苓桂術甘湯含藥血清對TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞α-SMA和膠原蛋白合成的影響

葛瑞瑞，王 翔，湯同娟，王 靚，2，3，翟夢婷，左夢雨，陳 建，2，3，周 鵬，2，3，黃金玲，2，3

（1.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，安徽 合肥230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學院中西醫(yī)結合研究所，安徽 合肥230012；3.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽合肥230012）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病產(chǎn)生的病理改變，主要特征為膠原沉積的增多、排列的紊亂，Collagen I、CollagenⅢ比率的增加［1，2］，從而導致心室舒張功能的減退，以致誘導嚴重心律失常的發(fā)生，甚至出現(xiàn)心肌梗塞，引起猝死。因此，抑制心肌纖維化為治療心血管疾病的方案之一［3，4］。

研究表明，復方中藥具有多個靶點與多個途徑的作用特點以及副作用小的藥理作用，從而在心血管疾病的治療中得到廣泛的應用［5］。LGZGD出自漢代張仲景《傷寒雜病論》中的經(jīng)典名方，具有溫陽健脾、化飲利水之功效，組方嚴謹，配伍精當，被廣泛應用于心血管疾病治療的各種病癥以及各個階段，療效顯著［6，7］。課題組前期研究證實了該復方在前心衰階段，能夠有效抑制心梗后的心室重構，從而防治心衰的發(fā)展［8，9］。為探討該復方在抗纖維化中的作用，本實驗采用致纖維化因子TGF-β1誘導心肌成纖維細胞，觀察LGZGD對CFB膠原蛋白的分泌、以及α-SMA和FN表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性）18只，體質量200～220 g，新生健康SD乳鼠20只（1 d齡），均購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物嚴格按照安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心的倫理相關規(guī)定進行處置。

1.2 實驗藥物

苓桂術甘湯：茯苓、桂枝、白術、甘草（批號：1807181、2005181、2002202、1911141）均 購 自 安 徽普仁中藥飲片有限公司。參考本課題組前期發(fā)表的文獻［10］方法制備得到干燥粉末，再進行分裝密封后，采取避光保存條件，備用。含藥血清的制備［11］：將SD大鼠隨機分為空白組和給藥組。苓桂術甘湯的灌胃劑量為8.4 g/kg，2次/d，7 d，末次給藥45 min后，腹主動脈取血，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，提取血清，水浴30 min（56℃），濾膜過濾除菌，保存（—80℃），備用。

1.3 實驗試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清均購自（美國，賽默飛）；胰酶消化液（上海，碧云天）；TGF-β1（北京，博奧森生物）；4%多聚甲醛，Triton X-100均購自（北京，索萊寶）；波形蛋白（上海，瑞齊生物）；DAPI染色液，α-SMA抗體，Collagen I抗體，CollagenⅢ抗體，F(xiàn)N抗體，F(xiàn)N的ELISA試劑盒均購自（上海，酶聯(lián)生物）。

1.4 實驗儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱（美國，Thermo）；倒置熒光顯微鏡（日本，奧林巴斯株式會社）；電泳儀（美國，Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（美國，Protein Simple）；酶聯(lián)免疫工作站（意大利，Maroche）。

1.5 實驗方法

1.5.1 細胞培養(yǎng) 取新生SD乳鼠1 d齡，無菌條件下取心室肌，剪碎，0.25%胰酶（0.5 mL/只），4℃過夜；12 h后，10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（0.5 mL/只），水浴5 min（37℃）；棄液，膠原酶消化液（0.5 mL/只），水浴40 s（37℃）；將心臟置于有磁珠的含膠原酶消化液（0.6 mL/只）的血清瓶中，攪拌15 min（37℃）；留上清，1 000 r/min，5 min；留沉淀，加DMEM培養(yǎng)基（FBS+Brdu），放入培養(yǎng)箱中；靜置90 min，成纖維細胞貼壁后，換液，即獲得心肌成纖維細胞，培養(yǎng)至融合狀態(tài)后按1∶2傳代，用波形蛋白抗體進行免疫染色鑒定。

1.5.2 實驗分組 將細胞分別以5×105個/mL、5×104個/mL的密度接種于6孔板及24孔板中，每孔的細胞懸液體積分別為2 mL、1 mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。貼壁后，3%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。設空白組、20%空白大鼠血清組、模型組和LGZGD含藥血清組（5%、10%、20%），除空白組和空白大鼠血清組，每組加入TGF-β1（5 ng/mL），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進行藥物干預。

