抑制miR-155的表達對COPD患者氣道平滑肌細胞增殖和遷移的影響

王 偉，趙四林，范伏元，金朝暉，李 妲，符 艷，孫 爽，肖雪飛，張慧卿，胡 立

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2.湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖南 長沙410007）

慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD），簡稱慢阻肺，屬于氣道慢性炎癥性疾病，近年來，其發(fā)病率不斷增加，嚴重危害人類身體健康［1，2］。COPD發(fā)病機制尚未完全明確，但研究表明COPD與炎癥細胞浸潤、氣道平滑肌增生肥厚有關(guān)［3，4］。氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）的增生肥大會 影 響COPD［5，6］。因 此 抑 制ASMCs增 殖 和 遷移是阻滯COPD進展的重要機制之一。研究表明miRNA與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，miRNA通過各種機制在COPD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，可作為其診斷、治療、預后等生物標記物［7-9］。研究報道m(xù)iR-155在COPD患者外周血中表達水平升高，miR-155可能參與了COPD的發(fā)病過程，是導致肺損傷的重要物質(zhì)［10］。哮喘氣道平滑肌細胞中miR-155表達升高［11］。但miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞增殖和遷移的影響尚未清楚。本實驗旨在研究miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月～2019年5月于本院進行肺部手術(shù)的8例COPD患者為觀察組，選擇3例無COPD病史的肺部良性腫瘤患者的正常肺組織作為對照組。所有患者知情并同意。

1.2 主要試劑

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）；胰蛋 白 酶（美 國Sigma）；Trizol、反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒、SYBR Premix ExTaqTM試劑盒（日本TaKaRa）；細胞周期檢測試劑盒（美國Sciencell）；RIPA裂解液（北京百奧萊博科技有限公司）；Ki67、E-cadherin、N-cadherin抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；GAPDH抗體及山羊抗兔IgG-HRP（北京索萊寶公司）；Transwell小室、Matrigel膠（美國Bio-Rad公司）；TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海恒斐生物科技有限公司）。

1.3 氣道平滑肌細胞（ASMCs）分離培養(yǎng)

參考文獻［4］，取兩組患者的肺葉和支氣管平滑肌，縱向剖開氣管，去除氣管的內(nèi)膜和外膜，然后將平滑肌剪成1 mm3的小組織塊，將其置于培養(yǎng)瓶中，加入含血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 d后可見從組織塊邊緣爬出少量細胞，隨后開始貼壁生長，待細胞長滿瓶底80%左右時，倒置顯微鏡下觀察細胞，細胞呈長梭形，成峰谷生長狀。用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取穩(wěn)定傳代4～6代的細胞用于實驗。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染與分組

取COPD患者ASMCs，將miR-155抑制表達質(zhì)粒anti-miR-155-A、anti-miR-155-B和陰性對照質(zhì)粒anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染至ASMCs中，記為anti-miR-155-A組、anti-miR-155-B組、anti-miR-NC組；正常培養(yǎng)的ASMCs作為空白組（blank control）。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-155表達水平

收集兩組ASMCs，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，而后進行PCR擴增，miR-155以U 6為內(nèi)參，相 對 表 達 量 采 用2-△△Ct法 計 算；具 體 參 考文獻［4］。

轉(zhuǎn)染后的各組細胞采用上述方法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期

各組細胞培養(yǎng)48 h后收集細胞，并制備單細胞懸液，加入3 mL預冷的70%乙醇固定，用緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A（RNase A）于37℃水浴30 min，加入碘化啶（PI），4℃避光30 min，上機檢測，重復3次。用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件對細胞周期進行檢測分析。

1.7 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù)

將適量細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)2周后用PBS清洗，經(jīng)過甲醇固定和吉姆薩染色，最后用低倍光學顯微鏡下計數(shù)＞50個細胞的集落。

1.8 Western blot實驗

提取細胞總蛋白后進行定量。然后經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入一抗和二抗進行孵育，再曝光顯影，定影，測定蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白表達水平；具體步驟參考文獻［4］。

1.9 Transwell實驗

細胞消化重懸后，接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h，經(jīng)固定、染色后進行計數(shù)。細胞侵襲實驗在Transwell小室上層加入基質(zhì)膠Matrigel，之后同細胞遷移操作；具體步驟參考文獻［4］。

1.10 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）實驗

各組細胞培養(yǎng)48 h后取上清，具體步驟嚴格按照試劑盒說明進行操作，檢測TNF-α、IL-6的水平。

1.11 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-155在COPD患者氣道平滑肌細胞中的表達

對照組及COPD組氣道平滑肌細胞中miR-155表達水平分別為0.97±0.05、3.26±0.15，COPD組較對照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 抑制miR-155的效果檢測

空白組、anti-miR-NC組、anti-miR-155-A組及anti-miR-155-B組miR-155表達水平分別為0.94±0.08、0.95±0.09、0.32±0.03、0.20±0.02，anti-miR-155-A組和anti-miR-155-B組較空白組和anti-miR-NC組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。取變化較為明顯的anti-miR-155-B組用于后續(xù)實驗，后續(xù)實驗中均用anti-miR-155表示。

2.3 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞增殖的影響

與空白組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組G0-G1期細胞所占比例升高，S期細胞比例而降低，細胞克隆數(shù)降低，Ki67蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1及表1。

圖1 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞中Ki67蛋白表達的影響Fig 1 The effect of miR-155 inhibition on Ki67 protein expression in air way smooth muscle cells of COPD patients

