生物法合成4-羥基異亮氨酸的代謝工程研究進展

李洋,張穩(wěn)杰,韓雨辰,翟懿雪,張成林

(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine)為L-異亮氨酸的羥化物,是一種非蛋白質氨基酸,最早發(fā)現于胡蘆巴種子中[1]。研究表明4-羥基異亮氨酸具有血糖濃度依賴的促進胰島素分泌的活性,且可增強受體對胰島素的敏感性；同時,4-羥基異亮氨酸還具有促進肌細胞對血糖吸收、加速脂肪代謝、降血脂和保護肝功能的作用[2-4]。作為有效預防和治療Ⅱ型糖尿病及肥胖癥的理想潛在藥物,4-羥基異亮氨酸具有廣泛的應用前景和市場需求[5]。本文總結了4-羥基異亮氨酸的功能和合成方法,重點綜述了生物法合成4-羥基異亮氨酸的代謝工程策略。

1 4-羥基異亮氨酸的生物學功能

研究人員已發(fā)現8種構型的4-羥基異亮氨酸,但僅(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸具有生物學活性[1]。SAUVAIRE等[6]研究表明,4-羥基異亮氨酸在小鼠體外和體內均可促進胰島素分泌,且4-羥基異亮氨酸的促胰島素分泌作用具有血糖濃度依賴的特性：在低(3 mmol/L)或正常(5 mmol/L)血糖濃度下,4-羥基異亮氨酸沒有明顯的促胰島素分泌作用；而在高血糖濃度下(6.6～16.7 mmol/L),4-羥基異亮氨酸顯著促進胰島素分泌,且與血糖濃度呈正相關趨勢。MASIELLO等[7]研究發(fā)現,注射了4-羥基異亮氨酸的II型糖尿病病鼠干細胞和肌細胞吸收利用血糖的速率明顯增加。MAURYA等[8]發(fā)現4-羥基異亮氨酸能夠有效提高胞內葡萄糖轉運蛋白的表達水平。SHARMA等[9]報道胡蘆巴種子能夠改善血脂異常,飼喂4-羥基異亮氨酸的小鼠甘油三酯、總膽固醇、甘油和游離脂肪酸的濃度明顯下降。近年來研究發(fā)現,4-羥基異亮氨酸能夠調控脂類代謝相關基因,還可緩解代謝綜合癥及巨噬細胞相關的慢性炎癥[3-4]。目前尚未發(fā)現4-羥基異亮氨酸對機體產生副作用[6]?；谏鲜鎏匦?4-羥基異亮氨酸被視為治療糖尿病、高血脂和肥胖的潛在藥物。

2 4-羥基異亮氨酸的生產

4-羥基異亮氨酸目前主要的生產方法有種子提取法、化學合成法、化學-酶法、酶法、微生物轉化法和發(fā)酵法。

2.1 種子提取法

胡蘆巴種子中4-羥基異亮氨酸占總氨基酸的80%,且有效構型(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸約占90%[1,10]。目前僅有提取分離法用于工業(yè)化生產4-羥基異亮氨酸。FOWDEN等[1]首次從胡蘆巴種子中分離得到4-羥基異亮氨酸,其分離方法如下：用20%乙醇浸提胡蘆巴種子,浸提液經Zeokarb 225柱(100 cm×10 cm,H+-型)分離并用氨水洗脫后獲得氨基酸組分；洗脫液經真空濃縮后再用Dowex 50×8柱(100 cm×5 cm,H+-型)分離、氨水洗脫,洗脫液經濃縮結晶后獲得4-羥基異亮氨酸粗品,其收率僅為0.091%。SAUVAIRE等[11]采用70%乙醇浸提-Amberlite IR 120 H+-型柱分離-氨水洗脫-薄層析分離-氯仿/甲醇/水洗脫-結晶的方法將總收率提升至0.6%。李玉山[12]進一步簡化提取工藝,得到了純度為40%的4-羥基異亮氨酸粗品,收率為0.32%。盡管提取法是目前工業(yè)化生產4-羥基異亮氨酸的主要手段,但存在原材料需求量大、分離純化困難、提取率低(0.091%～0.6%)、成本高等不足。

