L-異亮氨酸及其衍生物代謝工程研究進(jìn)展

蘆楠,李宇虹,陳寧,張成林

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)

L-異亮氨酸(L-isoleucine)又稱“異白氨酸”,因具有分支的甲基基團(tuán),故與L-纈氨酸和L-亮氨酸通稱為“分支鏈氨基酸”[1]。L-異亮氨酸屬于高附加值氨基酸,具有修復(fù)肌肉的功能,常被制成氨基酸輸液或口服液,用于治療肝硬化、肥胖癥、昏迷等病癥[2-4]。近年來,L-異亮氨酸作為抗血糖藥物4-羥基異亮氨酸的合成前體受到廣泛關(guān)注[5-6]。L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、毛發(fā)提取法和發(fā)酵法[7-9],目前發(fā)酵法是其工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法,生產(chǎn)菌株通常為谷氨酸棒桿菌,大腸桿菌亦有研究報(bào)道[10]。本文從L-異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝調(diào)控機(jī)制、L-異亮氨酸及其衍生物的代謝工程改造策略進(jìn)展進(jìn)行了綜述,旨在為其代謝工程研究提供參考。

1 L-異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝調(diào)控機(jī)制

1.1 L-異亮氨酸的生物合成途徑

由于L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-賴氨酸等氨基酸均來源于L-天冬氨酸,故合稱為天冬氨酸族氨基酸[2]。L-異亮氨酸的生物合成途徑涵蓋了中心代謝和分支代謝途徑：葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)糖酵解途徑(Embden-Meyerhof-Parnas pathway,EMP)和磷酸戊糖途徑(hexose monophophate pathway,HMP)生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸,在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或(和)丙酮酸羧化酶的作用下發(fā)生羧化反應(yīng),生成草酰乙酸；后者在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成L-天冬氨酸；L-天冬氨酸經(jīng)10步催化反應(yīng)生成L-異亮氨酸,其中涉及5個(gè)限速酶(天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸脫氫酶和乙酰羥基酸合成酶)；合成的L-異亮氨酸經(jīng)運(yùn)輸載體輸出至胞外,具體合成和運(yùn)輸途徑如圖1所示。由圖1可知,合成1 molL-異亮氨酸的需要1 molL-天冬氨酸、1 moL丙酮酸、2 mol 腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)和4 mol 還原力還原型輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)。

1.2 L-異亮氨酸代謝調(diào)控

盡管谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌的L-異亮氨酸合成途徑相同,但其相關(guān)酶及其編碼基因具有多樣性(表1)。如前所述,草酰乙酸是合成L-異亮氨酸的前體物質(zhì),但谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌的草酰乙酸來源有所差異：大腸桿菌中草酰乙酸主要來源于三羧酸循環(huán)及乙醛酸循環(huán),但亦可通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的回補(bǔ)反應(yīng)獲得；而在谷氨酸棒桿菌中草酰乙酸主要通過丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的回補(bǔ)反應(yīng)獲得,其中丙酮酸羧化酶為主要羧化酶[11]。值得注意的是,丙酮酸羧化酶以生物素為輔酶。因此,在L-異亮氨酸發(fā)酵過程中常需要添加玉米漿、酵母粉等富含生物素的有機(jī)氮源以保證丙酮酸羧化酶的高效催化活性,同時(shí)降低L-丙氨酸、乳酸等以丙酮酸為前體的副產(chǎn)物[12]。