1.5.3 檢測指標及方法 免疫熒光法鑒定心肌成纖維細胞及檢測α-SMA的表達：洗板：PBS，3 min/次，3次；固定：4%多聚甲醛，15 min；洗板：同上；孵育：0.5%Triton X-100，20 min（室溫）；洗板：同上；封閉：10%正常羊血清，30 min；孵育：波形蛋白一抗（1∶200），4℃；次日，洗板：同上；孵育：熒光二抗（1∶200），1 h（室溫）；洗板：同上；染色：DAPI染色液，5 min；封片；熒光顯微鏡拍照。

WB檢測Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN的表達：收集處理后的CFB，棄培養(yǎng)液，用PBS洗孔板，裂解，離心，取上清液，蛋白定量，加4×上樣緩沖液，加熱使蛋白變性。轉膜；封閉：2 h；洗膜；孵育：Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA、FN抗體，4℃；次日，洗膜；孵育：羊抗兔IgG酶標抗體，2 h；洗膜；用化學發(fā)光試劑盒顯影，Image J分析各蛋白條帶的灰度值，并以β-actin為內參，實驗重復3次。

ELISA檢測Collagen I、CollagenⅢ及FN的表達：按照ELISA試劑盒說明書的步驟進行操作。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用IBM SPSS Statics 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標準差（±s）”進行統(tǒng)計學描述。多組均數(shù)比較即采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CFB的鑒定

CFB的形態(tài)獨特，多呈梭形；其細胞核是卵圓形，細胞之間均勻排列，且密集以致于部分重疊并交叉。免疫熒光法鑒定CFB，以成纖維細胞的特征性標志Vimentin抗體為一抗［12］，其中環(huán)繞著細胞核的紅色網(wǎng)狀結構Vimentin表達為陽性，藍色的部分為DAPI染核。隨機計數(shù)5個視野，結果顯示Vimentin陽性細胞的數(shù)量占細胞總數(shù)的95%以上，表明所獲的細胞可用于后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 CFB細胞培養(yǎng)48 h后的形態(tài)（200×）Fig 1 The morphology of CFB cells after 48 h of culture（200×）

2.2 LGZGD含藥血清對α-SMA表達的影響

與空白組比較，模型組α-SMA的表達增高；與模型組比較，5%、10%、20%LGZGD含藥血清組的熒光強度依次降低，即表達減少，見圖2。

2.3 LGZGD含藥血清對Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN表達的影響

圖2 免疫熒光法檢測不同濃度LGZGD對TGF-β1誘導心肌成纖維細胞α-SMA的表達的影響（200×）Fig 2 Immunofluor escence method to detect the effect of differ ent concentrations of LGZGD on the expr ession ofα-SMA in cardiac fibroblasts induced by TGF-β1（200×）

與空白組比較，模型組Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN蛋白表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，5%、10%、20%LGZGD含藥血清組Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；且隨著LGZGD含藥血清濃度的增加而依次降低，見表1、圖3。

表1 各組別蛋白WB檢測結果（n=3，±s）Tab 1 WB detection results of protein in each group（n=3，±s）

表1 各組別蛋白WB檢測結果（n=3，±s）Tab 1 WB detection results of protein in each group（n=3，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

FN 0.467±0.003 0.415±0.009 0.993±0.004**0.603±0.016##0.563±0.009##0.437±0.016##組別空白組20%空白大鼠血清組模型組5%LGZGD含藥血清組10%LGZGD含藥血清組20%LGZGD含藥血清組Collagen I 0.270±0.015 0.225±0.022 0.974±0.011**0.555±0.053##0.242±0.017##0.140±0.017##CollagenⅢ0.562±0.013 0.473±0.011 1.048±0.014**0.865±0.015##0.778±0.014##0.656±0.001##α-SMA 0.630±0.005 0.607±0.002 1.040±0.005**0.842±0.003##0.772±0.001##0.477±0.014##

圖3 不同濃度LGZGD對TGF-β1誘導心肌成纖維細胞Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN的影響Fig 3 The effect of different concentrations of LGZGD on TGF-β1 induced myocardial fibroblasts Collagen I，CollagenⅢ，α-SMA and FN）