2.2 化學合成法

化學法以葡萄糖、薄荷酮或α-甲基乙酰乙酸乙酯等為原料經多步化學反應生成4-羥基異亮氨酸。BEN-ISHAI等[13]首次報道了利用化學法合成4-羥基異亮氨酸,該方法以α-甲基乙酰乙酸乙酯和α-羥基苯甲酰氨基乙酸為底物先制備4-羥基異亮氨酸內酯,然后再合成4-羥基異亮氨酸。GULL等[14]在合成高絲氨酸的過程中,通過手性甘氨酸陰離子的等價物(雜環(huán)中間體)和環(huán)氧丁烷的不對稱反應得到(3R,4R,5R)-和(3R,4S,5S)-4-羥基異亮氨酸內酯異構體的混合物(97.5∶2.5),總收率24%。INGHARDT等[15]利用三甲基鋁連續(xù)誘發(fā)的芐基-2,3-脫水-4-O-叔丁基二甲基硅-γ-L-吡喃核糖苷的環(huán)氧和吡喃糖苷開環(huán)反應,合成了4-羥基異亮氨酸的兩種對映異構體,(2S,3R,4R)-4-羥基異亮氨酸和(2S,3R,4R)-4-羥基異亮氨酸及相應的內酯。陳平等[16]對條件進行系統(tǒng)優(yōu)化,包括對甲氧基苯胺和乙醛酸乙酯依次經縮合、(S)-脯氨酸催化不對稱Mannich反應和1,8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一烷-7-烯不對稱轉化制得(2S,3R)-2-(4-甲氧基苯胺基)-3-甲基-4-氧代戊酸乙酯,再經硝酸鈰銨氧化脫保護、硼氫化鈉還原和氫氧化鋰水解得(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸,總收率約達到30%?？傮w而言,化學法分離困難、收率低(21%～30%),因此仍停留在實驗室階段。

2.3 化學-酶法及酶法

化學-酶法首先采用化學法合成4-羥基異亮氨酸前體物,然后再通過酶法合成4-羥基異亮氨酸。WANG等[17]首次報道了通過化學-酶合成法合成4-羥基異亮氨酸：先采用化學法合成2-甲基乙酰乙酸乙酯,然后利用白地霉(Geotrichumcandidum)生物轉化生成4-羥基異亮氨酸,總反應共8步,總收率為39%。FULCRAND等[18]先采用化學法合成N-苯基乙酰內酯,再利用環(huán)氧樹脂固化的青霉素?；复呋?-羥基異亮氨酸,總反應共6步,總收率為38%。SMIRNOV等[19]報道了2步法合成4-羥基異亮氨酸,使用乙醛和α-酮丁酸在醛縮酶的作用下進行醛縮反應,其產物在分支鏈氨基酸轉氨酶的作用下合成4-羥基異亮氨酸,盡管該方法大大簡化了提取步驟,但是底物α-酮丁酸的轉化率僅為4.3%。

SHI等[20]通過特異性位點突變的方法改造了短鏈脫氫酶/還原酶家族的4-羥基異亮氨酸脫氫酶,使其能夠特異性催化(2S,3R)-2-氨基-3-甲基-4-酮戊二酸生成4-羥基異亮氨酸,其中(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸的純度可達99.1%。酶法可特異性生成(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸,解決了化學法和化學-酶法產生4-羥基異亮氨酸構型較多的問題。然而,該方法所用底物(2S,3R)-2-氨基-3-甲基-4-酮戊二酸不易獲取致使生產成本高。

2.4 生物法

生物法合成4-羥基異亮氨酸是在發(fā)現L-異亮氨酸雙加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)的基礎發(fā)展起來的,根據是否添加底物L-異亮氨酸和(或)α-酮戊二酸可分為微生物轉化法和發(fā)酵法。HAEFELé等[21]在胡蘆巴種子破碎液中發(fā)現能夠將L-異亮氨酸轉化為(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸的活性組分,但至今未見后續(xù)研究報道。KODERA等[22]首次于蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis2e2 AKU 0251中發(fā)現了IDO,該酶能夠特異性催化L-異亮氨酸合成(2S,3R,4S)-4-羥基異亮氨酸(圖1)；并證實其屬于α-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶家族。

