重金屬含量（μg/kg）Tab 4 Content of heavy metals in three batches of callicarpanudiflora powder（μg/kg）

2.3 含量檢測(cè)項(xiàng)建立試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)（X），以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸數(shù)據(jù)處理，所得到的木犀草苷的線性回歸方 程 為：Y=53 342X-36 343，r=1.000 0；毛蕊花糖苷的線性回歸方程為：Y=379 198X-152 266，r=0.999 9。見(jiàn)圖5。

圖5 木犀草苷和毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 5 Standard curve

2.3.2 含量測(cè)定結(jié)果 毛蕊花糖苷和木犀草苷的液相色譜圖可見(jiàn)圖6、7，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm保留時(shí)間為23 min處的峰為毛蕊花糖苷，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm保留時(shí)間21 min處峰為木犀草苷。對(duì)3批裸花紫珠散劑進(jìn)行木犀草苷和毛蕊花糖苷含量測(cè)定，木犀草苷和毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.614 7和7.282 2 mg/g，以平均含量的80%為下限，規(guī)定裸花紫珠散劑中木犀草苷含量應(yīng)不低于0.48%，毛蕊花糖苷含量應(yīng)不低于5.83%，見(jiàn)表5。

圖6 毛蕊花糖苷的色譜圖Fig 6 HPLC of mullein glycoside

圖7 木犀草苷的色譜圖Fig 7 HPLC of luteolin

表5 裸花紫珠散劑含量測(cè)定結(jié)果Tab 5 Content determination results of callicarpa nudiflora powder

3 討論

本研究建立了裸花紫珠散劑的薄層色譜鑒定法，對(duì)此方法用于裸花紫珠散劑鑒定的專屬性、重復(fù)性、耐用性進(jìn)行了考察。該方法熒光斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，兩種主要成分木犀草苷和毛蕊花糖苷成分分離度較好專屬性、重現(xiàn)性、耐用性效果良好，同時(shí)基于該薄層色譜法建立了裸花紫珠散劑的薄層鑒別項(xiàng)。

利用火焰原子吸收法和氫化物原子熒光法，建立了裸花紫珠散劑鉛、鎘、砷、汞、銅5種重金屬及有害元素的測(cè)定方法，砷、鉛、汞、鎘、銅5種重金屬元素的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 1、0.999 1、0.999 8，0.996 4、0.999 6，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%、0.13%、2.97%、1.26%、0.82%，回收率平均值分別為96.1%、95.8%、95.4%、98.8%、98.8%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定。裸花紫珠散劑中砷含量平均值為2.745μg/kg、鉛含量平均值為10.413μg/kg、汞含量平均值為0.860μg/kg、鎘含量平均值為0.252μg/kg、銅含量平均值為0.046 7μg/kg。以上重金屬含量遠(yuǎn)低于《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的綠色藥材重金屬限量要求。同時(shí)，建立了裸花紫珠散劑鑒別的重金屬檢查項(xiàng)：按照檢測(cè)鉛、鎘、砷、汞、銅含量方法測(cè)定，鉛不超過(guò)5 mg/kg，鎘不超過(guò)0.3 mg/kg，砷不超過(guò)2 mg/kg，汞不超過(guò)0.2 mg/kg，銅不超過(guò)20 mg/kg。

采用高效液相色譜法測(cè)定裸花紫珠中主要有效成分木犀草苷和毛蕊花糖苷的含量，木犀草苷的線性回歸方程為：Y=53 342X-36 343，線性相關(guān)系數(shù)為1；毛蕊花糖苷的線性回歸方程為：Y=379 198X-152 266，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9。含量測(cè)定結(jié)果，木犀草苷平均值為0.061 47 mg/g、毛蕊花糖苷平均值為7.282 2 mg/g。以平均含量的80%為下限，建立了裸花紫珠散劑含量測(cè)定項(xiàng)，規(guī)定裸花紫珠散劑中木犀草苷含量應(yīng)不低于0.48%，毛蕊花糖苷含量應(yīng)不低于5.83%。

綜上所述，本研究所建立的黎藥裸花紫珠散劑質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)單，專屬性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性好，可用于裸花紫珠散劑的質(zhì)量控制。