2.4 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞遷移、侵襲的影響

與空白組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組遷移、侵襲氣道平滑肌細胞數(shù)降低，氣道平滑肌細胞中E-cadherin蛋白表達水平升高，N-cadherin蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2及表2。

圖2 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達的影響Fig 2 The effect of miR-155 inhibition on the expression of E-cadherin and N-cadherin protein in airway smooth muscle cells of COPD patients

2.5 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞中炎癥因子的影響

與空白組和anti-miR-NC組相比，anti-miR-155組COPD患者氣道平滑肌細胞中TNF-α和IL-6水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞增殖的影響（n=9，±s）Tab 1 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell proliferation in COPD patients（n=9，±s）

表1 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞增殖的影響（n=9，±s）Tab 1 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell proliferation in COPD patients（n=9，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

Ki67 0.64±0.06 0.62±0.05 0.26±0.02*#189.969 0.000組別空白組anti-miR-NC組anti-miR-155組S FP G0-G1 34.72±3.49 34.64±3.54 45.01±3.53*#25.837 0.000 34.64±3.80 34.74±3.00 24.43±2.74*#30.615 0.000 G2-M 30.64±3.29 30.62±3.35 30.56±2.99 0.002 0.998克隆數(shù)98.25±6.45 98.22±6.61 44.42±3.39*#269.298 0.000

表2 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞遷移、侵襲的影響（n=9，±s）Tab 2 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell migration and invasion in COPD patients（n=9，±s）

表2 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞遷移、侵襲的影響（n=9，±s）Tab 2 The effect of miR-155 inhibition on airway smooth muscle cell migration and invasion in COPD patients（n=9，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

N-cadherin 0.77±0.04 0.75±0.03 0.36±0.02*#497.483 0.000組別空白組anti-miR-NC組anti-miR-155組FP遷移細胞數(shù)137.28±9.15 135.12±9.36 61.64±5.63*#246.587 0.000侵襲細胞數(shù)90.67±9.00 90.29±9.72 41.19±4.20*#113.229 0.000 E-cadherin 0.24±0.02 0.23±0.02 0.65±0.30*#37.547 0.000

表3 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞中炎癥因子的影響（ng/L，n=9，±s）Tab 3 The effect of miR-155 inhibition on inflammatory factors in airway smooth muscle cells of COPD patients（ng/L，n=9，±s）

表3 抑制miR-155對COPD患者氣道平滑肌細胞中炎癥因子的影響（ng/L，n=9，±s）Tab 3 The effect of miR-155 inhibition on inflammatory factors in airway smooth muscle cells of COPD patients（ng/L，n=9，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

組別空白組anti-miR-NC組anti-miR-155組IL-6 53.36±4.92 54.01±4.56 106.47±8.17*#224.424 0.000 FP TNF-α 89.43±5.12 89.22±5.59 240.25±14.35*#778.349 0.000

3 討論

COPD氣道平滑肌與氣道重塑及炎癥反應有關(guān)，平滑肌細胞可能通過表達細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶類、生長因子等引起小氣道細胞外基質(zhì)增加，最終導致氣道重塑；因此調(diào)控氣道平滑肌細胞增殖對控制炎癥反應和延緩氣道重塑具有重要意義［12，13］。研究表明miRNA與COPD發(fā)病及炎癥反應相關(guān)，miRNA在COPD具有潛在的臨床治療應用前景，可作為COPD的生物學標志物［14，15］。已有研究表明miR-155可能參與了COPD的發(fā)病過程［10］。因此，本實驗研究了COPD患者ASMCs中miR-155的表達水平，結(jié)果顯示COPD患者ASMCs中miR-155表達水平明顯高于對照組；說明miR-155的確可能與COPD有關(guān)。有研究報道m(xù)iR-155可將細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）誘導小鼠主動脈血管平滑肌細胞周期轉(zhuǎn)換［16］。研究報道抑制miR-155促進外膜平滑肌祖細胞的定向遷移可加劇移植性動脈硬化［17］。本實驗進一步通過轉(zhuǎn)染miR-155的抑制表達質(zhì)粒研究miR-155對COPD患者ASMCs增殖和遷移的影響。結(jié)果顯示，G0-G1期細胞所占比例升高，S期細胞比例而降低，細胞克隆數(shù)降低，Ki67蛋白表達水平降低。說明抑制miR-155可阻滯COPD患者ASMCs周期轉(zhuǎn)換，抑制細胞克隆的形成；且遷移、侵襲細胞數(shù)降低，N-cadherin蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高。說明抑制miR-155表達可抑制ASMCs遷移和侵襲。

COPD與氣道慢性炎癥反應相關(guān)，而氣道平滑肌細胞可影響炎性因子的釋放從而調(diào)控氣道炎癥反應［18］。有研究報道在過敏性氣道炎癥的實驗模型中，miR-155是2型先天淋巴樣細胞和IL-33信號傳導的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［19］。miR-155參與調(diào)控吸入性肺損傷引起的炎癥反應［20］。表明miR-155可參與調(diào)節(jié)炎性反應。本實驗結(jié)果顯示，抑制miR-155表達后，COPD患者ASMCs中TNF-α和IL-6水平升高。表明抑制miR-155表達可抑制COPD患者ASMCs釋放炎性因子，抑制炎癥反應。

綜上所述，抑制miR-155的表達可抑制COPD患者氣道平滑肌細胞增殖、遷移，抑制促炎因子的釋放。將可為COPD的治療提供新理論依據(jù)和參考。