圖1 IDO 催化生成 4-羥基異亮氨酸的反應

KIVERO等[23]將上述IDO編碼基因ido轉化至大腸桿菌,通過在發(fā)酵過程中添加前體物L-異亮氨酸實現轉化法合成4-羥基異亮氨酸,在優(yōu)化條件下產量達到24.0 g/L,但該方法存在L-異亮氨酸被額外消耗及耗糖高等不足。SHI等[24-26]利用谷氨酸棒桿菌過表達ido,在添加α-酮戊二酸并優(yōu)化條件下經144 h發(fā)酵,最高產量達到14.1 g/L。張成林等[27]從蘇云金芽孢桿菌B.thuringiensisTCCC 11826中克隆出ido(Accession No.KC884243),其編碼的IDO氨基酸序列與KODERA報道的IDO相似性為97.91%,Km和Vmax分別為0.18 mmol/L和2.10 μmol/(min·mg),催化效率略高于后者；在此基礎上,利用該基因分別于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌建立了微生物轉化法4-羥基異亮氨酸合成體系,4-羥基異亮氨酸產量分別達到6.6 g/L和5.3 g/L。ZHANG等[28]根據IDO偶聯(lián)異亮氨酸羥化反應和α-酮戊二酸氧化反應的特性,利用琥珀酸缺陷型菌株建立了高活性IDO的高通量篩選體系,獲得了催化效率顯著提高的IDO突變體IDOL27I/E80D/G169H/S18D；利用該突變體可催化生成22.4 g/L 4-羥基異亮氨酸,轉化率達到99.7%。為進一步提高4-羥基異亮氨酸產量和轉化效率,李英滋等[29]構建了ido表達菌株EscherichiacolipET-ido并利用該細胞建立和優(yōu)化了合成4-羥基異亮氨酸的靜息細胞催化體系,4-羥基異亮氨酸產量和轉化率分別達到36.7 g/L和99.8%。DU等[30]通過易錯PCR結合基于NADH檢測的高通量篩選方法篩選獲得突變體IDOI162T/T182 N,表達該酶的靜息細胞可將29.9 g/LL-異亮氨酸完全轉化成4-羥基異亮氨酸。

總體而言,上述方法存在周期長,需添加1～2種前體物等不足,限制了4-羥基異亮氨酸的規(guī)?；a。與之相比,直接發(fā)酵法是以葡萄糖為碳源,無需添加前體物L-異亮氨酸和α-酮戊二酸便可生成4-羥基異亮氨酸,故備受關注。TAN等[31]利用動態(tài)調控三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán),增加菌株攝氧等策略實現4-羥基異亮氨酸的直接發(fā)酵合成,經144 h培養(yǎng)可生成19.9 g/L 4-羥基異亮氨酸[31]。ZHANG等[32]于L-異亮氨酸生產菌株CorynebacteriumglutamicumYI中構建4-羥基異亮氨酸合成途徑,并通過靜態(tài)調控結合動態(tài)調控等系統(tǒng)代謝工程手段,獲得1株4-羥基異亮氨酸高產菌株HIL18,該菌株以葡萄糖前體物可生成34.2 g/L的4-羥基異亮氨酸,為已報道直接發(fā)酵法合成4-羥基異亮氨酸的最高產量。

3 4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑

目前已在蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等芽孢桿菌屬中發(fā)現IDO,表明該類細菌含有4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑[30,33]。如圖2所示,4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑以L-異亮氨酸和α-酮戊二酸為前體,由IDO催化生成。

圖2 4-羥基異亮氨酸的生物合成途徑及其代謝工程改造策略

葡萄糖進入細胞后經糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸,二者分別在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶的作用下發(fā)生羧化反應,生成草酰乙酸。草酰乙酸和乙酰輔酶A依次在檸檬酸合酶、順烏頭酸酶及異檸檬酸脫氫酶的作用下生成α-酮戊二酸,其中檸檬酸合酶或(和)異檸檬酸脫氫酶為限速酶。α-酮戊二酸可經α-酮戊二酸脫氫酶復合體催化生成琥珀酰輔酶A繼續(xù)完成TCA循環(huán),也可在谷氨酸脫氫酶的催化下生成谷氨酸,還可與谷氨酰胺經谷氨酸合酶催化生成谷氨酸[34]。

草酰乙酸在轉氨酶的作用下生成L-天冬氨酸,并由天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、蘇氨酸脫氫酶、乙酰羥基酸合成酶、二羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶和支鏈氨基酸轉氨酶催化經10步反應生成L-異亮氨酸[35-36]。生成的α-酮戊二酸和L-異亮氨酸經IDO催化,在Fe2+存在的條件下生成4-羥基異亮氨酸,同時生成CO2。

4 4-羥基異亮氨酸生產菌株代謝工程選育

目前生物合成4-羥基異亮氨酸的代謝工程研究集中于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。主要代謝工程策略包括構建合成途徑、強化L-異亮氨酸合成、重構中代謝途徑及增強輔因子合成等(表1)。