圖1 L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)制Fig.1 Biosynthesis pathway and metabolic regulation metabolism of L-isoleucine注：Glucose,葡萄糖；Glucose-6-P,葡萄糖-6-磷酸；PEP,磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr,丙酮酸；OAA,草酰乙酸；Asp,天冬氨酸；Asp-P,天冬氨酸磷酸；ASA,天冬氨酸-β-半醛；Hom,高絲氨酸；Hom-P,高絲氨酸磷酸；Thr,蘇氨酸；α-KB,α-酮基丁酸；AHB,α-乙?；?α-羥基丁酸；DMV,α-β-二羥基-β-甲基戊酸；KMV,α-酮基-β-甲基戊酸；AL,α-乙酰乳酸；DIV,α-β-二羥基異戊酸；KIV,α-酮基異戊酸；Ile,異亮氨酸；Val,纈氨酸；Leu,亮氨酸；Lys,賴氨酸；Met,甲硫氨酸；PHBV,3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯；ppc,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因；pyc,丙酮酸羧化酶編碼基因；lysC,天冬氨酸激酶編碼基因；asd,天冬氨酸半醛脫氫酶編碼基因；hom,高絲氨酸脫氫酶編碼基因；thrB,高絲氨酸激酶編碼基因；thrC,蘇氨酸合成酶編碼基因；ilvA,蘇氨酸脫氫酶編碼基因；ilvBN,乙酰羥基酸合成酶編碼基因；ilvC,二羥酸還原異構(gòu)酶編碼基因；ilvD,二羥酸脫水酶編碼基因；ilvE,支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因；leuA,α-異丙基蘋果酸合成酶編碼基因；leuB,β-異丙基蘋果酸脫氫酶編碼基因；leuCD；α-異丙基蘋果酸異構(gòu)酶編碼基因；ATP,腺嘌呤核苷三磷酸；ADP,腺嘌呤核苷二磷酸；NADPH,還原型輔酶Ⅱ；NADP+,煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸；propionyl-coA,丙酰輔酶A；phaABC,PHBV合成途徑中的基因簇(下同)

表1 大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中L-異亮氨酸分支合成途徑相關(guān)酶Table 1 Enzymes involved in L-isoleucine biosynthesis in Escherichia coli and Corynebacterium glutamate

除L-異亮氨酸外,L-天冬氨酸還可用于合成L-賴氨酸等多種氨基酸,這些氨基酸無疑與L-異亮氨酸的合成競(jìng)爭(zhēng)代謝流。天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)是L-異亮氨酸分支合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶酶,該酶催化的反應(yīng)需要ATP。在大腸桿菌中,存在該酶的3種同工酶,分別為AK I、AK II和AK III(分別由thrA、metL和lysC基因編碼)；其中AK I和AK II為雙功能酶,同時(shí)具有天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶活性,且AK I起主要作用。此外,在大腸桿菌中thrA與高絲氨酸激酶編碼基因thrB及蘇氨酸合成酶編碼基因thrC共同組成thrABC操縱子,該操縱子上游含有弱化子編碼基因thrL。當(dāng)環(huán)境中或胞內(nèi)L-蘇氨酸或(和)L-異亮氨酸的濃度過高時(shí),ThrL對(duì)thrABC操縱子有弱化作用[13]。AK I和AK III受到L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制,而AK II受L-甲硫氨酸的反饋?zhàn)瓒鬧10]。然而,在谷氨酸棒桿菌中,僅含有1個(gè)天冬氨酸激酶(由lysC基因編碼),該酶受到L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制[9]。

高絲氨酸脫氫酶是L-異亮氨酸分支合成途徑第2個(gè)關(guān)鍵酶,該酶需要還原力NADPH。大腸桿菌中含有由thrA和metL編碼的高絲氨酸脫氫酶。而在谷氨酸棒桿菌中,僅含1個(gè)高絲氨酸脫氫酶編碼基因hom,與高絲氨酸激酶編碼基因thrB構(gòu)成hom-thrB基因簇。該基因簇受到L-蘇氨酸的反饋抑制作用和L-甲硫氨酸的反饋?zhàn)瓒鬧14]。有報(bào)道稱,thrB(A20G)可解除L-蘇氨酸反饋抑制作用[15]。