2.4 LGZGD含藥血清對Collagen I、CollagenⅢ及FN表達的影響

與空白組比較，模型組Collagen I、CollagenⅢ及FN的表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，5%、10%、20%LGZGD含藥血清組Collagen I、CollagenⅢ及FN的表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2、圖4。

表2 各組別蛋白ELISA檢測結果（n=3，±s）Tab 2 ELISA test results of protein in each group（n=3，±s）

表2 各組別蛋白ELISA檢測結果（n=3，±s）Tab 2 ELISA test results of protein in each group（n=3，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組20%空白大鼠血清組模型組5%LGZGD含藥血清組10%LGZGD含藥血清組20%LGZGD含藥血清組FN 12.362±0.822 10.824±0.714 46.987±0.931**28.057±0.998##22.837±1.137##17.554±0.607##Collagen I 18.623±2.295 13.289±1.696 41.516±2.146**30.384±1.890##22.415±2.329##13.780±2.329##CollagenⅢ29.068±1.693 23.022±0.878 127.837±2.677**102.848±3.680##61.617±4.984##29.874±2.913##

圖4 不同濃度LGZGD對TGF-β1誘導心肌成纖維細胞Collagen I、CollagenⅢ、及FN的影響Fig 4 The effect of different concentrations of LGZGD on TGF-β1 induced myocardial fibroblasts Collagen I，CollagenⅢ，and FN

3 討論

心肌纖維化的眾多發(fā)生機制中血管緊張素水平的提高為主要原因，且能夠促進纖維化的細胞因子中，TGF-β1可調節(jié)細胞的增殖與分化，刺激多種活性物質的合成與分泌，參與細胞外基質的構成與降解，以及加快纖維化的發(fā)展等作用［13-15］。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是一種分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要成分是Collagen I和CollagenⅢ。一方面，ECM保持心臟的結構與功能是通過維持細胞的形態(tài)并在細胞之間傳遞收縮力；另一方面，膠原蛋白的沉積、成分的改變及空間結構的紊亂能夠導致心肌纖維化。因此，抑制CFB的增殖與分化，降低其合成膠原的能力對抑制心肌纖維化具有重要意義［16-18］。α-SMA是經(jīng)典的肌成纖維細胞標志物，除了α-SMA以外還有FN，也常用于肌成纖維細胞的鑒定，在細胞膜上高度表達，可以與膠原蛋白、纖維蛋白、TGF-β1等多種成分結合［8，19-22］；從 而 維 持 細 胞 以 及 影 響 基 質 的 結 構 與功能［23］。

本研究采用5 ng/mL的TGF-β1刺激心肌成纖維細胞，在α-SMA的表達方面，其中WB結果表明，與空白組對比，模型組α-SMA的表達升高，與模型組比較，各濃度實驗組的表達明顯下降，有顯著性差異，其中高濃度藥物組表達的降低尤為明顯；且α-SMA免疫熒光染色結果顯示，在TGF-β1的作用下心肌成纖維細胞形態(tài)的變化如尺寸增大、肌絲擴增以及排列的密集等都十分明顯，由此說明TGF-β1有效地誘導了成纖維細胞的轉化，給予LGZGD含藥血清干預后，熒光強度隨著濃度的升高而減弱。在FN的表達方面，與空白組對比，模型組FN的表達增加，與模型組比較，各濃度實驗組的表達明顯下降，有顯著性差異，其中高濃度藥物實驗組的表達的下降尤為明顯。在膠原蛋白合成方面，與空白組對比，模型組Collagen I及CollagenⅢ蛋白合成增加，與模型組比較，Collagen I蛋白及CollagenⅢ的表達下降，有顯著性差異，這說明LGZGD能夠抑制膠原合成，提示LGZGD具有在一定程度上拮抗TGF-β1誘導的心肌纖維化作用，抑制心肌纖維化，從而發(fā)揮其保護心肌的作用。但是LGZGD并不能完全抑制TGF-β1誘導的CFB的膠原合成，這可能與心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展有多種因素有關［24，25］。綜上所述，LGZGD對TGF-β1誘導的CFB的膠原合成、肌纖維化標志物α-SMA以及FN具有明顯的抑制作用，以及抗纖維化作用。但是該方的具體機制仍然有待后續(xù)進一步研究，課題組接下來會采用網(wǎng)絡藥理學的方法預測LGZGD治療心肌纖維化的有效成分和作用靶點，并采用體內外相結合的方法對預測的靶點進行下一步的驗證。