表1 4-羥基異亮氨酸生產菌株改造策略

4.1 構建4-羥基異亮氨酸合成途徑

大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌均不含ido,因此首先于菌株中表達外源ido構建4-羥基異亮氨酸合成途徑。OGAWA等[33]于大腸桿菌E.coliRosetta2(DE3)過表達了來源于B.thuringiensisATCC 35646的ido,經誘導表達后,在添加α-酮戊二酸和L-異亮氨酸的條件下可合成1.9 g/L 4-羥基異亮氨酸。SHI等[34]利用來源于B.thuringiensisYBT-1520的ido于L-異亮氨酸生產菌C.glutamicumssp.lactofermentumSN01構建了4-羥基異亮氨酸合成途徑；獲得的菌株Cgl/p4-ido經120 h搖瓶發(fā)酵產4-羥基異亮氨酸5.3 g/L,經優(yōu)化生物素的添加量4-羥基異亮氨酸產量達到9.6 g/L。ZHANG等[32]于L-異亮氨酸生產菌C.glutamicumYI中過表達經密碼子優(yōu)化的ido(來源于B.thuringiensisTCCC 11826),經搖瓶發(fā)酵48 h,獲得的菌株HIL04可產3.3 g/L 4-羥基異亮氨酸。SHI等[39]考察了18種核糖體結合位點序列對4-羥基異亮氨酸合成的影響,其產量范圍為 1.2～15.3 g/L,由此可見ido的轉錄水平對4-羥基異亮氨酸合成影響較為顯著。

4.2 強化L-異亮氨酸合成

草酰乙酸是合成L-異亮氨酸的重要前體物質。在谷氨酸棒桿菌中,草酰乙酸主要來源于由丙酮酸羧化酶(由pyc編碼)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(由ppc編碼)催化丙酮酸羧和磷酸烯醇式丙酮酸的回補途徑[35]。SHI等[25]于4-羥基異亮氨酸菌株Cgl/p4-ido過表達ppc使得4-羥基異亮氨酸產量由10.9 g/L提升至14.1 g/L。ZHANG等[32]比較了過表達pyc和ppc對4-羥基異亮氨酸合成的影響,發(fā)現二者均能顯著提升其合成效率,4-羥基異亮氨酸產量及生物量分別提高19%和31%及28.8%和42.3%,可見過表達ppc的效果優(yōu)于pyc[32]。L-蘇氨酸是合成L-異亮氨酸的直接前體物質,天冬氨酸激酶是該途徑中的關鍵酶。然而在谷氨酸棒桿菌中過表達天冬氨酸激酶編碼基因lysC抑制了4-羥基異亮氨酸的合成[25]；推測過表達lysC使L-異亮氨酸合成代謝流過強,與α-酮戊二酸合成競爭前體物草酰乙酸。草酰乙酸可由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化,生成磷酸烯醇式丙酮酸,但敲除其編碼基因pck對4-羥基異亮氨酸的合成無明顯影響[32]。丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸,故與草酰乙酸的合成競爭磷酸烯醇式丙酮酸。盡管敲除其編碼基因pyk對4-羥基異亮氨酸產量無顯著影響,但可明顯降低L-亮氨酸和L-丙氨酸等副產物積累[32]。

4.3 重構中心代謝途徑

4.3.1 中心代謝途的靜態(tài)調控

研究證明,阻斷大腸桿菌ED途徑可提高L-天冬氨酸合成,故可促進L-異亮氨酸的合成[40-41]。KIVERO等[23]敲除大腸桿菌E.coliMG1655的ED途徑關鍵基因edd和eda,卻發(fā)現4-羥基異亮氨酸產量略有下降。但在此基礎上敲除6-磷酸葡萄糖脫氫編碼基因zwf使得4-羥基異亮氨酸產量由23.0 g/L提升至24.0 g/L,耗糖降低20%[23]。

檸檬酸合酶(由gltA編碼)和異檸檬酸脫氫酶(由icd編碼)是TCA循環(huán)的關鍵酶。在谷氨酸棒桿菌中過表達gltA使4-羥基異亮氨酸產量和生物量分別提高34.7%和9.6%,L-賴氨酸等副產物降低40%以上；在此基礎上過表達icd使得4-羥基異亮氨酸產量、單位菌體產量和轉化率分別提高44.2%、30.2%和29.9%,副產物積累量進一步下降[32]。上述結果表明,過表達gltA和icd將代謝流“拉”向TCA循環(huán),從而增加α-酮戊二酸的供應[32]。乙醛酸循環(huán)與TCA循環(huán)競爭α-酮戊二酸前體物異檸檬酸,敲除其關鍵酶異檸檬酸裂解酶編碼基因aceA使得4-羥基異亮氨酸產量提高6.3%[32]。以往認為,谷氨酸棒桿菌在碳源充足的條件下乙醛酸循環(huán)并不發(fā)揮作用,該結果顯示乙醛酸循環(huán)會分配少量的代謝流。