蘇氨酸脫氫酶和乙酰羥基酸合酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是L-異亮氨酸合成途徑中最關(guān)鍵的2個(gè)酶。其中蘇氨酸脫氫酶催化L-蘇氨酸合成α-酮基丁酸,往往受到L-異亮氨酸的反饋抑制[16]。大腸桿菌含有ilvA、tdcB編碼的2個(gè)同工酶,而谷氨酸棒桿菌中僅含1個(gè)有由ilvA編碼的蘇氨酸脫氫酶。

由圖1所示,L-異亮氨酸和L-纈氨酸合成均需AHAS、二羥酸還原異構(gòu)酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶。AHAS受L-異亮氨酸的反饋抑制作用。在大腸桿菌內(nèi)共含有AHAS的3個(gè)同工酶(AHAS I、AHAS II和AHAS III,分別由ilvBN,ilvGM和ilvIH所編碼)。其中AHAS I對(duì)丙酮酸的特異性較α-酮基丁酸強(qiáng),因此更有利于L-纈氨酸和L-亮氨酸的合成。而編碼AHAS II的ilvGM基因存在移碼突變,故該酶不表達(dá)。AHAS III對(duì)α-酮基丁酸的特異性高于丙酮酸,故研究者認(rèn)為該酶更有利于L-異亮氨酸的合成[10]。

而在谷氨酸棒桿菌中僅含有1種ilvBN編碼的乙酰羥酸合酶[4],ilvBN與二羥酸還原異構(gòu)酶編碼基因ilvC組成ilvBNC操縱子。α-酮基丁酸對(duì)該操縱子有誘導(dǎo)作用,故當(dāng)α-酮基丁酸積累時(shí)ilvBNC操縱子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄[17]。此外,ilvBNC操縱子上游還含有弱化子,該弱化子能夠感受L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸濃度,當(dāng)其積累時(shí),弱化子對(duì)ilvBNC操縱子的轉(zhuǎn)錄起到弱化作用[18],其弱化調(diào)控機(jī)制如圖2所示。

圖2 谷氨酸棒桿菌ilvBNC基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制Fig.2 Regulation mechanism for ilvBNC expression in C.glutamicum

在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中僅含1種ilvC編碼的二羥酸還原異構(gòu)酶,該酶需要還原力NADPH。此外,在大腸桿菌中二羥酸脫水酶編碼基因ilvD和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因ilvE以及ilvGM和ilvA組成操縱子ilvGMEDA；而在谷氨酸棒桿菌中ilvD和ilvE獨(dú)立存在。

L-異亮氨酸的攝入和輸出均需要運(yùn)輸載體。在大腸桿菌中,其輸出載體為ygaZH編碼的YgaZH,其攝入載體分別為livJ和brnQ編碼的LivJ和BrnQ[2]。而谷氨酸棒狀桿菌中L-異亮氨酸的攝入和輸出載體分別為brnQ和brnFE編碼的BrnQ和BrnFE。除L-異亮氨酸外,BrnFE還可識(shí)別并輸出L-纈氨酸和L-亮氨酸[19]。brnFE的轉(zhuǎn)錄受亮氨酸應(yīng)答調(diào)控蛋白(leucine responsive regulatory protein,Lrp)和上述3種氨基酸的調(diào)控,當(dāng)其中1種氨基酸積累時(shí),該氨基酸可介導(dǎo)Lrp激活brnFE的轉(zhuǎn)錄。

2 L-異亮氨酸合成途徑的代謝工程改造

依據(jù)L-異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝調(diào)控機(jī)制,其代謝工程改造策略主要包括：(1) 解除代謝物對(duì)關(guān)鍵酶的反饋?zhàn)饔茫?2) 切斷或弱化支路代謝途徑；(3) 修飾轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；(4) 增強(qiáng)輔助因子的供應(yīng)(表2)。

2.1 解除代謝物對(duì)關(guān)鍵酶的反饋?zhàn)饔?/h3>

天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸脫氫酶及乙酰羥基酸合成酶是L-異亮氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶,受相應(yīng)代謝物的反饋抑制或(和)反饋?zhàn)瓒?。故欲過量積累L-異亮氨酸,首先應(yīng)解除代謝物對(duì)關(guān)鍵酶的反饋?zhàn)饔?以疏通其合成代謝流。

表2 L-異亮氨酸代謝途徑改造策略匯總Table 2 Summary of L-isoleucine metabolic pathway modification strategies

天冬氨酸激酶受L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制,1 mmolL-蘇氨酸可抑制酶活力41%、1 mmolL-賴氨酸可抑制酶活力45%,當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)可抑制酶活力82%[9]。lysC突變體(lysCA279T)可解除該反饋抑制作用,過表達(dá)突變體可使L-蘇氨酸的產(chǎn)量增加80%[9]。此外,亦有文獻(xiàn)報(bào)道通過減弱L-賴氨酸的積累部分解除其對(duì)天冬氨酸激酶的反饋抑制作用[20]。高絲氨酸脫氫酶受L-蘇氨酸反饋抑制,目前已報(bào)道多個(gè)解除該反饋抑制作用的高絲氨酸脫氫酶突變體。如homG378S和homG378E均可不同程度地解除反饋抑制作用,過表達(dá)homG378S和homG378E使L-蘇氨酸產(chǎn)量由0.09 g/L和0 g/L分別提高至3.62 g/L和4.6 g/L[9,20]。WANG等[21]利用L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicumYILW 過表達(dá)來源于大腸桿菌解除反饋抑制作用的thrABC操縱子后,L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到13.8 g/L,提高5.3%。GUILLOUET等[22]通過過表達(dá)解除反饋抑制的高絲氨酸激酶和蘇氨酸脫氫酶使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到2.2 g/L,提高5倍。

蘇氨酸脫氫酶受L-異亮氨酸的反饋抑制,目前已報(bào)道的多個(gè)突變體ilvAV140M、ilvAF383A、ilvAV140M/F383A均可不同程度地解除其反饋抑制,過表達(dá)這些突變體可使L-異亮氨酸產(chǎn)量(0.55、0.63和0.73 g/L)分別提高17%、34%、55.3%[16]。過表達(dá)ilvAV323A突變體使L-異亮氨酸提高到1.18 g/L[20]。此外,異源表達(dá)蘇氨酸脫氫酶也可解除L-異亮氨酸的反饋抑制作用。GUILLOUET等[23]在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)來源于大腸桿菌tdcB基因,當(dāng)反應(yīng)體系中L-異亮氨酸濃度達(dá)到26.2 g/L時(shí)仍保留60%的初始酶活,L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到2.5 g/L,較出發(fā)菌株提高50倍。

乙酰羥基酸合成酶受L-異亮氨酸反饋抑制作用,已發(fā)現(xiàn)的突變體ilvBNI47Y和ilvBNP176S/D426E/L575 W均可不同程度地解除其反饋抑制作用。過表達(dá)ilvBNI47Y和ilvBNP176S/D426E/L575 W可使L-異亮氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到22.7和4.17 g/L,提高10%和67.5%[24-25]。

2.2 切斷或弱化支路代謝途徑

天冬氨酸族氨基酸生物合成途徑中,代謝流在經(jīng)天冬氨酸-β-半醛和L-高絲氨酸后分別流向L-賴氨酸和L-甲硫氨酸等分支途徑。切斷或弱化L-賴氨酸和L-甲硫氨酸等分支途徑,可有效提高L-異亮氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率并降低副產(chǎn)物的積累。敲除L-丙氨酸合成基因alaT可降低L-丙氨酸的積累并促使丙酮酸流向草酰乙酸。WANG等[21]敲除該基因使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到15.4 g/L,提高17.6%,L-丙氨酸濃度有所降低[24]。ZHANG等[24]敲除該基因L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到18.8 g/L,提高1.6%。DONG等[26]敲除二氫二醇脫氫酶編碼基因ddh后使得L-賴氨酸積累量降低30%,L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)3.81 g/L,提高8%。