谷氨酸脫氫酶(由gdh編碼)和α-酮戊二酸脫氫酶(在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中分別由sucAB和odhA編碼)可將α-酮戊二酸分別催化生成L-谷氨酸和琥珀酰-CoA,與IDO競爭α-酮戊二酸。敲除谷氨酸棒桿菌中gdh1顯著降低4-羥基異亮氨酸產量和菌體生物量,而敲除gdh2可使4-羥基異亮氨酸產量提高8.3%且對菌體生長無顯著影響[32]。該結果提示谷氨酸棒桿菌2個谷氨酸脫氫酶中,GDH1發(fā)揮更大的作用。由于IDO合成4-羥基異亮氨酸的同時還生成琥珀酸,故該酶能夠重新連接ΔsucAB菌株中阻斷的TCA循環(huán)。SMIRNOV等敲除大腸桿菌E.coliMG1655 的aceA和sucAB并過表達ido,從而將菌體生長與4-羥基異亮氨酸耦聯(lián)起來,在添加13.2 g/LL-異亮氨酸的條件下合成12.1 g/L 4-羥基異亮氨酸[22]。然而將該策略應用于谷氨酸棒桿菌時,4-羥基異亮氨酸產量和菌體生物量顯著下降,推測可能發(fā)酵前期IDO活性或L-異亮氨酸合成不足致使生成的琥珀酸難以滿足菌體生長[32]。在谷氨酸棒桿菌中,抑制蛋白OdhI與α-酮戊二酸脫氫酶結合后通過改變其構象抑制其活性。但OdhI被絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknG磷酸化后無抑制作用[42]。敲除pknG使得4-羥基異亮氨酸產量由6.5 g/L提升至12.4 g/L,但仍有11.2 g/LL-異亮氨酸殘留[26]。

4.3.2 中心代謝途的動態(tài)調控

由圖2可知,4-羥基異亮氨酸的生物合成均涵蓋中心代謝、分支代謝以及能量和輔酶代謝等多個代謝途徑。這些代謝途徑常因競爭共同前體物導致代謝流分配失衡,致使4-羥基異亮氨酸難以高效積累且前體物L-異亮氨酸大量殘留[26,32]。近年來了報道的動態(tài)調控策略有效地協(xié)調了菌體生長和4-羥基異亮氨酸的高效合成。

L-異亮氨酸等分支鏈氨基酸能夠介導轉錄激活因子Lrp與其輸出蛋白編碼基因brnFE啟動子的結合,從而激活brnFE的轉錄[43]。研究發(fā)現,OdhI第14位蘇氨酸突變后(T14A)不再被PknG磷酸化,故OdhIT14A一旦與α-酮戊二酸脫氫酶結合便不易解離[42]。ZHANG等[32]利用brnFE啟動子PbrnFE調控OdhIT14A編碼基因odhIA40G的轉錄,即僅當胞內有L-異亮氨酸積累時,odhIA40G的轉錄被激活,其編碼的OdhIT14A抑制α-酮戊二酸脫氫酶活性從而有更多的α-酮戊二酸用于合成4-羥基異亮氨酸。搖瓶條件下,獲得的菌株4-羥基異亮氨酸產量由4.95 g/L提升至5.36 g/L(提高8.3%)。SHI等[38]利用不同強度的PbrnFE突變體動態(tài)調控ido的表達使得4-羥基異亮氨酸產量提高6.7；當使用相同策略調控odhIA40GA43G時,4-羥基異亮氨酸產量卻下降[38]。