2.3 修飾轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

當(dāng)胞內(nèi)L-異亮氨酸積累達(dá)到一定濃度后,由輸出載體運(yùn)輸至胞外。L-異亮氨酸合成的最后一步轉(zhuǎn)氨反應(yīng)為可逆反應(yīng),因此將積累的L-異亮氨酸及時(shí)輸出可促進(jìn)該轉(zhuǎn)氨反應(yīng),并可解除其對(duì)關(guān)鍵酶的反饋抑制作用[27]。此外,攝入載體BrnQ可將胞外的L-異亮氨酸運(yùn)輸至胞內(nèi),不利于其高效積累[19]。

YIN等[28]通過在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Lrp和輸出載體BrnFE編碼基因使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到26.9 g/L,增加63%。XIE等[29]過表達(dá)brnFE使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到25.9 g/L,提高24.9%,在此基礎(chǔ)上敲除攝入載體編碼基因brnQ使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到29.0 g/L,提高28%。然而,ZHANG等[24]敲除brnQ基因后L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到20 g/L,提高6%。PARK等[10]在大腸桿菌內(nèi)中過表達(dá)輸出載體編碼基因ygaZH,使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到1.11 g/L,較出發(fā)菌株(0.322 g/L)提高2.45倍。

另外,研究表明核糖體延伸因子(由fusA編碼)和循環(huán)因子(由frr編碼)可促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成。單獨(dú)過表達(dá)或共表達(dá)這2種因子后,L-異亮氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到10.4(過表達(dá)fusA)、10.1(過表達(dá)frr)和10.9 g/L(過表達(dá)fusA-frr),較出發(fā)菌株提高了40.5%、36.4%、47.2%[30]。

2.4 增強(qiáng)輔助因子的供應(yīng)

合成1 molL-異亮氨酸需要4 mol NADPH,該途徑中hom、asd、ilvC和ilvE等基因編碼的酶均需要NADPH作為輔酶。增加NADPH的供應(yīng)常用策略是增強(qiáng)NADPH相關(guān)合成酶的表達(dá)水平,如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(由zwf編碼)和NAD激酶(由ppnk編碼)等。SHI等[31]分別單獨(dú)過表達(dá)及共表達(dá)zwf和ppnk,發(fā)現(xiàn)均能提高胞內(nèi)NADPH的濃度和L-異亮氨酸產(chǎn)量,而二者共表達(dá)效果最佳,使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到4.10 g/L,提高85.9%。ZHANG等[24]通過過表達(dá)ppnk使得L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到21.6 g/L,提高4.9%。MA等[32]通過過表達(dá)HMP途徑關(guān)鍵酶編碼基因gnd、pgl和fbp增強(qiáng)該途徑代謝流以增加NADPH的供應(yīng),經(jīng)發(fā)酵L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到28.97 g/L,提高24.9%。

3 L-異亮氨酸衍生物的生物合成

常見L-異亮氨酸衍生物包括4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)和3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate,PHBV),目前均已實(shí)現(xiàn)其生物合成。

3.1 4-HIL的生物合成

4-HIL具有葡萄糖濃度依賴的促進(jìn)胰島素分泌的活性,對(duì)I型和II型糖尿病動(dòng)物均具有治療效果[33]。此外,4-HIL還具有增強(qiáng)肌細(xì)胞對(duì)血糖吸收、促進(jìn)脂肪代謝、降血脂以及保護(hù)肝功能等作用[34]。4-HIL生物合成是以L-異亮氨酸、α-酮戊二酸和O2為底物,由異亮氨酸羥化酶(isoleucine dioxygenase,IDO,由ido基因編碼)催化生成[35]。KIVERO等[36]將ido轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并在發(fā)酵過程中添加L-異亮氨酸,實(shí)現(xiàn)前體物添加法合成4-HIL,優(yōu)化條件下產(chǎn)量為163.0 mmol/L。SHI等[37-38]利用谷氨酸棒桿菌過表達(dá)ido,在優(yōu)化條件下經(jīng)144 h發(fā)酵,最高產(chǎn)量達(dá)到95.7 mmol/L。ZHANG等[39]在L-異亮氨酸生產(chǎn)株C.glutamicumYI內(nèi)構(gòu)建4-HIL合成途徑,通過增強(qiáng)羧化途徑和三羧酸循環(huán)代謝流,并弱化乙醛酸循環(huán)以及丙酮酸和谷氨酸合成代謝流,顯著提高了4-HIL的產(chǎn)量。同時(shí),采用基于L-異亮氨酸濃度的α-酮戊二酸脫氫酶活性動(dòng)態(tài)調(diào)控策略調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)代謝流量,實(shí)現(xiàn)了α-酮戊二酸和L-異亮氨酸代謝的動(dòng)態(tài)平衡以及4-HIL的高效合成。經(jīng)64 h發(fā)酵后4-HIL產(chǎn)量、單位菌體產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率及發(fā)酵強(qiáng)度分別達(dá)到34.21 g/L、1.87 g/g DCW、15%和0.53 g/(L·h)。

3.2 PHBV的生物合成

PHBV由3-羥基戊酸輔酶A和3-羥基丁酸輔酶A縮合而成,具有短時(shí)間內(nèi)可降解性,被公認(rèn)為“綠色塑料”。其中3-羥基戊酸輔酶A前體物丙酰輔酶A主要來源于L-異亮氨酸合成前體α-酮基丁酸[40]。MA等[41]通過在L-異亮氨酸生產(chǎn)菌C.glutamicumWM001中表達(dá)關(guān)鍵酶編碼基因phaA、phaB和phaC構(gòu)建了PHBV合成途徑。獲得的重組菌株WM001/pDXW-8-phaCAB實(shí)現(xiàn)L-異亮氨酸和PHBV聯(lián)產(chǎn),產(chǎn)量分別為15和29.8 g/L。

4 展望

L-異亮氨酸作為8種必需氨基酸之一,在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,其衍生物種類和應(yīng)用也在不斷拓展。盡管L-異亮氨酸已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn),但與L-色氨酸等必需氨基酸相比成本較高,限制了其在飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用。究其原因主要是菌種產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率低、發(fā)酵周期長(zhǎng)、菌株遺傳穩(wěn)定性差、發(fā)酵過程控制精細(xì)程度不高等問題。針對(duì)上述問題,今后的工作應(yīng)聚焦于以下方面：(1) 采用適應(yīng)性進(jìn)化或常壓室溫等離子體誘變結(jié)合高通量篩選等技術(shù),選育穩(wěn)定性和環(huán)境耐受性強(qiáng)等性狀優(yōu)良的底盤細(xì)胞；(2) 基于多組學(xué)手段分析L-異亮氨酸代謝流量,根據(jù)系統(tǒng)生物學(xué)及合成生物學(xué)理論和技術(shù),篩選解除反饋抑制且活性無損失或低損失的關(guān)鍵酶突變體,挖掘和運(yùn)用底物或(中間)產(chǎn)物偶聯(lián)的基因回路動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)酸和生長(zhǎng)的平衡；(3) 基于代謝流定量分析,結(jié)合生產(chǎn)菌株代謝特性,進(jìn)一步挖掘影響L-異亮氨酸合成的限制因子,優(yōu)化L-異亮氨酸發(fā)酵條件和過程控制,同時(shí)深入了解L-異亮氨酸發(fā)酵參數(shù)和生理狀態(tài)的聯(lián)系,實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的智能控制,提高發(fā)酵的穩(wěn)定性。