谷氨酸棒桿菌ilvBNC操縱子的啟動子中含弱化子,該弱化子中含L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸密碼子,當胞內有L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸積累時,ilvBNC的轉錄受到弱化調控[44]。ZHANG等[32]利用該特性,將α-酮戊二酸脫氫酶編碼基因odhA啟動子替換為PilvBNC以動態(tài)調控其轉錄：發(fā)酵前期菌體生長速率高但L-異亮氨酸合成相對較少,此時胞內外無過量L-異亮氨酸積累,α-酮戊二酸除部分用于4-羥基異亮氨酸合成外,大部分用于TCA循環(huán)(生長)；發(fā)酵中、后期菌體生長速率降低,且此時當胞內外有大量L-異亮氨酸積累,odhA轉錄被弱化,更多的α-酮戊二酸用于4-羥基異亮氨酸合成。結果顯示,所獲菌株HIL18的odhA轉錄水平與胞內L-異亮氨酸濃度呈負相關趨勢,odhA的轉錄水平逐漸下降1.5～20倍、α-酮戊二酸脫氫酶活性下降10%～64%,證明PilvBNC能夠很好地響應胞內L-異亮氨酸濃度從而動態(tài)調控α-酮戊二酸脫氫酶活性；在發(fā)酵初期即有少量4-羥基異亮氨酸積累,而對照菌株則無,發(fā)酵中期和后期4-羥基異亮氨酸合成速率顯著提升,進一步證明了PilvBNC對α-酮戊二酸脫氫酶活性的動態(tài)調控作用；同時,HIL18的4-羥基異亮氨酸產量和轉化率較對照菌株分別提高1.3倍和1.5倍,胞外L-異亮氨酸積累由10.98 g/L降低至0.62 g/L,其余副產物降低至0.5 g/L以下,表明動態(tài)調節(jié)TCA循環(huán)能夠重新分配代謝流、平衡菌體生長和4-羥基異亮氨酸的高效合成,顯著提高葡萄糖利用率[32]。綜合來看,利用OdhI抑制α-酮戊二酸脫氫酶活性的策略對4-羥基異亮氨酸產量的提升水平有限；相比而言,弱化odhA轉錄的效果更為顯著。推測原因是,OdhI對α-酮戊二酸脫氫酶活性的抑制作用是持續(xù)累加的,而odhA轉錄的弱化是隨胞內L-異亮氨酸水平動態(tài)波動的,故后者效果更佳。

4.4 其他策略

如圖2所示,合成1 molL-異亮氨酸需要4 mol NADPH,故NADPH供應被認為是L-異亮氨酸合成的限制因素。研究發(fā)現,共表達zwf和NADH激酶編碼基因pos5可使4-羥基異亮氨酸產量提高62.18%[26]。IDO催化的羥化反應需要O2,故推測菌體的攝氧能力可能影響4-羥基異亮氨酸合成。SHI等[39]過表達了來源于透明顫菌的血紅蛋白編碼基因vgb使菌株恢復生長且4-羥基異亮氨酸產量提升。

總體而言,目前利用谷氨酸棒桿菌直接發(fā)酵合成4-羥基異亮氨酸的研究較大腸桿菌深入。其主原因是,當前L-異亮氨酸生產菌均為谷氨酸棒桿菌,同時谷氨酸棒桿菌的α-酮戊二酸合成能力強,故在L-異亮氨酸生產菌的基礎上進一步增強α-酮戊二酸合成代謝流更易實現。然而從長遠來看,現有的L-異亮氨酸生產菌均經多輪誘變獲得,存在L-纈氨酸等多種營養(yǎng)物質缺陷,故對營養(yǎng)要求高、生長相對于野生型菌株緩慢。同時,誘變菌株的遺傳性狀較野生型菌株發(fā)生很大改變,且遺傳背景不夠清晰,增加了進一步代謝工程選育的難度,大幅度提升合成效率的空間有限。相比而言,大腸桿菌生長快,營養(yǎng)要求低,遺傳背景更為清晰,分子生物學工具手段更為豐富,故已成為L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-纈氨酸等多種氨基酸及其衍生物的細胞工廠。綜上,大腸桿菌更有潛力作為4-羥基異亮氨酸高效從頭的底盤細胞。

5 展望

近年來,隨著系統(tǒng)生物學、合成生物學、代謝工程以及酶工程的飛速發(fā)展,包括4-羥基異亮氨酸在內的多種高附加值氨基酸及其衍生物實現了高效生物合成。盡管如此,其合成潛力和合成效率仍有望進一步提升。今后的工作可聚焦于如下方面：(1)綜合利用生物信息學、計算生物學、酶工程等技術設計性狀優(yōu)良的關鍵酶和啟動子,并通過途徑模擬遴選出最佳候選代謝途徑；(2)整合系統(tǒng)生物學、合成生物學、代謝工程等理論和技術重構代謝網絡,優(yōu)化代謝流分布；(3)運用多組學手段及代謝流定量分析,結合生產菌株代謝特性,進一步挖掘影響產物高效合成的限制因素,優(yōu)化代謝途徑和發(fā)酵條件。